L’article présente le dispositif μTongue (microfluidique sur langue) pour l’imagerie fonctionnelle des cellules gustatives in vivo en intégrant la microfluidique dans une fenêtre d’imagerie intravitale sur la langue.
Un abonnement JoVE est requis pour visualiser ce contenu. Connectez-vous ou commencez votre période d'essai gratuite.
Article de méthode
μTongue : une plateforme d’imagerie fonctionnelle basée sur la microfluidique pour la langue in vivo
Dans cet article
Résumé
Résumé
La microscopie à fluorescence intravitale est un outil largement utilisé pour étudier la dynamique multicellulaire chez un animal vivant. Cependant, il n’a pas été utilisé avec succès dans l’organe sensoriel du goût. En intégrant la microfluidique dans la fenêtre d’imagerie intravitale de la langue, le μTongue fournit des images fonctionnelles fiables des cellules gustatives in vivo sous exposition contrôlée à de multiples tastants. Dans cet article, une procédure détaillée étape par étape pour utiliser le système μTongue est présentée. Il y a cinq sous-sections : préparation de solutions tastantes, mise en place d’un module microfluidique, montage d’échantillons, acquisition de données d’images fonctionnelles et analyse de données. Quelques conseils et techniques pour résoudre les problèmes pratiques qui peuvent survenir lors de l’utilisation de la μTongue sont également présentés.
Introduction
Le microscope à fluorescence intravitale est largement utilisé pour étudier la dynamique spatio-temporelle sur les tissus vivants. Les chercheurs développent rapidement des capteurs génétiquement codés qui fournissent des transformations spécifiques et sensibles des processus biologiques en signaux de fluorescence - qui peuvent être enregistrés facilement à l’aide de microscopes à fluorescence largement disponibles1,2. Bien que la plupart des organes internes chez les rongeurs aient été étudiés au microscope, son application réussie sur la langue n’a pas encore été couronnée de succès3.....
Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.
Protocole
Toutes les interventions chirurgicales ont été approuvées par l’Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) de l’Université Sungkyunkwan et de l’Université nationale de Séoul.
1. Préparation des solutions: salive artificielle et tastants
- Préparer la salive artificielle en dissolvant 2 mM NaCl, 5 mM KCl, 3 mM NaHCO3, 3 mM KHCO3, 0,25 mM CaCl2, 0,25 mM MgCl2, 0,12 mM K2HPO4, 0,12 mM KH2PO4, et 1,8 mM HCl dans de l’eau distillée (>1 L), et ajuster le pH de la solution à 7 (voir tableau des matériaux)12
Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.
Résultats
La souris Pirt-GCaMP6f-tdTomato a été utilisée pour obtenir une image de papille gustative. La surface de la langue de la souris était recouverte de papilles filiformes autofluorescentes. Les papilles gustatives sont éparpillées sur la surface de la langue (Figure 4A). Les images de la papille gustative et de sa structure ont été acquises à l’aide de trois détecteurs de filtres différents. En utilisant l’ensemble de filtres 607/70 nm, le signal tdTomato des cellules gustatives a été obtenu p.......
Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.
Discussion
Décrit ici est un protocole détaillé pour appliquer μTongue à l’étude des activités fonctionnelles des cellules gustatives in vivo. Dans ce protocole, l’imagerie fonctionnelle sur les cellules gustatives à l’aide d’indicateurs de calcium génétiquement codés est effectuée. En plus de l’utilisation de souris transgéniques, la charge électrophorétique de colorants calciques (ou colorants à détection de tension) sur les cellules gustatives peut être une option alternative.
Toutes les solu.......
Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.
Déclarations de divulgation
Les auteurs déclarent des intérêts financiers concurrents : J. Han et M. Choi sont les inventeurs de la technologie brevetée μTongue décrite dans cet article, et le système μTongue est disponible dans le commerce via SciTech Korea.
Remerciements
Ce travail a été soutenu par l’Institut des sciences fondamentales (IBS-R015-D1), la subvention de la National Research Foundation of Korea (NRF) financée par le gouvernement coréen (MSIT) (n° 2019M3A9E2061789) et par la subvention de la National Research Foundation of Korea (NRF) financée par le gouvernement coréen (MSIT) (n° 2019M3E5D2A01058329). Nous sommes reconnaissants à Eunsoo Kim et Eugene Lee pour leur assistance technique.
....Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.
Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| acésulfame K | Sigma Aldrich | 04054-25G | Salalive artificielle / dégustation |
| solution de chlorure de calcium | Sigma Aldrich | 21115-100ML | Salive artificielle / dégustation |
| acide citrique | Sigma Aldrich | C0759-100G | Suve artificielle / dégustation |
| cycloheximide | Sigma Aldrich | 01810-5G | Savie artificielle / dégustation |
| denatonium | Sigma Aldrich | D5765-5G | Salalive artificielle / tastant |
| Colle dentaire | Denkist | P0000CJT-A2 | Préparation animale |
| Image J | NIH | ImageJ | Analyse de données |
| IMP | Sigma Aldrich | 57510-5G | Salalive artificielle / tastant |
| Adhésif instantané | Loctite Loctite | 4161, Henkel | Préparation animale |
| K2HPO4 | Sigma Aldrich | P3786-100G | Salive artificielle / dégustation |
| KCl | Sigma Aldrich | P9541-500G | Salive artificielle / dégustation |
| Kétamine | Yuhan | 50 | Préparation animale |
| KH2PO4 | Sigma Aldrich | P0662-25G | Salive artificielle / dégustation |
| KHCO3 | Sigma Aldrich | 237205-500G | Artificielle salive / tastant |
| MATLAB | Mathwork | MATLAB | Analyse de données |
| MgCl2 | Sigma Aldrich | M8266-100G | Salalive artificielle / tastant |
| MPG | Sigma Aldrich | 49601-100G | Salalive artificielle / tastant |
| Microscope Mutiphoton | Thorlab | ; Microscope Bergamo II | |
| NaCl | Sigma Aldrich | S3014-500G | Salive artificielle / dégustation |
| NaHCO3 | Sigma Aldrich | 792519-500G | Salive artificielle / dégustation |
| Objectif | Nikon | N16XLWD-PF | Microscope |
| Octaflow | ALA Scientific Instruments | OCTAFLOW II | Contrôle fluidique |
| PC | LG | Lg15N54 | Contrôle fluidique |
| PH-mètre | Thermoscientifique | ORION STAR AZ11 | Salve artificielle / dégustation |
| Saline tamponnée au phosphate | Sigma Aldrich | 806562 | Salive artificielle / dégustation |
| quinine | Sigma Aldrich | Q1125-5G | de salive artificielle / dégustation |
| Havard Apparatus | PHD ULTRA 4400 | Contrôle fluidique | |
| TRITC-dextran | Sigma Aldrich | 52194-1G | Préparation des animaux |
| Laser à fibre ultrarapide | Toptica | FFultra920 01042 | Microscope |
| Xylazine | Bayer Korea | Rompun | Préparation des animaux |
Références
- Mao, T., O'Connor, D. H., Scheuss, V., Nakai, J., Svoboda, K. Characterization and subcellular targeting of GCaMP-type genetically-encoded calcium indicators. PLoS One. 3 (3), 1-10 (2008).
- Shih, A. Y., et al.
Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.
Réimpressions et autorisations
