Imagerie tridimensionnelle d’organoïdes pour étudier la ciliogenèse primaire au cours de l’organogenèse ex vivo

Résumé

Les organoïdes dérivés de cellules souches facilitent l’analyse des processus moléculaires et cellulaires qui régulent l’auto-renouvellement et la différenciation des cellules souches au cours de l’organogenèse dans les tissus de mammifères. Nous présentons ici un protocole pour l’analyse de la biologie du cil primaire dans les organoïdes mammaires de souris.

Résumé

Les organoïdes sont des structures tridimensionnelles dérivées de cellules souches qui reproduisent ex vivo l’architecture et la physiologie complexes des organes. Ainsi, les organoïdes représentent des modèles utiles pour étudier les mécanismes qui contrôlent l’auto-renouvellement et la différenciation des cellules souches chez les mammifères, y compris la ciliogenèse primaire et la signalisation ciliaire. La ciliogenèse primaire est le processus dynamique d’assemblage du cil primaire, un centre de signalisation cellulaire clé qui contrôle l’auto-renouvellement et/ou la différenciation des cellules souches dans divers tissus. Nous présentons ici un protocole complet pour la coloration par immunofluorescence de la lignée cellulaire et des marqueurs de cils primaires, dans des organoïdes mammaires de souris entières, pour la microscopie à feuillet de lumière. Nous décrivons la méthode d’imagerie par microscopie et une technique de traitement d’images pour l’analyse quantitative de l’assemblage et de la longueur du cil primaire dans les organoïdes. Ce protocole permet une analyse précise des cils primaires dans des structures tridimensionnelles complexes au niveau de la cellule unique. Cette méthode est applicable à la coloration par immunofluorescence et à l’imagerie des cils primaires et de la signalisation ciliaire dans les organoïdes mammaires dérivés de cellules souches normales et génétiquement modifiées, de tissus sains et pathologiques, afin d’étudier la biologie du cil primaire dans la santé et la maladie.

Introduction

Le développement des organismes multicellulaires et le maintien de l’homéostasie dans leurs tissus adultes résident dans une régulation fine entre l’auto-renouvellement et la différenciation des cellules souches, qui orchestrent dans le temps et dans l’espace le développement et la régénération normaux des tissus¹. La subversion de cette régulation provoque des anomalies du développement et des cancers². Ainsi, la compréhension des mécanismes moléculaires et cellulaires qui orchestrent l’auto-renouvellement et la différenciation des cellules souches est d’un intérêt clé pour la biologie du développement et du cancer.

Le développement récent de méthodes d’organogenèse ex vivo, dans lesquelles les cellules souches tissulaires génèrent des organoïdes tridimensionnels, a transformé nos capacités à étudier la dynamique des cellules souches au cours de l’organogenèse des mammifères et du maintien de l’homéostasie tissulaire dans une boîte³. Les organoïdes représentent une bonne alternative aux modèles animaux génétiquement modifiés encombrants pour étudier ces processus. Des protocoles pour le développement d’organoïdes à partir de cellules souches tissulaires de nombreux organes ont maintenant été développés³, y compris l’intestin grêle et le côlon, l’estomac, le foie, le pancréas, la prostate et la glande mammaire³. De plus, le développement de techniques d’édition somatique du génome dans les cellules souches formatrices d’organoïdes permet désormais d’interroger rapidement les mécanismes moléculaires et cellulaires qui contrôlent leur biologie ^4,5.

Le cil primaire est une structure à base de microtubules qui est assemblée à la surface de cellules souches et/ou différenciées de divers tissus⁶. Il est généralement non mobile et est assemblé en une seule structure par cellule⁷. La ciliogenèse primaire est le processus dynamique d’assemblage du cil primaire⁷. À la surface de la cellule, le cil agit comme une plate-forme de signalisation cellulaire⁸. Ainsi, on pense que le cil primaire agit comme un régulateur clé de l’auto-renouvellement et/ou de la différenciation des cellules souches dans de nombreux tissus, y compris le cerveau ^9,10, la glande mammaire ^4,11, le tissu adipeux¹² et l’épithélium olfactif¹³, entre autres. La ciliogenèse primaire et/ou la signalisation ciliaire sont régulées dynamiquement dans des lignées cellulaires distinctes et à différents stades de développement ^4,13,14, mais les mécanismes sous-jacents restent à déterminer.

L’organogenèse ex vivo est prometteuse pour le développement de connaissances fondamentales sur les mécanismes moléculaires et cellulaires qui contrôlent la biologie des cellules souches, y compris la ciliogenèse primaire et la signalisation ciliaire. Cependant, il repose sur la capacité d’imager correctement des organoïdes entiers au niveau de la cellule unique et à l’échelle subcellulaire. Nous avons récemment utilisé un modèle d’organoïde dérivé de cellules souches mammaires de souris pour montrer que les cils primaires contrôlent positivement la capacité de formation d’organoïdes de cellules souches mammaires^{de souris 4}. Nous présentons ici un protocole complet pour la coloration par immunofluorescence d’organoïdes mammaires de souris entières (Figure 1A,B), qui permet l’analyse des cils primaires par microscopie à feuillet de lumière lors d’une organogenèse ex vivo en trois dimensions. D’autres méthodes ont récemment été publiées pour la coloration par immunofluorescence et l’imagerie des organoïdes par microscopie confocale^15,16. Ce protocole se concentre plutôt sur la préparation et l’imagerie d’organoïdes par microscopie à feuillet de lumière.

Protocole

REMARQUE : Le protocole ci-dessous est recommandé pour la coloration des organoïdes qui ont été cultivés dans 5 puits d’une plaque de 96 puits et regroupés (> 100 organoïdes). Les organoïdes ont été dérivés de cellules souches mammaires de souris. Les souris donneuses ont été hébergées et manipulées conformément aux protocoles approuvés par le Comité de protection des animaux de l’Université de Rennes (France).

1. Réactifs

1. Pour préparer la solution fixatrice, diluez 125 μL de solution commerciale aqueuse de paraformaldéhyde (PFA) à 16 % dans 375 μL de solution saline tamponnée au phosphate (PBS) pour générer une solution de PFA à 4 %.
   ATTENTION : Manipulez le PFA qui est une substance toxique sous une hotte chimique.
2. Pour préparer le tampon de perméabilisation, diluez 1,5 μL de Triton X100 dans 500 μL de PBS, pour obtenir une solution de Triton X100 à 0,3 %.
3. Pour préparer le tampon de blocage, diluez 1,5 μL de Tween-20 et 75 μL de sérum de chèvre normal dans du PBS, pour générer une solution de sérum de chèvre à 5 % et 0,1 % de Tween 20.
4. Pour préparer le support de montage de feuille légère, dissoudre 1 g d’agarose ultrapure à bas point de fusion dans 100 mL de dH20 ou de PBS à 65 °C. Préparez 1 mL d’aliquotes et conservez-les à température ambiante.

2. Récupération des organoïdes

1. Transférez les organoïdes des puits de culture dans un tube polymère de 1,7 mL à faible liaison, après les avoir pipetés 3 fois de haut en bas dans les puits, avec une pointe recouverte de FBS dont l’extrémité a été coupée (diamètre minimal de l’extrémité 1,5 mm).
   REMARQUE : Le revêtement empêche les organoïdes de coller à la pointe. Le matériau polymère à faible liaison permet de réduire la fixation des organoïdes sur le côté du tube pendant toute la procédure de coloration.
2. Remplissez le tube de PBS et tournez-le à 350 x g pendant 3 min. Retirez le surnageant.

3. Fixation, perméabilisation et blocage

1. Remettre les organoïdes en suspension dans 500 μL de 4 % de PFA. Incuber 30 min à température ambiante. Tournez à 350 x g pendant 30 s. Retirez le surnageant.
   REMARQUE : À partir de cette étape, remettez les organoïdes en suspension dans les différents tampons en ajoutant simplement les tampons sur la pastille d’organoïdes sans les toucher. Effectuez toutes les étapes de lavage à température ambiante.
2. Laver les organoïdes avec 1 mL de PBS pendant 3 min. Tournez à 350 x g pendant 30 s. Retirez le surnageant.
   PAUSE : Les organoïdes fixes peuvent être conservés dans du PBS à 4 °C pendant au moins une semaine.
3. Perméabiliser les organoïdes en les remettant en suspension dans 500 μL de PBS-Triton X100 0,3 % et incuber pendant 30 min à température ambiante. Faites tourner les organoïdes à 350 g pendant 30 s.
4. Lavez les organoïdes en les remettant en suspension avec 1 mL de PBS et incubez pendant 3 min. Tournez à 350 x g pendant 30 s. Retirez le surnageant. Répétez l’opération une fois.
5. Facultatif : Remettre les organoïdes en suspension dans 500 μL de méthanol glacé. Incuber à - 20 °C pendant 10 min. Cette étape peut être nécessaire pour la coloration de marqueurs centrosomaux spécifiques.
6. Facultatif (si l’étape 5 a été effectuée) : Laver les organoïdes avec 1 mL de PBS pendant 3 min. Tournez à 350 x g pendant 30 s. Retirez le surnageant. Répétez l’opération une fois.
7. Bloquez les sites de liaison d’anticorps non spécifiques dans les organoïdes en les remettant en suspension avec 500 μL de tampon de blocage (PBS, 5 % de sérum de chèvre, 0,1 % de Tween 20). Incuber 1 h et 30 min à température ambiante. Essorez à 350 g pendant 30 s. Retirez le surnageant.
8. Lavez les organoïdes en les remettant en suspension avec 1 mL de PBS et incubez pendant 3 min. Tournez à 350 x g pendant 30 s. Retirez le surnageant.

4. Étiquetage

1. Remettre les organoïdes en suspension avec 200 μL de tampon de blocage avec des anticorps primaires dilués et incuber toute la nuit à 4 °C en agitant légèrement (60 tr/min sur un agitateur horizontal). Placez les tubes avec un angle de 45° avec le plan horizontal du shaker. Il maintiendra les organoïdes au fond des tubes dans le tampon de coloration.
2. Lavez les organoïdes en les remettant en suspension avec 1 mL de PBS et incubez pendant 5 min. Tournez à 350 x g pendant 30 s. Retirez le surnageant. Répétez l’opération deux fois.
   REMARQUE : Certains organoïdes de la dernière étape peuvent coller sur le côté du tube, entraînant une perte d’organoïdes lors de l’aspiration du surnageant après centrifugation, l’ajout de 0,2 % (p/v) d’albumine sérique bovine (BSA) au PBS dans les étapes de lavage peut réduire la perte d’organoïdes.
3. Remettre les organoïdes en suspension avec 200 μL de tampon de blocage avec des anticorps secondaires et incuber pendant 1 h et 30 min en agitant doucement (60 tr/min sur un agitateur horizontal). Placez les tubes avec un angle de 45° avec le plan horizontal du shaker. Il maintiendra les organoïdes au fond des tubes dans le tampon de coloration.
   REMARQUE : Hoechst (ou d’autres colorants nucléaires, tels que DAPI ou DRAQ5) peuvent être ajoutés au tampon avec des anticorps secondaires.
4. Lavez les organoïdes en les remettant en suspension avec 1 mL de PBS et incubez pendant 5 min. Tournez à 350 x g pendant 30 s. Retirez le surnageant. Répétez l’opération deux fois.
   REMARQUE : Certains organoïdes de la dernière étape peuvent coller sur le côté du tube, entraînant une perte d’organoïdes lors de l’aspiration du surnageant après centrifugation, l’ajout de 0,2 % (p/v) de BSA au PBS dans les étapes de lavage peut réduire la perte d’organoïdes.

5. Préparation de l’échantillon d’agarose pour l’imagerie

1. Faites fondre le support de montage de feuille légère en l’incubant à 65 °C. Une fois le milieu fondu, incubez-le à 37 °C pendant 5 min.
2. Remettre les organoïdes en suspension dans 100 μL de milieu de montage à l’aide d’une pointe de 200 μL, avec l’extrémité de la pointe coupée (taille minimale de l’extrémité : 1,5 mm), en pipetant deux fois vers le haut et vers le bas.
3. Aspirez le milieu de montage avec les organoïdes dans un capillaire en verre (capillaire vert, diamètre intérieur : 1,5 mm) à l’aide d’un piston. Incuber le capillaire à température ambiante pendant 5 min pour que le support de montage se solidifie.
   PAUSE : Le capillaire peut être stocké dans du PBS à 4 °C pendant une semaine avant l’imagerie.

6. Imagerie

1. À l’aide d’un microscope à feuillet lumineux (par exemple, ZEISS Lightsheet Z.1), imagez les organoïdes avec des objectifs d’immersion dans l’eau 20x ou 40x.
   1. Placez le capillaire en verre dans la chambre d’observation. Localisez le capillaire à l’aide de la caméra frontale et placez l’extrémité du capillaire en verre à la limite supérieure de l’objectif de détection.
   2. Sélectionnez l’échantillon et réglez la mise au point optimale à l’aide de l’extrémité du capillaire en verre dans l’éclairage en fond clair. Poussez lentement l’échantillon d’agarose hors du capillaire et localisez les organoïdes dans l’agarose solidifié.
   3. Gardez les organoïdes à imager près de l’extrémité du capillaire, afin de réduire les mouvements de l’échantillon d’agarose dans le PBS. Tournez le capillaire pour définir l’orientation optimale de l’échantillon et définir le zoom souhaité.
   4. Sélectionnez le mode d’acquisition. Définissez les canaux à imager, définissez les orientations appropriées de la feuille de lumière, réglez la puissance laser pour chaque canal (pour réduire le photoblanchiment, utilisez une faible puissance laser), définissez la taille de l’image et le(s) côté(s) d’éclairage souhaité(s). Exemple de paramètres d’imagerie : taille de l’image 1920 x 1920, éclairage : double face.
   5. Définissez la pile Z sur l’image en définissant les extrémités Z de la pile à l’aide du module Pile Z et définissez la taille de la pile Z sur optimale.
2. Traitez le fichier de sortie à l’aide du module de traitement d’image du logiciel du microscope pour naviguer dans l’échantillon, obtenir une projection Z et une représentation 3D.
3. Retournez l’échantillon et acquérez une nouvelle image sous un angle différent ou d’autres organoïdes.
4. Analyser des images à l’aide d’un logiciel d’analyse d’images en microscopie interactive (ex : Imaris) permettant (i) la visualisation de l’échantillon en 3D, (ii) la segmentation d’objets, (iii) l’identification et l’analyse quantitative d’objets.

Résultats

Les méthodes d’organogenèse ex vivo transforment nos capacités à étudier le développement des tissus de mammifères et le maintien de l’homéostasie tissulaire dans une boîte. L’analyse des mécanismes moléculaires et cellulaires qui régulent ces processus, y compris la ciliogenèse primaire et la signalisation ciliaire, repose sur la capacité d’imager des organoïdes en trois dimensions.

Le protocole décrit ci-dessus permet la coloration d’organoïdes mammaires entiers. Ils proviennent de ...

Discussion

Le protocole détaillé présenté ici permet la coloration et l’imagerie d’organoïdes mammaires de souris qui se développent en milieu semi-solide. Ce protocole est vraisemblablement applicable à la coloration d’organoïdes imitant l’architecture de divers tissus qui se développent dans des milieux semi-solides et solides. Pour les organoïdes qui poussent à 100 % en Matrigel avec un milieu sur le dessus, les étapes de récupération et de fixation diffèrent légèrement. Le milieu de culture doi...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Anti-souris IgG1 647	Thermo-Fisher	A21240
Anti-souris IgG2A 488	Thermo-Fisher	A21131
Anti-lapin 546	Thermo-Fisher	A11035
Arl13b	NeuroMab	73-287
EMS 16 % Paraformaldéhyde Solution aqueuse, EM Grade	Microscopie électronique Sciences	15710
FBS	Thermo-Fisher	10270106
gtubuline	Sigma-Aldrich	T5326
Hoechst 33342	Thermo-Fisher	62249
Integrin a6	Biolegend	313616
Light Sheet Capillary	Zeiss	701908
Light Sheet piston	Zeiss	701998
Low binding Tubes de microcentrifugation	BioScience	27210
Normal Goat Sérum bloquant Solution	Vector labs	S-1000
PBS	Sigma-Aldrich	p3587
de signalisation cellulaire	limace	9585
Triton-X100	Sigma-Aldrich	T9284
Tween-20	Euromedex	9005-64-5
Agarose à bas point de fusion UltraPure	Thermo-Fisher	16520050