Analyse des modèles de motilité du stentor pendant et après la régénération de l’appareil buccal à l’aide du suivi cellulaire

Résumé

Nous présentons un protocole pour la caractérisation de la motilité et du comportement d’une population de cellules de taille cent microns à millimètres en utilisant la microscopie à fond clair et le suivi cellulaire. Ce test révèle que Stentor coeruleus passe par quatre phases comportementalement distinctes lors de la régénération d’un appareil buccal perdu.

Résumé

Stentor coeruleus est un organisme modèle bien connu pour l’étude de la régénération unicellulaire. L’analyse transcriptomique de cellules individuelles a révélé des centaines de gènes – dont beaucoup ne sont pas associés à l’appareil buccal (OA) – qui sont régulés différemment par phases tout au long du processus de régénération. On a émis l’hypothèse que cette réorganisation systémique et cette mobilisation des ressources cellulaires vers la croissance d’une nouvelle arthrose entraîneront des changements observables dans le mouvement et le comportement correspondant dans le temps aux phases d’expression différentielle des gènes. Cependant, la complexité morphologique de S. coeruleus a nécessité le développement d’un test pour capturer les statistiques et l’échelle de temps. Un script personnalisé a été utilisé pour suivre les cellules dans de courtes vidéos, et des statistiques ont été compilées sur une grande population (N ~ 100). Lors de la perte de l’OA, S. coeruleus perd initialement la capacité de mouvement dirigé; puis à partir de ~4 h, il présente une baisse significative de vitesse jusqu’à ~8 h. Ce test fournit un outil utile pour le dépistage des phénotypes de motilité et peut être adapté pour l’étude d’autres organismes.

Introduction

Stentor coeruleus (Stentor) est un organisme modèle bien connu qui a été utilisé pour étudier la régénération unicellulaire en raison de sa grande taille, de sa capacité à résister à plusieurs techniques microchirurgicales et de sa facilité de culture en laboratoire ^1,2,3. Les premières études de régénération se sont concentrées sur la caractéristique la plus importante et la plus morphologiquement distincte de Stentor – l’ARTH – qui est complètement éliminée lors ^{d’un choc chimique 4,5,6}. Le remplacement de novo d’une arthrose perdue commence par l’émergence d’une nouvelle bande membranellelle, un ensemble de cils qui se déplacent progressivement vers l’avant de la cellule avant de former une arthrose fonctionnelle au cours de huit stades morphologiques³. Ces étapes ont été observées séquentiellement, quelle que soit la température, et constituent un point de référence universel pour presque toutes les études⁵.

L’analyse mécaniste de la régénération stentor nécessite des outils de mesure du moment de la régénération qui sont suffisamment robustes et simples pour être appliqués à plusieurs échantillons dans le cadre d’un criblage chimique ou moléculaire. La méthode standard pour effectuer un test cellulaire est l’imagerie, dans ce cas, l’imagerie de la formation d’une nouvelle arthrose pendant la régénération. Cependant, de tels tests basés sur l’imagerie sont plus efficaces lorsque la structure régénérante contient des composants moléculaires distincts qui peuvent être utilisés comme marqueurs, de sorte qu’ils seraient facilement détectés dans une image de fluorescence. Dans le cas du Stentor OA, les composants connus (cils, corps basaux) sont également présents sur le reste de la surface cellulaire ; par conséquent, la reconnaissance de la restauration de l’accès ouvert ne peut être obtenue simplement en recherchant la présence ou l’absence d’un composant.

Au contraire, une certaine forme de reconnaissance de forme serait nécessaire pour détecter une arthrose, ce qui est potentiellement très difficile étant donné que les cellules Stentor changent souvent de forme via un processus contractile rapide. Cet article présente un test alternatif pour la régénération qui repose sur l’activité mobile du corps et des cils OA. Au fur et à mesure que l’arthrose se régénère, les cils nouvellement formés subissent des changements reproductibles de position et d’activité, ce qui affecte la motilité de nage de la cellule. En analysant la motilité, il est possible d’effectuer un test de « régénération fonctionnelle » qui quantifie la régénération en quantifiant la fonction des structures régénérées. L’analyse antérieure de la fonction ciliaire de Stentor pendant la régénération utilisait la vélocimétrie d’image de particules, combinée à des billes traceuses ajoutées au milieu externe, pour observer les changements dans le schéma d’écoulement à différents stades de la régénération⁷; cependant, cette approche nécessite une imagerie laborieuse des cellules individuelles et de leurs champs d’écoulement associés, une à la fois.

En utilisant le mouvement de la cellule elle-même comme proxy pour le flux généré par les cils, il serait possible d’analyser un plus grand nombre de cellules en parallèle, en utilisant des systèmes d’imagerie à basse résolution compatibles avec les plates-formes de criblage à haut débit. Ce test peut, en principe, être utilisé pour étudier le développement et la régénération fonctionnelle chez d’autres organismes nageurs à l’échelle des centaines de microns à millimètres. La section 1 du protocole décrit la construction d’une lame d’échantillon multipuits, qui permet l’imagerie à haut débit d’une population de cellules sur une journée entière. Des détails sont fournis sur la façon de s’ajuster pour une utilisation avec d’autres types de cellules. La section 2 du protocole couvre l’acquisition de données vidéo pour ce test, qui peut être réalisée sur un microscope à dissection avec un appareil photo reflex numérique à objectif unique. La section 3 du protocole fournit une procédure pas à pas du suivi des cellules et du calcul de la vitesse des cellules à l’aide du code MATLAB (informations supplémentaires). La section 4 du protocole explique comment transformer les résultats numériques en graphiques, comme le montrent les figures 1C-F et 2C pour faciliter l’interprétation des résultats.

Protocole

NOTE: Une population d’environ cent cellules de S. coeruleus a été cultivée conformément à un protocole JoVE⁸ publié précédemment.

1. Préparation de l’échantillon

1. Coupez un morceau de feuille d’espacement en silicone de 250 μm d’épaisseur (table des matériaux) légèrement plus petit en hauteur et en largeur qu’une lame de microscope. À l’aide d’un poinçon de trou de 5/16 », créez des puits circulaires. Veillez à laisser suffisamment d’espace entre les puits voisins pour assurer une bonne étanchéité.
   NOTE : Un espace de 3 mm entre les puits voisins s’est avéré suffisant. Avec de la pratique, dix puits peuvent être placés sur une seule lame d’échantillon.
2. Initier la régénération de l’arthrose en incubant les cellules dans 10 % de saccharose ou 2 % d’urée pendant 2 min (Figure 1A). Ensuite, laver trois fois avec du milieu frais⁸. Pipettez doucement environ dix Stentor dans chaque puits. Veillez à ce que le volume de l’échantillon corresponde le plus possible au volume du puits.
   REMARQUE : Pour les dimensions de puits utilisées ici, 12,5 μL d’échantillon ont été pipetés dans chaque puits.
3. Fermez les puits en abaissant doucement un morceau de verre de couverture (voir Tableau des matériaux) sur les puits à partir d’un bord. Utilisez un objet étroit et légèrement flexible, tel qu’une pointe de pipette de 10 μL, pour appuyer sur le verre de couverture à l’endroit où il entre en contact avec la feuille de silicone, afin d’assurer une bonne étanchéité.

2. Time-lapse de microscopie à lumière visible

1. Placez l’échantillon sur la scène du microscope et réglez le grossissement au plus bas disponible de sorte que l’un d’eux tienne bien dans le cadre dans son intégralité.
   REMARQUE: Un adaptateur de caméra 1,6x et un grossissement 1x sur l’objectif ont été utilisés sur le microscope pour ce protocole.
2. Commencez le time-lapse. Acquérir une vidéo de 10 s à 30 images par seconde de chaque puits à chaque point temporel. Si vous utilisez une configuration de microscope avec un étage X-Y motorisé, automatisez l’ensemble du time-lapse. Sinon, assurez-vous qu’un utilisateur est présent à chaque point temporel pour traduire manuellement l’échantillon afin d’enregistrer chaque puits.
   REMARQUE: Évitez de laisser l’échantillon éclairé lorsque vous n’imaginez pas pour éviter le chauffage et l’évaporation. Les volumes d’échantillons sont faibles et l’évaporation entraînera des bulles d’air.
3. Enregistrez les films au format TIFF, MOV ou AVI.
   REMARQUE: Ce sont les types de fichiers vidéo non propriétaires les plus courants. Selon le logiciel de microscope spécifique, les vidéos peuvent être enregistrées par défaut dans un type de fichier propriétaire, mais peuvent ensuite être exportées vers l’un des types de fichiers susmentionnés.
4. Utilisez un facteur de conversion pixel-millimètre pour l’échelle physique et effectuez un étalonnage ou utilisez la taille de pixel connue de la caméra utilisée. Pour calibrer, obtenez une image claire d’une diapositive d’étalonnage ou d’une règle claire avec les mêmes paramètres de grossissement que les vidéos. À l’aide de n’importe quel programme de visualisation d’images, comptez le nombre de pixels entre les marques d’une distance physique connue.
   REMARQUE: Par exemple, si l’image d’une règle montre la marque de 1 mm et la marque de 2 mm à séparer par 100 pixels, le facteur de conversion est de 1 mm pour 100 pixels. Alternativement, pour dériver ce facteur de la taille des pixels de l’appareil photo, il suffit de multiplier la taille du pixel de l’appareil photo par le grossissement. Par exemple, si l’appareil photo utilisé a 3,45 μm de pixels et que le grossissement utilisé était de 1,6x, la conversion est de 3,45 μm * 1,6 = 5,52 μm par 1 pixel.

3. Suivi des cellules

1. Téléchargez les deux scripts, TrackCells.m et CleanTraces.m, dans un emplacement facile à retenir sur l’ordinateur. Si les vidéos de données ne sont pas déjà sur cet ordinateur, transférez-les sur cet ordinateur.
   REMARQUE : Les vidéos de données et les scripts n’ont pas besoin d’être dans le même dossier.
2. Organisez les vidéos de données dans des dossiers, un pour chaque point temporel. Utilisez d’abord le script TrackCells.m pour effectuer un suivi automatisé des cellules dans les vidéos de données. Ouvrez TrackCells.m et exécutez le script.
3. Choisissez Ajouter au chemin d’accès si une fenêtre contextuelle vous y invite, ce qui ne se produit généralement que lorsque le script est exécuté pour la première fois à partir d’un dossier donné. Lorsque vous y êtes invité, sélectionnez une ou plusieurs vidéos de données pour lancer le suivi, accédez aux vidéos de données (section 2). Sélectionnez plusieurs fichiers vidéo à l’aide d’un clic tout en maintenant la touche Maj enfoncée, en maintenant la touche Ctrl enfoncée ou en maintenant le bouton gauche de la souris enfoncé tout en déplaçant les fichiers pour les mettre en surbrillance.
4. Une fois satisfait de la liste des fichiers dans la case Nom de fichier: en bas de la fenêtre d’invite, cliquez sur Ouvrir. Effectuez d’abord un test sur une vidéo pour confirmer que tous les paramètres sont correctement définis (voir la discussion ci-dessous).
   REMARQUE: Ce script va maintenant créer un dossier pour chaque fichier vidéo choisi. Il écrira ensuite dans ce dossier chaque image de la vidéo sous forme de fichier .jpg et un fichier nommé position_estimates.mat, qui contient toutes les traces trouvées dans la vidéo. Selon la taille des vidéos, le nombre de vidéos et la vitesse de l’ordinateur, l’exécution de ce script peut prendre des heures.

4. Vérification des traces

1. Vérifiez que les étapes décrites à la section 3 ont été suivies correctement en vérifiant qu’il n’y a pas de messages d’erreur avant de continuer. Utilisez le script CleanTraces.m pour rejeter manuellement les traces anormales ou fausses. Ouvrez CleanTraces.m dans la fenêtre de l’éditeur MATLAB en double-cliquant sur le fichier.
2. À l’invite , sélectionnez la sortie du dossier de données par TrackCells.m. Il aura le même nom que le fichier vidéo, accédez à l’un des dossiers créés comme décrit dans la section 3. Choisissez un seul dossier.
   REMARQUE : Ce script affichera désormais les traces une par une dans une fenêtre contextuelle. Ils sont superposés sur l’image de la vidéo où commence la trace, en vert, et sur l’image de la vidéo où la trace se termine, en magenta. Par conséquent, une trace valide devrait lier une cellule verte et une cellule magenta.
3. Lorsque vous y êtes invité, entrez 1 pour conserver la trace et 0 pour rejeter la trace. Appuyez sur Entrée pour passer à la trace suivante.
   REMARQUE : Les nouvelles traces continueront de s’afficher jusqu’à ce qu’il n’y ait plus de traces ou que les soixante premières aient été affichées. Une fois ce processus terminé, le script crée automatiquement un dossier nommé CLEAN TRACES pour enregistrer les sorties et affiche toutes les traces restantes au-dessus de la première image de la vidéo (Figure 1B). Cette image est automatiquement enregistrée en tant que LabeledTraces.png pour référence ultérieure. Toutes les traces que l’utilisateur avait choisi de conserver seront enregistrées dans le fichier clean_traces.mat.
4. Terminez cette étape pour toutes les vidéos en un seul point temporel avant de continuer.
   NOTE: Pour les données de ce manuscrit, une vidéo a été acquise pour chaque puits à chaque point temporel, pour un total de dix vidéos par point temporel.

5. Visualisation des données

REMARQUE : Pour comparer visuellement la motilité de l’ensemble de la population cellulaire à différents points temporels, toutes les traces de la section 4 ont été traduites pour commencer à l’origine et créer un déplacement radial par rapport au diagramme temporel pour chaque point temporel (Figure 1C-F, voir la figure supplémentaire S1 pour tous les points temporels).

1. Commencez par télécharger le script intitulé SpaghettiPlots.m. Ouvrez et exécutez le script. Lorsqu’une fenêtre de navigateur de fichiers s’affiche avec l’invite Sélectionner le dossier temporel contenant les données de puits (clean_traces.mat) à représenter graphiquement, accédez au dossier de l’un des points temporels. Notez que ce dossier doit contenir un dossier pour chacune des vidéos analysées.
2. Lorsque vous êtes invité à Calibration : Quel est le nombre de pixels par millimètre ?, tapez la valeur d’étalonnage trouvée à l’étape 2.4, puis appuyez sur Entrée.
   REMARQUE: Le script va maintenant combiner les traces de toutes les vidéos analysées à ce point temporel en un seul tracé (Figure 1C-F). De faibles cercles pointillés dans le tracé indiquent des déplacements radiaux de 1, 2, 3 et 4 mm.
3. Ajustez les axes du tracé si nécessaire en modifiant la ligne 55 du script, qui par défaut, est définie sur rr = 4 pour inclure un rayon allant jusqu’à 4 mm. Enregistrez le tracé.

Résultats

L’objectif de ce test est de quantifier le changement progressif des schémas de mouvement et l’augmentation progressive de la vitesse de mouvement des cellules au sein d’une grande population de stentors régénérants (N ~ 100). Pour faciliter l’interprétation des résultats, le code personnalisé inclus dans ce protocole génère deux types de tracés : une superposition de toutes les traces de mouvement des cellules dans un ensemble de données vidéo (Figure 1C-F<...

Discussion

De nombreux algorithmes de suivi des particules et des cellules existent actuellement, certains entièrement gratuits. Le coût et la convivialité sont souvent des compromis qui nécessitent des compromis. De plus, de nombreux programmes de suivi cellulaire existants sont conçus pour suivre le mouvement lent des cellules de culture tissulaire, plutôt que le mouvement de nage rapide de Stentor, qui tourne pendant la natation et peut subir des changements soudains de direction. Après avoir testé bon nombre de ces opt...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Feuille de silicone de 0,25 mm d’épaisseur	Grace Bio-Labs	CWS-S-0.25
24 x 50 mm, verre de protection #1.5	Fisher Scientific	NC1034527	Comme indiqué dans la discussion, un verre de protection plus petit peut être utilisé si moins de puits d’échantillon sont placés sur une lame.
Caméra			Nous avons utilisé Nikon D750
Chlamydomonas 137c WT souche	Chlamydomonas Resource Center	CC-125
MATLAB	MATHWORKS
MATLAB Image Processing Toolbox	MATHWORKS		nécessaire pour TrackCells.m et CleanTraces.m