Un protocole d’extraction de l’ADN des moustiques à base de perles magnétiques pour le séquençage de nouvelle génération

Résumé

Décrit ici est un protocole d’extraction d’ADN utilisant des perles magnétiques pour produire des extractions d’ADN de haute qualité à partir de moustiques. Ces extractions conviennent à une approche de séquençage de nouvelle génération en aval.

Résumé

Un protocole d’extraction de l’ADN récemment publié à l’aide de billes magnétiques et d’un instrument automatisé d’extraction de l’ADN suggère qu’il est possible d’extraire de l’ADN de haute qualité et en quantité d’un moustique individuel bien préservé suffisant pour le séquençage du génome entier en aval. Cependant, le recours à un instrument automatisé coûteux d’extraction de l’ADN peut être prohibitif pour de nombreux laboratoires. Ici, l’étude fournit un protocole d’extraction d’ADN à base de perles magnétiques économique, qui convient à un débit faible à moyen. Le protocole décrit ici a été testé avec succès à l’aide d’échantillons individuels de moustiques Aedes aegypti. La réduction des coûts associés à l’extraction de l’ADN de haute qualité augmentera l’application du séquençage à haut débit aux laboratoires et aux études aux ressources limitées.

Introduction

Le développement récent d’un protocole d’extraction d’ADN amélioré¹ a permis de nombreuses études en aval à fort impact impliquant le séquençage du génome entier^2,3,4,5,6. Ce protocole d’extraction d’ADN à base de perles magnétiques fournit un rendement fiable en ADN à partir d’échantillons individuels de moustiques, ce qui réduit le coût et le temps associés à l’acquisition d’un nombre suffisant d’échantillons provenant de collections sur le terrain.

Les ....

Protocole

1. Entreposage général des échantillons et préparations avant l’extraction de l’ADN

1. Hydrater l’échantillon dans de l’eau de qualité PCR de 100 μL pendant 1 h (ou pendant la nuit) à 4 °C si l’échantillon a été conservé dans de l’alcool de >70 % pour adoucir le tissu.

2. Perturbation de l’échantillon

1. Réglez un incubateur ou un bloc chauffant secouant à 56 °C.
2. Faire de la protéinase K (PK) tampon/mélange d’enzymes. 2 μL de protéinase K (100 mg/mL) et 98 μL de tampon protéinase K (total 100 μL) sont nécessaires pour chaque extraction individuelle du moustique. Pour préparer un mélange maître pour plusieurs sp....

Résultats

Le rendement moyen en ADN par tissu de tête/thorax de moustique était de 4,121 ng/μL (N = 92, écart-type de 3,513) mesuré à l’aide d’un fluoromètre lorsqu’il était élué à l’aide de 100 μL de tampon d’élution. Ceci est suffisant pour les besoins d’entrée d’ADN génomique de 10 à 30 ng nécessaires à la construction de la bibliothèque de génomes^{entiers 1,7.} La quantité d’ADN peut varier entre 0,3 et 29,7 ng/μL selon la taille corporelle du moustique et les conditions.......

Discussion

Le protocole décrit ici peut être adapté à d’autres espèces d’insectes. La version originale du protocole introduit dans Nieman et al.¹ a été testée sur plusieurs espèces, y compris Aedes aegypti, Ae. busckii, Ae. taeniorhynchus, Anopheles arabiensis, An. coluzzii, An. coustani, An. darlingi, An. funestus, An. gambiae, An. quadriannulatus, An. rufipes, Culex pipiens, Cx. quinquefasciatus, Cx. theileri, Drosophila suzukii, Chrysomela aeneicollis Tuta absoluta, et Keiferia lycopersicell.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
AE Buffer	Qiagen	19077	Tampon d’élution
AL Buffer	Qiagen	19075	Tampon de lyse
AW1 Buffer	Qiagen	19081	Tampon de lavage 1
AW2 Buffer	Qiagen	19072	Tampon de lavage 2
MagAttract Suspension G	Qiagen	1026901	à billes
magnétiques Séparateur de billes magnétiques	Epigentek	Q10002-1
Nanodrop	ThermoFisher	ND-2000	spectrophotomètre de microvolume
Tampon PK Tampon	ThermoFisher	4489111	Proteinase K
ThermoFisher K	ThermoFisher	A25561
Qubit	Invitrogen	Q33238	fluorimètre