Article de méthode

μTongue : une plateforme d’imagerie fonctionnelle basée sur la microfluidique pour la langue in vivo

DOI :

10.3791/62361

⸱

22 avril 2021

 ,  , 
1Department of Biomedical Engineering, Sungkyunkwan University, 2Center for Neuroscience Imaging Research, Institute for Basic Science, 3School of Biological Sciences, Seoul National University

Dans cet article

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

L’article présente le dispositif μTongue (microfluidique sur langue) pour l’imagerie fonctionnelle des cellules gustatives in vivo en intégrant la microfluidique dans une fenêtre d’imagerie intravitale sur la langue.

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La microscopie à fluorescence intravitale est un outil largement utilisé pour étudier la dynamique multicellulaire chez un animal vivant. Cependant, il n’a pas été utilisé avec succès dans l’organe sensoriel du goût. En intégrant la microfluidique dans la fenêtre d’imagerie intravitale de la langue, le μTongue fournit des images fonctionnelles fiables des cellules gustatives in vivo sous exposition contrôlée à de multiples tastants. Dans cet article, une procédure détaillée étape par étape pour utiliser le système μTongue est présentée. Il y a cinq sous-sections : préparation de solutions tastantes, mise en place d’un module microfluidique, montage d’échantillons, acquisition de données d’images fonctionnelles et analyse de données. Quelques conseils et techniques pour résoudre les problèmes pratiques qui peuvent survenir lors de l’utilisation de la μTongue sont également présentés.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Le microscope à fluorescence intravitale est largement utilisé pour étudier la dynamique spatio-temporelle sur les tissus vivants. Les chercheurs développent rapidement des capteurs génétiquement codés qui fournissent des transformations spécifiques et sensibles des processus biologiques en signaux de fluorescence - qui peuvent être enregistrés facilement à l’aide de microscopes à fluorescence largement disponibles1,2. Bien que la plupart des organes internes chez les rongeurs aient été étudiés au microscope, son application réussie sur la langue n’a pas encore été couronnée de succès3.

Des études antérieures sur l’imagerie calcique des cellules gustatives ont été menées ex vivo en sectionnant finement un tissu de la langue pour obtenir des papilles gustatives circumvallates4,5,6 ou en décollant l’épithélium gustatif pour obtenir des papilles gustatives fongiformes7,8. La préparation de ces échantillons était inévitablement invasive, de sorte que les microenvironnements naturels tels que l’innervation des nerfs, les barrières de perméabilité et la circulation sanguine étaient largement perturbés. La première fenêtre d’imagerie intravitale de la langue a été rapportée en 2015 par Choi et al., mais un enregistrement fonctionnel fiable n’était pas réalisable en raison du mouvement et des artefacts optiques causés par les stimuli de tastant fluidique9.

Récemment, la microfluidique sur langue (μTongue) a été introduite10. Cet appareil intègre un système microfluidique avec une fenêtre d’imagerie sur la langue de la souris. En atteignant un flux quasi stable de stimuli tastant tout au long de la période d’imagerie, les artefacts du mouvement fluidique pourraient être minimisés (Figure 1). Le port d’entrée est alimenté par une série de régulateurs de pression multicanaux, tandis que le port de sortie est connecté à une pompe à seringue, qui maintient 0,3 mL / min. De plus, les artefacts optiques causés par la différence dans les indices de réfraction des solutions de tastant ont été minimisés par une analyse ratiométrique introduisant un indicateur insensible au calcium (tdTomato) ainsi que l’indicateur de calcium (GCaMP6)11. Cette conception a fourni une stabilité microscopique des cellules gustatives in vivo, même avec une commutation brusque entre les canaux fluidiques. Par conséquent, le μTongue met en œuvre un criblage fonctionnel fiable de plusieurs tastants aux papilles gustatives de la souris in vivo.

Dans ce protocole, les procédures expérimentales sont expliquées en détail pour l’imagerie calcique des papilles gustatives fongiformes de souris in vivo à l’aide de μTongue. Tout d’abord, la préparation de salive artificielle et de solutions savoureuses est décrite. Deuxièmement, la mise en place du système microfluidique pour atteindre le flux quasi-stable est introduite. Troisièmement, les procédures utilisées pour monter la langue de la souris sur le μTongue afin de permettre l’acquisition d’images sont délimitées. Enfin, chaque étape de l’analyse d’image, y compris la correction des artefacts de mouvement latéral et de la ratiométrie, est spécifiée. Ce protocole peut être facilement adapté à n’importe quel laboratoire de recherche avec une installation de souris et un microscope à deux photons ou un équipement équivalent.

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Protocole

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Toutes les interventions chirurgicales ont été approuvées par l’Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) de l’Université Sungkyunkwan et de l’Université nationale de Séoul.

1. Préparation des solutions: salive artificielle et tastants

  1. Préparer la salive artificielle en dissolvant 2 mM NaCl, 5 mM KCl, 3 mM NaHCO3, 3 mM KHCO3, 0,25 mM CaCl2, 0,25 mM MgCl2, 0,12 mM K2HPO4, 0,12 mM KH2PO4, et 1,8 mM HCl dans de l’eau distillée (>1 L), et ajuster le pH de la solution à 7 (voir tableau des matériaux)12.
  2. Préparer des tastants, tels que l’acide aigre: acide citrique 10 mM; salé : 400 mM de NaCl, éventuellement avec 50 μM d’amiloride ; doux: 40 mM acésulfame K; amer : mélange de 5 mM de quinine, de 5 mM de dénatonium et de cycloheximide de 20 μM, en dissolvant le produit chimique de dégustation dans la salive artificielle préparée à l’étape 1.1.

2. Préparation du système microfluidique

REMARQUE : Les tastants ont été livrés à la langue de la souris à l’aide d’un système d’administration fluidique multicanal sous pression (voir la figure 1 et le tableau des matériaux).

  1. Remplissez les réservoirs du système de perfusion à flux sous pression avec la salive artificielle et les tastants.
  2. Connectez la conduite d’air comprimé à l’entrée du régulateur et réglez la pression d’air entre 30 et 50 psi dans le système de distribution fluidique.
  3. Réglez la pression de sortie du régulateur sur 0,4 psi et vérifiez si le liquide sort du tube sous cette pression.
  4. Connectez le collecteur des réservoirs au port d’entrée de μTongue.
  5. Connectez le port de sortie de μTongue à une pompe à seringue et retirez le liquide avec ~300 μL∙min-1 pour établir l’état d’équilibre. Observez le volume constant d’une gouttelette suspendue sous la μTongue. Ajustez la valeur du paramètre de réglage en fonction de la hauteur de l’échantillon.
  6. Débranchez la conduite d’air comprimé et arrêtez la pompe à seringue jusqu’à ce que l’étape 3 du protocole soit terminée.

3. Préparation de la souris pour l’imagerie in vivo (Figure 2).

REMARQUE: Toutes les préparations animales ont été effectuées pendant la journée dans des conditions aseptiques sur un établi de laboratoire.

  1. Anesthésie de la souris
    1. Préparez une souris de 7 semaines ou plus de l’un ou l’autre sexe. Utilisez une lignée de souris génétiquement modifiée qui exprime des protéines de fluorescence détectant le calcium dans les cellules gustatives.
    2. La souris est retenue pour l’anesthésie. Un mélange de 100 mg/kg de kétamine et de 10 mg/kg de xylazine est injecté par voie intrapéritonéale chez la souris13.
  2. TriTC-dextran (500 kDa) dans une solution saline tampon phosphate à 2,5 % W/V est administré par voie intraveineuse à la souris par voie rétro-orbitale pour observer la circulation sanguine lors d’une séance d’imagerie.
  3. Fixez un fixateur de tête sur le crâne de la souris pour minimiser les artefacts de mouvement.
    1. La tête de la souris est pulvérisée avec 70% d’ETOH tandis que la souris est placée en position couchée. Soulevez légèrement la peau de la tête avec une pince et coupez environ 7 mm2 avec des ciseaux.
    2. Nettoyez les poils autour du cuir chevelu, retirez le périoste sous la peau, appliquez un adhésif instantané sur le crâne et fixez un fixateur de tête personnalisé.
    3. Une fois l’adhésif instantané durci, appliquez de la colle dentaire autour du fixateur de tête et éclairez-le avec une lumière bleue pour solidifier la colle dentaire.
  4. Placez la langue de la souris sur l’unité inférieure de μTongue.
    1. Fixez la lèvre inférieure de la souris à l’unité inférieure de μTongue avec un adhésif instantané.
    2. Placez la souris sur la carte (planche de préparation de la souris dans la figure 1B) et placez l’unité inférieure du μTongue sur les poteaux (poteau de maintien μTongue dans la figure 1B). Assurez-vous que les trous sur le bord de l’unité inférieure sont alignés sur le poteau.
    3. Serrez le fixateur de tête de souris sur le support de fixation de tête au niveau de la carte. Ensuite, ajustez la distance entre la tête de la souris et l’appareil. Faites pivoter la tête de la souris en douceur d’environ 45 ° à l’aide du support de fixation de la tête. Ce processus empêche le contact physique du nez de la souris avec l’objectif du microscope.
    4. Dessinez doucement la langue de la souris à l’aide d’une pince à épileuse en plastique et fixez la face ventrale de la langue sur la face supérieure de l’unité inférieure de la μTongue. Ensuite, essuyez la surface de la langue de la souris avec un coton-tige humide.
    5. Faites tremper un morceau de papier dans la salive artificielle et placez-le sur la surface exposée de la langue de la souris pour maintenir un état humide.
    6. Placez les rondelles incurvées sur les poteaux qui maintiennent les deux extrémités de la partie inférieure de μTongue.
  5. Placez la préparation de la souris sur la scène du microscope. Placez la langue de souris exposée sous le centre approximatif de la zone de l’objectif du microscope. Assurez-vous de ne pas vous écarter de la plage dynamique de la scène. Ensuite, serrez la planche de la souris sur la scène avec des vis.
  6. Placez le coussin chauffant sous le corps de la souris et maintenez la température à 36,5 °C-37,5 °C. Surveillez la température corporelle de la souris avec un capteur de température et contrôlez la température du coussin chauffant à l’aide d’un signal de rétroaction du capteur de température.
  7. Tournez un mince morceau de papier et placez-le à la bouche de la souris pour empêcher le liquide de pénétrer dans la trachée de la souris.
  8. Retirez le tissu humide de la langue de la souris et placez la μTongue préparée sur la langue de la souris. Placez un canal microfluidique sur la langue et ajustez sa position pour observer la surface de la langue à travers la fenêtre d’imagerie.
  9. Fixez le μTongue en vissant doucement les deux extrémités avec une pression de compression minimale.

4. Acquisition d’imagerie

  1. Allumez le laser à deux photons de 920 nm et le microscope avant utilisation.
  2. Montez l’objectif d’immersion dans l’eau (16x, NA 0,80 ou 25x, NA 1,1) sur le microscope. Déposez l’eau distillée sur la fenêtre d’imagerie du μTongue et immergez l’objectif.
  3. En mode caméra, allumez la lumière à l’aide d’une lampe au mercure et éclairez la surface de la languette.
  4. En ajustant l’axe Z, recherchez le signal autofluorescent des papilles filiformes pour trouver le plan focal approximatif. Ensuite, à l’aide du bouton de réglage X et Y, localisez une papille gustative.
  5. Passez en mode multiphoton. Définissez les conditions d’acquisition de l’image comme suit : longueur d’onde d’excitation : 920 nm ; jeu de filtres d’émission: 447/60 nm, 525/50 nm et 607/70 nm; mode de balayage raster bidirectionnel, taille de l’image: 512 x 512.
  6. Ajustez les positions X et Y pour placer la papille gustative au centre de la fenêtre d’image.
  7. Fouillez les vaisseaux sanguins entourant la papille gustative à environ deux tiers de la hauteur de la papille gustative. Visualiser la circulation sanguine par injection de TRITC-dextran (500 kDa) à partir de l’étape 3.2 du protocole. Si le flux sanguin se bouche, desserrer légèrement les vis de fixation pour permettre la circulation sanguine.
  8. Ajustez l’axe Z et trouvez le plan Z de la papille gustative qui contient un nombre adéquat de cellules gustatives.
  9. Procéder à l’imagerie calcique avec 2-6 Hz pendant 80 s. Fournir une solution gustative de 20 s en allumant le réservoir du système fluidique après le début de l’imagerie. Après 20 s de stimulation du goût, revenir au réservoir en salive artificielle.
  10. Une fois l’imagerie séquentielle terminée, attendez environ 3 à 4 minutes avant la prochaine séance d’imagerie. Gardez la salive artificielle qui coule vers la langue de la souris pour éliminer le tastant rémanent de la séance d’imagerie précédente. Selon la conception de l’expérience, répétez la session au besoin.
  11. Lorsque l’imagerie calcique in vivo est terminée, euthanasier la souris selon la procédure IACUC. La souris sous anesthésie est sacrifiée dans la chambre CO2.
    REMARQUE: Vérifiez la profondeur de l’anesthésie à l’aide d’un réflexe de pincement des orteils. Lors d’une séance d’imagerie, la salive artificielle des réservoirs doit être fournie de manière cohérente. Si des bulles apparaissent à la fenêtre d’imagerie du μTongue, retirez les bulles en les poussant à travers l’entrée ou la sortie du μTongue en utilisant une forte pression de liquide.

5. Analyse d’images (Figure 3)

  1. Conversion d’image
    1. Ouvrez les fichiers image bruts à l’aide de Fiji14 ou d’un logiciel d’analyse d’images similaire.
    2. Convertissez le fichier image en fichier de pile RVB pour utiliser le code NPL Bud Analyzer.
      1. Image > couleur > canaux fractionnés
      2. Image > Couleur > Fusionner les couches et sélectionnez l’image à l’étape 5.2.1.
      3. Image > pile de > couleur en RVB
  2. Enregistrement d’image
    Remarque : Utilisez le code écrit sur mesure pour l’analyse des données. Veuillez vous référer à https://github.com/neurophotonic/Tastebud-analyzer.
    1. Exécutez le code nommé Taste_GUI.m; une fenêtre d’interface graphique nommée NPL Bud Analyzer apparaîtra. Cliquez sur le bouton Nouvelle analyse dans le coin supérieur droit, puis chargez l’image convertie à partir de l’étape 5.1. Définissez la fréquence d’images au-dessus de l’image chargée.
    2. Dessinez la région d’intérêt (ROI) sur l’image chargée pour l’enregistrement. Double-cliquez sur le ROI sélectionné et une inscription calculée automatiquement commencera.
  3. Obtenir les changements relatifsd’intensité de fluorescence (ΔF/F)
    1. Revenez à la fenêtre NPL Bud Analyzer pour afficher automatiquement l’image enregistrée à partir de l’étape 5.2. Si l’utilisateur dispose déjà d’un fichier reg, cliquez sur le bouton Charger les données et sélectionnez le fichier _reg.tif.
    2. Cliquez sur le bouton CIRCLE ou POLYGON et positionnez le ROI de la cellule de goût sur l’image de la papille gustative.
    3. Celui-ci présente l’intensité de fluorescence brute et la trace de calcium (ΔF/F)de la cellule gustative sélectionnée automatiquement sous l’image de la papille gustative.
    4. Cliquez sur Enregistrer la trace pour présenter la trace de calcium (ΔF/F) sur le côté droit de l’interface graphique, tandis que le retour sur investissement est affiché sur l’image de la papille gustative. Répétez les étapes 5.3.2 à 5.3.4 jusqu’à ce que la sélection du retour sur investissement soit terminée.
      REMARQUE: Cliquez sur le bouton Supprimer la trace si le retour sur investissement est mal sélectionné pour éliminer le dernier retour sur investissement sélectionné et la trace de calcium.
    5. Une fois la sélection du retour sur investissement terminée, écrivez le nom du fichier dans le coin inférieur droit et cliquez sur le bouton Terminer pour exporter la trace de calcium ΔF/F au format .xls et l’image tase bud avec des retours sur investissement au format .bmp.
  4. Analyse de la trace de calcium
    1. Analyser la trace de calcium obtenue à partir de l’étape 5.3. Considérez que les cellules gustatives ont réagi au tastant lorsque l’intensité de fluorescence augmente de plus de deux écarts-types de la ligne de base après que le tastant est délivré4, et que les valeurs de psont inférieures à 0,01, en utilisant des tests tappariés ou non appariés10.
    2. Considérez la cellule gustative comme une cellule répondeuse, si elle répond à un certain tastant plus de deux fois sur trois essais (~60%)15.
    3. Obtenir les traces de calcium représentatives en faisant la moyenne des traces de calcium individuelles acquises à partir de l’étape 5.4.1.

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Résultats

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La souris Pirt-GCaMP6f-tdTomato a été utilisée pour obtenir une image de papille gustative. La surface de la langue de la souris était recouverte de papilles filiformes autofluorescentes. Les papilles gustatives sont éparpillées sur la surface de la langue (Figure 4A). Les images de la papille gustative et de sa structure ont été acquises à l’aide de trois détecteurs de filtres différents. En utilisant l’ensemble de filtres 607/70 nm, le signal tdTomato des cellules gustatives a été obtenu p...

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Discussion

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Décrit ici est un protocole détaillé pour appliquer μTongue à l’étude des activités fonctionnelles des cellules gustatives in vivo. Dans ce protocole, l’imagerie fonctionnelle sur les cellules gustatives à l’aide d’indicateurs de calcium génétiquement codés est effectuée. En plus de l’utilisation de souris transgéniques, la charge électrophorétique de colorants calciques (ou colorants à détection de tension) sur les cellules gustatives peut être une option alternative.

Toutes les solu...

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Déclarations de divulgation

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Les auteurs déclarent des intérêts financiers concurrents : J. Han et M. Choi sont les inventeurs de la technologie brevetée μTongue décrite dans cet article, et le système μTongue est disponible dans le commerce via SciTech Korea.

Remerciements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ce travail a été soutenu par l’Institut des sciences fondamentales (IBS-R015-D1), la subvention de la National Research Foundation of Korea (NRF) financée par le gouvernement coréen (MSIT) (n° 2019M3A9E2061789) et par la subvention de la National Research Foundation of Korea (NRF) financée par le gouvernement coréen (MSIT) (n° 2019M3E5D2A01058329). Nous sommes reconnaissants à Eunsoo Kim et Eugene Lee pour leur assistance technique.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
acésulfame KSigma Aldrich04054-25GSalalive artificielle / dégustation
solution de chlorure de calciumSigma Aldrich21115-100MLSalive artificielle / dégustation
acide citriqueSigma AldrichC0759-100GSuve artificielle / dégustation
cycloheximideSigma Aldrich01810-5GSavie artificielle / dégustation
denatoniumSigma AldrichD5765-5GSalalive artificielle / tastant
Colle dentaireDenkistP0000CJT-A2Préparation animale
Image JNIHImageJAnalyse de données
IMPSigma Aldrich57510-5GSalalive artificielle / tastant
Adhésif instantanéLoctite Loctite4161, HenkelPréparation animale
K2HPO4Sigma AldrichP3786-100GSalive artificielle / dégustation
KClSigma AldrichP9541-500GSalive artificielle / dégustation
KétamineYuhan50Préparation animale
KH2PO4Sigma AldrichP0662-25GSalive artificielle / dégustation
KHCO3Sigma Aldrich237205-500GArtificielle salive / tastant
MATLABMathworkMATLABAnalyse de données
MgCl2Sigma AldrichM8266-100GSalalive artificielle / tastant
MPGSigma Aldrich49601-100GSalalive artificielle / tastant
Microscope MutiphotonThorlab  ; Microscope Bergamo II
NaClSigma AldrichS3014-500GSalive artificielle / dégustation
NaHCO3Sigma Aldrich792519-500GSalive artificielle / dégustation
ObjectifNikonN16XLWD-PFMicroscope
OctaflowALA Scientific InstrumentsOCTAFLOW IIContrôle fluidique
PCLGLg15N54Contrôle fluidique
PH-mètreThermoscientifiqueORION STAR AZ11Salve artificielle / dégustation
Saline tamponnée au phosphateSigma Aldrich806562Salive artificielle / dégustation
quinineSigma AldrichQ1125-5Gde salive artificielle / dégustation
Havard ApparatusPHD ULTRA 4400Contrôle fluidique
TRITC-dextranSigma Aldrich52194-1GPréparation des animaux
Laser à fibre ultrarapideTopticaFFultra920 01042Microscope
XylazineBayer KoreaRompunPréparation des animaux
Pompe à seringue

Références

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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Mots-clés

Imagerie microfluidiqueMicroscopie intravitaleImagerie des cellules gustativesImagerie calciqueMicroscopie biphotoniqueBourgeons gustatifsLangue in vivoImagerie de la circulation sanguineAdministration de substances gustatives

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