Method Article

Analyse de la composition lipidique des mycobactéries par chromatographie sur couche mince

DOI:

10.3791/62368

⸱

April 16th, 2021

 ,  , 
1Departament de Genètica i de Microbiologia, Facultat de Biociències, Universitat Autònoma de Barcelona

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Un protocole est présenté pour extraire la teneur totale en lipides de la paroi cellulaire d’un large éventail de mycobactéries. De plus, les protocoles d’extraction et d’analyse des différents types d’acides mycoliques sont présentés. Un protocole chromatographique sur couche mince pour surveiller ces composés mycobactériens est également fourni.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les espèces de mycobactéries peuvent différer les unes des autres par le taux de croissance, la présence de pigmentation, la morphologie de la colonie affichée sur les milieux solides, ainsi que d’autres caractéristiques phénotypiques. Cependant, ils ont tous en commun le caractère le plus pertinent des mycobactéries: sa paroi cellulaire unique et hautement hydrophobe. Les espèces de mycobactéries contiennent un complexe membranaire-covalent qui comprend l’arabinogalactane, le peptidoglycane et de longues chaînes d’acides mycoliques avec des types qui diffèrent entre les espèces de mycobactéries. En outre, les mycobactéries peuvent également produire des lipides situés, non liés de manière covalente, à la surface de leurs cellules, tels que les dimycocérosates de phtiocérol (PDIM), les glycolipides phénoliques (PGL), les glycopeptidolipides (GPL), les acyltréhaloses (AT) ou les mannosides de phosphatidil-inositol (PIM), entre autres. Certains d’entre eux sont considérés comme des facteurs de virulence dans les mycobactéries pathogènes, ou des lipides antigéniques critiques dans l’interaction hôte-mycobactéries. Pour ces raisons, il existe un intérêt significatif pour l’étude des lipides mycobactériens en raison de leur application dans plusieurs domaines, de la compréhension de leur rôle dans la pathogénicité des infections à mycobactéries, à une implication possible en tant qu’agents immunomodulateurs pour le traitement des maladies infectieuses et d’autres pathologies telles que le cancer. Ici, une approche simple pour extraire et analyser la teneur totale en lipides et la composition en acide mycolique des cellules de mycobactéries cultivées dans un milieu solide à l’aide de mélanges de solvants organiques est présentée. Une fois les extraits lipidiques obtenus, une chromatographie sur couche mince (TLC) est effectuée pour surveiller les composés extraits. L’exemple d’expérience est réalisé avec quatre mycobactéries différentes: mycolicibacterium brumae et Mycolicibacterium fortuitum, mycobacterium bovis bacillus Calmette-Guérin (BCG), à croissance lente atténuée, et Mycobacterium abcessus ,un pathogène opportuniste à croissance rapide, démontrant que les méthodes présentées dans le présent protocole peuvent être utilisées pour un large éventail de mycobactéries.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mycobacterium est un genre qui comprend des espèces pathogènes et non pathogènes, caractérisées par une paroi cellulaire hautement hydrophobe et imperméable formée par leurs lipides particuliers. Plus précisément, la paroi cellulaire mycobactérienne contient des acides mycoliques, qui sont des acides gras α-alkyle et β-hydroxy, dans lesquels la branche α est constante dans tous les acides mycoliques (à l’exception de la longueur) et la chaîne β, appelée chaîne méroromycolate, est une longue chaîne aliphatique qui peut contenir différents groupes chimiques fonctionnels décrits avec la littérature (α-, α'-, méthoxy-, Mycolates κ-, époxy-, carboxy- et ω-1-méthoxy-), produisant donc sept types d’acides mycoliques (I-VII)1. De plus, d’autres lipides d’une importance incontestable sont également présents dans la paroi cellulaire des espèces de mycobactéries. Espèces pathogènes telles que Mycobacterium tuberculosis, l’agent causal de la tuberculose2 produire des facteurs de virulence spécifiques à base de lipides tels que les dimycocérosates de phtiocérol (PDIM), les glycolipides phénoliques (PGL), les di-, tri- et penta-acyltréhaloses (DAT, TAT et PAT), ou les sulfolipides, entre autres3. Leur présence sur la surface mycobactérielle a été associée à la capacité de modifier la réponse immunitaire de l’hôte et, par conséquent, à l’évolution et à la persistance de la mycobactérie à l’intérieur de l’hôte.4. Par exemple, la présence de triacylglycérols (TAG) a été associée au phénotype hypervirulent de la sous-lignée 2-Beijing de M. tuberculosis, peut-être en raison de sa capacité à atténuer la réponse immunitaire de l’hôte5,6. D’autres lipides pertinents sont les lipooligosaccharides (LS) présents dans les mycobactéries tuberculeuses et non tuberculeuses. Dans le cas de Mycobacterium marinum, la présence de LS dans sa paroi cellulaire est liée à la motilité glissante et à la capacité de former des biofilms et interfère avec la reconnaissance par les récepteurs de reconnaissance des formes de macrophages, affectant l’absorption et l’élimination des bactéries par les phagocytes hôtes7,8. De plus, l’absence ou la présence de certains lipides permet aux membres d’une même espèce d’être classés en différents morphotypes avec des profils virulents ou atténués lorsqu’ils interagissent avec les cellules hôtes. Par exemple, l’absence de glycopeptidolipides (GPL) dans le morphotype approximatif de Mycobacterium abscessus a été associé à la capacité d’induire une acidification intraphagosomale et, par conséquent, une apoptose cellulaire9, contrairement au morphotype lisse qui possède des GPG à leur surface. De plus, la teneur en lipides de la paroi cellulaire mycobactérielle est liée à la capacité de modifier la réponse immunitaire chez l’hôte. Ceci est pertinent dans le contexte de l’utilisation de certaines mycobactéries pour déclencher un profil immunitaire protecteur contre différentes pathologies10,11,12,13. Il a été démontré, par exemple, que Mycolicibacterium vaccae, une mycobactérie saprophyte, qui fait actuellement l’objet d’essais cliniques de phase III en tant que vaccin immunothérapeutique contre la tuberculose, présente deux morphotypes coloniaux. Alors que le phénotype lisse, qui contient un polyester à sa surface, déclenche une réponse Th2, le phénotype rugueux dépourvu de polyester peut induire un profil Th1 lorsqu’il interagit avec les cellules immunitaires de l’hôte.14. Le répertoire des lipides présents dans la cellule mycobactérielle dépend non seulement des espèces de mycobactéries, mais aussi des conditions des cultures mycobactériennes: temps d’incubation15,16 ou la composition du milieu de culture17,18. En fait, les changements dans la composition du milieu de culture affectent l’activité antitumorale et immunostimulante de M. bovis BCG et Mycolicibacterium brumae in vitro17. De plus, le profil immunitaire protecteur déclenché par M. bovis BCG contre M. tuberculosis le défi dans les modèles de souris dépend également du milieu de culture dans lequel M. bovis Le BCG se développe17. Ceux-ci pourraient alors être liés à la composition lipidique des mycobactéries dans chaque condition de culture. Pour toutes ces raisons, l’étude de la teneur en lipides des mycobactéries est pertinente. Une procédure visuelle pour extraire et analyser la composition lipidique de la paroi cellulaire mycobactérienne est présentée.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Extraction des lipides totaux non liés par covalents des mycobactéries (Figure 1)

  1. Rayer 0,2 g de mycobactéries d’un milieu solide et ajouter à un tube de verre avec un bouchon à vis de doublure en polytétrafluoroéthène (PTFE). Ajouter une solution composée de 5 mL de chloroforme et de 10 mL de méthanol (chloroforme:méthanol, 1:2).
    REMARQUE: Lorsque des solvants organiques sont utilisés, seul le récipient en verre doit être utilisé. Aucun contenant en plastique n’est autorisé. De plus, des bouchons à vis en PTFE pour les bouteilles sont nécessaires.
    ATTENTION : Le chloroforme est une substance potentiellement toxique et extrêmement dangereuse. Il doit être utilisé dans une hotte à flux laminaire portant un équipement de protection individuelle approprié (manteau de laboratoire, lunettes de protection et gants en nitrile).
    ATTENTION : Le méthanol est une substance potentiellement toxique et extrêmement dangereuse. Il doit être utilisé dans une hotte à flux laminaire portant un équipement de protection individuelle approprié (manteau de laboratoire, lunettes de protection et gants en nitrile).
  2. Laissez le tube en agitation constante pendant la nuit pour extraire les lipides non liés à la covalence de la surface de la cellule mycobactérielle.
    REMARQUE: Si une plate-forme d’agitation orbitale n’est pas disponible, l’agitation constante peut être remplacée par une agitation manuelle périodique aussi souvent que possible.
  3. Couvrez un entonnoir de verre avec un papier filtre, filtrez les solvants organiques et collectez-les dans un tube en verre.
  4. Utilisez un flux d’azote gazeux pour évaporer la phase liquide dans le tube. Remplissez le tube d’azote gazeux, couvrez-le et conservez-le à 4 °C.
    REMARQUE: Connectez une pipette Pasteur en verre au flux d’azote gazeux pour évaporer spécifiquement le tube souhaité. De plus, maintenez le tube à l’intérieur d’un bloc chauffant sec pour les tubes à 37 ° C. Lorsque le solvant s’évapore, remplissez le tube d’azote gazeux avant de le fermer.
  5. Ajouter 15 mL d’une solution de chloroforme:méthanol (2:1) aux débris cellulaires. Laissez le tube en agitation constante pendant la nuit pour extraire les lipides non liés à la covalence de la surface de la cellule mycobactérielle.
    REMARQUE: Si une plate-forme d’agitation orbitale n’est pas disponible, l’agitation constante peut être remplacée par une agitation manuelle périodique aussi souvent que possible.
  6. Laisser reposer le mélange pendant 1 h. Avec une pipette Pasteur, récupérez les solvants organiques. Recouvrez un entonnoir de verre avec un papier filtre et filtrez les solvants organiques et collectez-les dans le même tube de verre précédemment utilisé à l’étape 1.3. Utilisez un flux d’azote gazeux pour évaporer la phase liquide dans le tube. Remplissez le tube d’azote gazeux, fermez-le et stockez-le à nouveau à 4 °C.

2. Extraction de l’acide mycolique par méthanolyse acide (Figure 2A)

  1. Ajouter 2 à 5 mL de solution estérifiante dans un tube en verre hermétique avec un bouchon à vis en PTFE. Ajouter 0,2 g de biomasse de mycobactéries dans le tube de verre.
    REMARQUE: La solution estérifiante est formée en mélangeant 30 mL de méthanol, 15 mL de toluène et 1 mL d’acide sulfurique. Les cellules de mycobactéries peuvent être prélevées à partir de cultures solides ou, même, de cellules délipidées après avoir effectué l’extraction de lipides totaux non liés à la covalente de mycobactéries (cellules restantes après filtrage à l’étape 1.6).
    ATTENTION : Le toluène est une substance inflammable et extrêmement dangereuse. Il doit être utilisé dans une hotte à flux laminaire portant un équipement de protection individuelle approprié (manteau de laboratoire, lunettes de protection et gants en nitrile).
    ATTENTION : L’acide sulfurique est une substance corrosive et dangereuse. Il doit être utilisé dans une hotte à flux laminaire portant un équipement de protection individuelle approprié (manteau de laboratoire, lunettes de protection et gants en nitrile).
  2. Mélangez le contenu en vortexant. Laissez le mélange reposer dans un bain sec à 80 °C pendant la nuit.
  3. Laissez refroidir le tube jusqu’à ce qu’il atteigne la température ambiante, puis ajoutez 2 mL de n-hexane au tube. Mélanger le contenu en vortexant pendant 30 s et laisser le tube se déposer jusqu’à ce que deux phases claires apparaissent.
    ATTENTION : Le n-hexane est une substance potentiellement inflammable, irritante, dommageable pour l’environnement et extrêmement dangereuse. Il doit être utilisé dans une hotte à flux laminaire portant un équipement de protection individuelle approprié (manteau de laboratoire, lunettes de protection et gants en nitrile).
  4. Récupérer la phase supérieure correspondant à la phase n-hexane. Transférez-le dans un nouveau tube.
  5. Répétez l’étape 2.3. Récupérez à nouveau la phase supérieure et transférez-la dans le même tube que celui utilisé à l’étape 2.4.
  6. Évaporer le contenu du tube à l’aide d’un flux d’azote gazeux. Remplissez le tube d’azote gazeux, fermez-le et stockez-le à 4 °C.

3. Extraction de l’acide mycolique par saponification et méthylation (Figure 2B)

  1. Rayer 0,2 g de mycobactéries d’un support solide et ajouter à un tube de verre avec un bouchon à vis en PTFE.
  2. Ajouter 2 mL de solution méthanol-benzène (80:20) contenant 5 % d’hydroxyde de potassium. Mélanger le contenu en vortexant. Chauffer le mélange pendant 3 h à 100 °C.
    ATTENTION : Le benzène est une substance inflammable, cancérigène et dangereuse. Il doit être utilisé dans une hotte à flux laminaire portant un équipement de protection individuelle approprié (manteau de laboratoire, lunettes de protection et gants en nitrile).
  3. Laissez le tube refroidir à la température ambiante. Ajouter 20% d’acide sulfurique pour acidifier les échantillons afin d’obtenir un pH = 1.
  4. Ajouter 3 mL d’éther diéthylique. Mélanger doucement le contenu en vortexant.
  5. Laissez les deux phases se former en s’installant. Récupérez la phase d’éther diéthylique et transférez-la dans un nouveau tube. Répétez l’étape de lavage pour un total de trois fois.
  6. Laver l’extrait d’éther diéthylique avec 2 mL d’eau distillée et transférer la partie supérieure correspondant à l’éther diéthylique dans un nouveau tube. Répétez l’étape de lavage pour un total de trois fois.
  7. Ajouter 2 g de sulfate de sodium anhydre sur l’extrait d’éther diéthylique pour le sécher.
  8. Filtrer la suspension. Évaporez le contenu à l’aide d’un flux d’azote gazeux.
  9. Pour effectuer l’étape de méthylation, dissoudre 3 g de N-nitroso-N-méthyl urée dans une solution prérefroidie formée de 45 mL d’éther diéthylique et de 9 mL de KOH à 40 % dans de l’eau distillée.
    ATTENTION : La N-nitroso-N-méthylurée est une substance toxique, irritante, cancérigène et dangereuse. Il doit être utilisé dans une hotte à flux laminaire portant un équipement de protection individuelle approprié (manteau de laboratoire, lunettes de protection et gants en nitrile).
  10. Transférer le surnageant (diazométhane) dans une nouvelle fiole refroidie dans de la glace contenant des pastilles d’hydroxyde de potassium (environ 30 g).
    REMARQUE: Si le surnageant n’est pas immédiatement utilisé, il peut être conservé à -20 °C pendant un maximum de 1 h.
    ATTENTION : Les pastilles d’hydroxyde de potassium sont une substance irritante et corrosive. Ce matériau doit être utilisé dans une hotte à flux laminaire portant un équipement de protection individuelle approprié (manteau de laboratoire, lunettes de protection et gants en nitrile).
    ATTENTION : Le diazométhane est hautement toxique et potentiellement explosif. Il doit être utilisé dans une hotte à flux laminaire avec du verre de sécurité portant un équipement de protection individuelle approprié (manteau de laboratoire, lunettes de protection et gants en nitrile).
  11. Ajouter 2 mL de la solution d’éther contenant du diazométhane, obtenue à l’étape 3.10, dans l’extrait d’éther diéthylique séché qui contient des acides mycoliques, obtenu à l’étape 3.8. Incuber pendant 15 min à température ambiante.
  12. Évaporer la suspension à 40 °C. Remplissez le tube d’azote gazeux, fermez-le et stockez les lipides méthylés à 4 °C.
    REMARQUE: Évaporez le diazométhane de la solution d’éther sous la hotte à écoulement laminaire, jusqu’à ce que l’éther perde sa couleur jaune.

4. Analyse par chromatographie sur couche mince (TLC)

  1. Saturer la chambre TLC en verre. Pour ce faire, recouvrez l’une des parois de la chambre TLC d’un morceau de papier filtre et laissez-la entrer en contact avec la phase mobile composée par le mélange de solvants. Placez le volume restant du solvant sur le fond de la chambre TLC.
    REMARQUE: Le fond de la chambre TLC doit être recouvert d’au moins 1 cm de la phase mobile. Dans les expériences actuelles, différentes phases mobiles ont été utilisées pour développer les TLC. Ils étaient constitués de 85 mL de n-hexane plus 15 mL d’éther diéthylique; 100 mL de dichlorométhane; 90 mL de chloroforme, 10 mL de méthanol et 1 mL d’eau; 30 mL de chloroforme, plus 8 mL de méthanol et 1 mL d’eau; 60 mL de chloroforme, plus 35 mL de méthanol et 8 mL d’eau; 95 mL de chloroforme plus 5 mL de méthanol; et 90 mL d’éther de pétrole (60-80 °C) plus 10 mL d’éther diéthylique.
    REMARQUE: Dans le TLC bidimensionnel, utilisez n-hexane:acétone (95:5) dans la première direction trois fois, et utilisez un seul développement avec toluène:acétone (97:3) dans la deuxième direction pour analyser la composition en acide mycolique. Pour analyser les PIP, utilisez chloroforme:méthanol:eau (60:30:6) dans la première direction une fois, et utilisez chloroforme:acide acétique:méthanol:eau (40:25:3:6) dans la deuxième direction. Pour analyser pdIM et AG, utilisez trois fois l’éther de pétrole (60-80 °C): acétate d’éthyle (98:2) dans la première direction, et utilisez un seul développement avec de l’éther de pétrole (60-80 °C): acétone (98:2) dans la deuxième direction.
    ATTENTION : L’éther diéthylique est une substance potentiellement toxique et dangereuse. Il doit être utilisé dans une hotte à flux laminaire portant un équipement de protection individuelle approprié (manteau de laboratoire, lunettes de protection et gants en nitrile).
    ATTENTION : Le dichlorométhane est une substance potentiellement toxique et dangereuse. Il doit être utilisé dans une hotte à flux laminaire portant un équipement de protection individuelle approprié (manteau de laboratoire, lunettes de protection et gants en nitrile).
    ATTENTION : L’éther de pétrole est une substance potentiellement inflammable, dommageable pour l’environnement et extrêmement dangereuse. Il doit être utilisé dans une hotte à flux laminaire portant un équipement de protection individuelle approprié (manteau de laboratoire, lunettes de protection et gants en nitrile).
    ATTENTION : L’acide acétique est une substance potentiellement inflammable et corrosive. Il doit être utilisé dans une hotte à flux laminaire portant un équipement de protection individuelle approprié (manteau de laboratoire, lunettes de protection et gants en nitrile).
    ATTENTION : L’acétate d’éthyle est une substance inflammable et dangereuse. Il doit être utilisé dans une hotte à flux laminaire portant un équipement de protection individuelle approprié (manteau de laboratoire, lunettes de protection et gants en nitrile).
    ATTENTION : L’acétone est une substance inflammable et dangereuse. Il doit être utilisé dans une hotte à flux laminaire portant un équipement de protection individuelle approprié (manteau de laboratoire, lunettes de protection et gants en nitrile).
  2. Fermez la chambre TLC pour la saturer pendant au moins 20 min. Pendant ce temps, dissoudre les lipides présents dans le tube de verre dans 0,2-1 mL de chloroforme.
    REMARQUE: Le volume utilisé pour dissoudre les lipides peut être modifié en fonction de la concentration souhaitée ou attendue de l’échantillon.
  3. Appliquer 10 μL de chaque suspension à l’aide d’un tube de verre capillaire directement sur la plaque TLC et laisser sécher l’échantillon pendant 5 min à température ambiante.
    REMARQUE: Les échantillons doivent être appliqués dans la partie inférieure de la plaque en laissant 1 cm de chaque côté. Les échantillons doivent être séparés les uns des autres sur une longueur d’au moins 0,5 cm. Une fois l’échantillon appliqué sur la plaque, les tubes peuvent être évaporés à nouveau avec de l’azote gazeux et stockés à 4 ° C pour une utilisation ultérieure.
  4. Insérez la plaque dans la chambre TLC saturée contenant la phase mobile. Laissez la phase mobile passer par le TLC.
    REMARQUE: Tout mouvement appliqué à la chambre TLC affecte le solvant en cours d’exécution sur la plaque et affecte la mobilité des lipides. Dans le cas de l’exécution d’un TLC bidimensionnel, deux chambres TLC sont nécessaires pour contenir les deux systèmes d’élution.
  5. Retirez la plaque de la chambre TLC lorsque le solvant atteint une distance de 1 cm de l’extrémité supérieure de la plaque. Laissez la plaque sous flux laminaire jusqu’à ce que la silice soit totalement séchée.
    REMARQUE: Dans le cas de l’analyse de la composition de l’acide mycolique, en utilisant du n-hexane et de l’éther diéthylique (85:15), répétez les étapes 4.4 et 4.5 deux fois plus, jusqu’à ce que la phase mobile soit exécutée trois fois sur la plaque TLC.
  6. Révélez la plaque avec la tache requise; chauffer la plaque si nécessaire.
    REMARQUE: Dans la présente expérience, 15 à 20 mL des solutions suivantes ont été utilisées pour pulvériser les plaques TLC: hydrate d’acide molybdatophosphorique à 10% dans l’éthanol jusqu’à ce que la plaque soit jaune vif, puis chauffage de la plaque à 120 ° C; 5 % dans l’éthanol de 20 % α-naphtol dans l’acide sulfurique, puis chauffage de la plaque à 120 °C; Réactif bleu de molybdène (1,3 % d’oxyde de molybdène dans de l’acide sulfurique 4,2 M) jusqu’à l’apparition de bandes phosphate ou 1 % d’anthrone dans l’acide sulfurique.
    ATTENTION : L’hydrate d’acide molybdatophosphorique est une substance inflammable et corrosive. Il doit être utilisé dans une hotte à flux laminaire portant un équipement de protection individuelle approprié (manteau de laboratoire, lunettes de protection et gants en nitrile).
    ATTENTION : L’éthanol est une substance potentiellement inflammable et dangereuse. Il doit être utilisé dans une hotte à flux laminaire portant un équipement de protection individuelle approprié (manteau de laboratoire, lunettes de protection et gants en nitrile).
    ATTENTION : Le 1-naphtol est une substance inflammable, corrosive et extrêmement dangereuse. Il doit être utilisé dans une hotte à flux laminaire portant un équipement de protection individuelle approprié (manteau de laboratoire, lunettes de protection et gants en nitrile).
    ATTENTION : Le réactif molybdène Blue Spray est une substance corrosive, toxique et extrêmement dangereuse. Il doit être utilisé dans une hotte à flux laminaire portant un équipement de protection individuelle approprié (manteau de laboratoire, lunettes de protection et gants en nitrile).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dans le but de montrer un large éventail de lipides présents dans différentes espèces de mycobactéries, M. bovis BCG a été sélectionné car il s’agit de mycobactéries rugueuses et à croissance lente. Les M. fortuitum et M. brumae rugueux et à croissance rapide ont été ajoutés à la procédure et, enfin, le morphotype lisse de M. abscessus a également été inclus. Ces quatre espèces nous permettent de visualiser un large spectre de lipides dérivés de mycobactéries tels que les acyltréhalose...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Un protocole simple considéré comme la méthode de référence pour l’extraction de composés lipidiques non liés par cocovalence de la paroi cellulaire mycobactérielle est présenté. Une visualisation plus poussée par des TLC unidimensionnels et bidimensionnels à partir des lipides extraits de quatre mycobactéries différentes est montrée.

Deuxmélanges combinés consécutifs de chloroforme et de méthanol pour récupérer la teneur lipidique des cellules mycobactériennes est le mélange de sol...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Cette recherche a été financée par le ministère espagnol de la Science, de l’Innovation et des Universités (RTI2018-098777-B-I00), les Fonds FEDER et la Generalitat de Catalogne (2017SGR-229). Sandra Guallar-Garrido est titulaire d’un contrat de doctorat (FI) de la Generalitat de Catalunya.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Acide acétiqueMerck100063ATTENTION. Anhydre pour l’analyse EMSURE® ; ACS,ISO,Reag. Ph Eur
AcétoneCarlo Erba400971NMISE EN GARDE. ACÉTONE RPE-ACS-ISO POUR ANALYS ml 1000
AnthroneMerck8014610010Anthrone pour la synthèse.
BenzeneCarlo Erba426113PRUDENCE. Benzène RPE - Pour analyse - ACS 2,5 l
Tube en verre capillaireMerckBR708709BRAND® ;   ; jetable BLAUBRAND® ;   ; micropipettes, intraMark
ChloroformeCarlo Erba412653ATTENTION. Chloroforme RS - Pour HPLC - Qualité isocratique - Stabilisé à l’éthanol 2,5 L
Chauffe-moteur secJ.P. Selecta7471200
DiclorométhaneCarlo Erba412622ATTENTION. Dichlorométhane RS - Pour HPLC - Qualité isocratique - Stabilisé avec de l’amylène 2,5 L
Éther diéthyliqueCarlo Erba412672ATTENTION. Éther diéthylique RS - Pour HPLC - Qualité isocratique - Non stabilisé 2,5 L
Acétate d’éthylepanréac1313181211ATTENTION. Acétate d’éthyle (Reag. USP, Ph. Eur.) pour l’analyse, ACS, ISO,
Alcool éthylique, Absolu,Carlo Erba4146072ATTENTION. EPR anhydre absolu d’éthanol - Pour analyse - ACS - Reag. Ph.Eur. - Reag. USP 1 L
Entonnoir en verreVidraFOCDURA.2133148 1217/1
Tube en verreVidraFOCVFOC.45066A-16125Tube en verre avec bouchon en PTFE récupéré
MéthanolCarlo Erba412722ATTENTION. Méthanol RS - Pour HPLC - GOLD -
Hydrate d’acide molybdatophosphoriqueMerck51429-74-4ATTENTION.
Réactif de pulvérisation de bleu de molybdène, 1,3 %SigmaM1942-100MLATTENTION.
n-hexaneCarlo Erba446903ATTENTION. n-Hexane 99 % RS - ATRASOL - Pour l’analyse des traces 2,5 L
n-nitroso-n-méthyluréeSigmaN4766ATTENTION
Plate-forme d’agitation orbitaleDDBiolab995018NB-205L incubateur à secouer de paillasse
Éther de pétrole (60-80º ; C)Carlo Erba427003PRUDENCE. Éther de pétrole 60 - 80° ; C RPE - Pour analyse 2,5 L
PulvérisateurVidraFOC712/1
Sulfate de sodium anhydreMerck238597
Acide sulfurique 95-97 %Merck1007311000ATTENTION. Acide sulfurique 95-97 %
Chambre TLCMerckZ204226-1EARéservoirs de développement TLC rectangulaires, complets L & times ; H & fois ; L 22 cm & temps ; 22 cm & temps ; Plaque TLC 10 cm
Merck1057210001TLC SilicaGel 60- 20x20 cm x 25 u
Plaque chauffante TLCCAMAG223306CAMAG TLC Plat Heater III
ToluèneCarlo Erba488551ATTENTION. Toluène RPE - Pour l’analyse - ISO - ACS - Reag.Ph.Eur. - Reag.USP 1 L
VortexFisher Scientific10132562IKA  ; Agitador IKA vó ; rtex 3
1-naphtolSigma-Aldrich102269427ATTENTION.
, de qualité Ultragradient 2,5 L

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Watanabe, M., et al. Location of functional groups in mycobacterial meromycolate chains; the recognition of new structural principles in mycolic acids. Microbiology. 148 (6), 1881-1902 (2002).
  2. Global Health Organization World Health Organization. (2018) Global tuberculosis report. WHO. , (2019).
  3. Jackson, M. The Mycobacterial cell envelope-lipids. Cold Spring Harbor Perspectives in Medicine. 4 (10), 1-36 (2014).
  4. Jankute, M., et al. The role of hydrophobicity in tuberculosis evolution and pathogenicity. Scientific Reports. 7 (1), 1315(2017).
  5. Reed, M. B., Gagneux, S., DeRiemer, K., Small, P. M., Barry, C. E. The W-Beijing lineage of Mycobacterium tuberculosis overproduces triglycerides and has the DosR dormancy regulon constitutively upregulated. Journal of Bacteriology. 189 (7), 2583-2589 (2007).
  6. Ly, A., Liu, J. Mycobacterial virulence factors: Surface-exposed lipids and secreted proteins. International Journal of Molecular Sciences. 21 (11), 3985(2020).
  7. Szulc-Kielbik, I., et al. Severe inhibition of lipooligosaccharide synthesis induces TLR2-dependent elimination of Mycobacterium marinum from THP1-derived macrophages. Microbial Cell Factories. 16 (1), 217(2017).
  8. Ren, H., et al. Identification of the lipooligosaccharide biosynthetic gene cluster from Mycobacterium marinum. Molecular Microbiology. 63 (5), 1345-1359 (2007).
  9. Roux, A. L., et al. The distinct fate of smooth and rough Mycobacterium abscessus variants inside macrophages. Open Biology. 6 (11), 160185(2016).
  10. Guallar-Garrido, S., Julián, E. Bacillus Calmette-Guérin (BCG) therapy for bladder cancer: An update. ImmunoTargets and Therapy. 9, 1-11 (2020).
  11. Bach-Griera, M., et al. Mycolicibacterium brumae is a safe and non-toxic immunomodulatory agent for cancer treatment. Vaccines. 8 (2), 2-17 (2020).
  12. Noguera-Ortega, E., et al. Nonpathogenic Mycobacterium brumae inhibits bladder cancer growth in vitro, ex vivo, and in vivo. European Urology Focus. 2 (1), 67-76 (2015).
  13. Noguera-Ortega, E., et al. Mycobacteria emulsified in olive oil-in-water trigger a robust immune response in bladder cancer treatment. Scientific Reports. 6, 27232(2016).
  14. Rodríguez-Güell, E., et al. The production of a new extracellular putative long-chain saturated polyester by smooth variants of Mycobacterium vaccae interferes with Th1-cytokine production. Antonie van Leeuwenhoek. 90, 93-108 (2006).
  15. Garcia-Vilanova, A., Chan, J., Torrelles, J. B. Underestimated manipulative roles of Mycobacterium tuberculosis cell envelope glycolipids during infection. Frontiers in Immunology. 10, (2019).
  16. Yang, L., et al. Changes in the major cell envelope components of Mycobacterium tuberculosis during in vitro growth. Glycobiology. 23 (8), 926-934 (2013).
  17. Guallar-Garrido, S., Campo-Pérez, V., Sánchez-Chardi, A., Luquin, M., Julián, E. Each mycobacterium requires a specific culture medium composition for triggering an optimized immunomodulatory and antitumoral effect. Microorganisms. 8 (5), 734(2020).
  18. Venkataswamy, M. M., et al. et al. In vitro culture medium influences the vaccine efficacy of Mycobacterium bovis BCG. Vaccine. 30 (6), 1038-1049 (2012).
  19. Secanella-Fandos, S., Luquin, M., Pérez-Trujillo, M., Julián, E. Revisited mycolic acid pattern of Mycobacterium confluentis using thin-layer chromatography. Journal of Chromatography B. 879, 2821-2826 (2011).
  20. Minnikin, D. E., et al. Analysis of mycobacteria mycolic acids. Topics in Lipid Research: From Structural Elucidation to Biological Function. , CPC Press. London, UK. 139-143 (1986).
  21. Minnikin, D. E., Hutchinson, I. G., Caldicott, A. B., Goodfellow, M. Thin-layer chromatography of methanolysates of mycolic acid-containing bacteria. Journal of Chromatography A. 188 (1), 221-233 (1980).
  22. Minnikin, D. E., Goodfellow, M. Lipid composition in the classification and identification of acid-fast bacteria. Society for Applied Bacteriology Symposium Series. 8, 189-256 (1980).
  23. Muñoz, M., et al. Occurrence of an antigenic triacyl trehalose in clinical isolates and reference strains of Mycobacterium tuberculosis. FEMS Microbiology Letters. 157 (2), 251-259 (1997).
  24. Daffé, M., Lacave, C., Lanéelle, M. A., Gillois, M., Lanéelle, G. Polyphthienoyl trehalose, glycolipids specific for virulent strains of the tubercle bacillus. European Journal of Biochemistry. 172 (3), 579-584 (1988).
  25. Singh, P., et al. Revisiting a protocol for extraction of mycobacterial lipids. International Journal of Mycobacteriology. 3 (3), 168-172 (2014).
  26. Camacho, L. R., et al. Analysis of the phthiocerol dimycocerosate locus of Mycobacterium tuberculosis. Evidence that this lipid is involved in the cell wall permeability barrier. Journal of Biological Chemistry. 276 (23), 19845-19854 (2001).
  27. Dhariwal, K. R., Chander, A., Venkitasubramanian, T. A. Alterations in lipid constituents during growth of Mycobacterium smegmatis CDC 46 and Mycobacterium phlei ATCC 354. Microbios. 16 (65-66), 169-182 (1976).
  28. Chandramouli, V., Venkitasubramanian, T. A. Effect of age on the lipids of mycobacteria. Indian Journal of Chest Diseases & Allied Sciences. 16, 199-207 (1982).
  29. Hameed, S., Sharma, S., Fatima, Z. Techniques to understand mycobacterial lipids and use of lipid-based nanoformulations for tuberculosis management. NanoBioMedicine. , Springer. Singapore. (2020).
  30. Folch, J., Lees, M., Sloane Stanley, G. H. A simple method for the isolation and purification of total lipides from animal tissues. The Journal of Biological Chemistry. 226 (1), 497-509 (1957).
  31. Pal, R., Hameed, S., Kumar, P., Singh, S., Fatima, Z. Comparative lipidome profile of sensitive and resistant Mycobacterium tuberculosis strain. International Journal of Current Microbiology and Applied Sciences. 1 (1), 189-197 (2015).
  32. Slayden, R. A., Barry, C. E. Analysis of the lipids of Mycobacterium tuberculosis. Mycobacterium tuberculosis Protocols. 54, 229-245 (2001).
  33. Ojha, A. K., et al. Growth of Mycobacterium tuberculosis biofilms containing free mycolic acids and harbouring drug-tolerant bacteria. Molecular Microbiology. 69 (1), 164-174 (2008).
  34. Ojha, A. K., Trivelli, X., Guerardel, Y., Kremer, L., Hatfull, G. F. Enzymatic hydrolysis of trehalose dimycolate releases free mycolic acids during mycobacterial growth in biofilms. The Journal of Biological Chemistry. 285 (23), 17380-17389 (2010).
  35. Layre, E., et al. Mycolic acids constitute a scaffold for mycobacterial lipid antigens stimulating CD1-restricted T cells. Chemistry and Biology. 16 (1), 82-92 (2009).
  36. Llorens-Fons, M., et al. Trehalose polyphleates, external cell wall lipids in Mycobacterium abscessus, are associated with the formation of clumps with cording morphology, which have been associated with virulence. Frontiers in Microbiology. 8, (2017).
  37. Butler, W. R., Guthertz, L. S. Mycolic acid analysis by high-performance liquid chromatography for identification of mycobacterium species. Clinical Microbiology Reviews. 14 (4), 704-726 (2001).
  38. Teramoto, K., et al. Characterization of mycolic acids in total fatty acid methyl ester fractions from Mycobacterium species by high resolution MALDI-TOFMS. Mass Spectrometry. 4 (1), 0035(2015).
  39. Sartain, M. J., Dick, D. L., Rithner, C. D., Crick, D. C., Belisle, J. T. Lipidomic analyses of Mycobacterium tuberculosis based on accurate mass measurements and the novel "Mtb LipidDB". Journal of Lipid Research. 52 (5), 861-872 (2011).
  40. Li, M., Zhou, Z., Nie, H., Bai, Y., Liu, H. Recent advances of chromatography and mass spectrometry in lipidomics. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 399 (1), 243-249 (2011).
  41. Nahar, A., Baker, A. L., Nichols, D. S., Bowman, J. P., Britz, M. L. Application of Thin-Layer Chromatography-Flame Ionization Detection (TLC-FID) to total lipid quantitation in mycolic-acid synthesizing Rhodococcus and Williamsia species. International Journal of Molecular Sciences. 21 (5), 1670(2020).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Mycobacteria LipidsLipid ExtractionThin Layer ChromatographyMycolic Acid AnalysisMycobacterial Cell WallOrganic Solvent ExtractionOne Dimensional TLCTwo Dimensional TLCPhenolic GlycolipidsGlycopeptidolipids

Related Articles