Dans ce protocole, nous présentons les procédures expérimentales d’un essai de propagation cellulaire qui est basé sur la microscopie à cellules vivantes. Nous fournissons un outil de calcul open-source pour la segmentation impartiale des cellules étiquetées fluorescentement et l’analyse quantitative de la dynamique de lamellipodia pendant la propagation cellulaire.
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Article de méthode
Analyse quantitative de la dynamique des bords cellulaires pendant la propagation cellulaire
* These authors contributed equally
Dans cet article
Résumé
Résumé
La propagation cellulaire est un processus dynamique dans lequel une cellule suspendue dans le corps se fixe à un substrat et s’aplatit d’une forme arrondie à une forme mince et étalée. Après l’attachement cellule-substrat, la cellule forme une mince feuille de lamellipodie émanant du corps cellulaire. Dans la lamellipodie, les monomères globulaires d’actine (G-actin) polymérisent dans un maillage filamenteux dense d’actine (F-actin) qui pousse contre la membrane plasmatique, fournissant ainsi les forces mécaniques nécessaires à la propagation de la cellule. Notamment, les acteurs moléculaires qui contrôlent la polymérisation de l’actine dans la lamellipodie sont essentiels pour de nombreux autres processus cellulaires, tels que la migration cellulaire et l’endocytose.
Depuis que les cellules qui se propagent forment une lamellipodie continue qui s’étend sur toute la périphérie cellulaire et se dilatent constamment vers l’extérieur, les analyses de propagation cellulaire sont devenues un outil efficace pour évaluer la cinétique des saillies lamellipodial. Bien que plusieurs implémentations techniques de l’analyse de propagation cellulaire aient été développées, il manque actuellement une description détaillée du flux de travail, qui comprendrait à la fois un protocole étape par étape et des outils informatiques pour l’analyse des données. Ici, nous décrivons les procédures expérimentales de l’analyse de propagation cellulaire et présentons un outil open-source pour l’analyse quantitative et impartiale de la dynamique du bord cellulaire lors de la propagation. Lorsqu’il est combiné avec des manipulations pharmacologiques et / ou des techniques de silencing des gènes, ce protocole est approprié à un écran à grande échelle des acteurs moléculaires régulant les saillies lamellipodial.
Introduction
Les saillies lamellipodial sont des structures cytosquelettiques proéminentes formées à l’avant d’une cellule migrante. Dans la lamellipodia, la polymérisation de l’actine à l’aide du complexe Arp2/3 et des formins crée un maillage d’actine ram ramifère à croissance rapide qui pousse contre la membraneplasmatique 1,2. La force de poussée générée par le maillage actin propulse physiquement la cellule versl’avant 1,3,4,5. L’épuisement du complexe Arp2/3 ou la perturbation des voies de ....
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Protocole
1. Ensemencement cellulaire
REMARQUE : Le protocole décrit de propagation cellulaire a été exécuté utilisant des fibroblastes embryonnaires de souris (MEFs) exprimant PH-Akt-GFP (un marqueur fluorescent pour PIP3/PI(3,4)P2). Cette lignée cellulaire a été générée par l’intégration génomique d’une construction d’expression pour PH-Akt-GFP (Addgene #21218) par l’édition de gènes à 200 200 %. Cependant, d’autres marqueurs fluorescents qui sont exprimés transitoirement ou intégrés dans le génome peuvent également être utilisés dans cet essai. Pour une segmentation optimale de l’image, nous vous recommandons d’utiliser des mar....
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Résultats
Le protocole ci-dessus décrit les procédures expérimentales pour l’imagerie des cellules vivantes des cellules de propagation et un outil de calcul pour l’analyse quantitative de la dynamique de propagation cellulaire. L’outil de calcul peut être utilisé dans un format à faible ou à haut débit pour identifier les acteurs moléculaires régulant les machines de polymérisation de l’actine à l’avant-garde cellulaire.
La représentation schématique des procédures expérimentales est représentée à la <.......
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Discussion
L’analyse de propagation cellulaire décrite permet le suivi continu des changements morphologiques(p. ex., taille et forme des cellules) et des mouvements des bords cellulaires(c.-à-d. vitesse de saillie et fréquence de rétractation), qui sont des caractéristiques manquantes dans la plupart des protocoles depropagation cellulaire 19,24. Bien que les analyses de propagation cellulaires à point final couramment utilisées permettent de déterminer l.......
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Déclarations de divulgation
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Remerciements
Ces travaux ont été appuyés par le Prix du nouvel enquêteur du Fonds Connaught à S.P., la Fondation canadienne pour l’innovation, le Programme de subventions à la découverte du CSERN (subventions RGPIN-2015-05114 et RGPIN-2020-05881), le Fonds conjoint de recherche de l’Université de Manchester et de l’Université de Toronto et le Programme XSeed de l’Université de Toronto.
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| 0,05 % de trypsine (0,05 %), 0,53 mM EDTA | Wisent Bioproducts | 325-042-CL | |
| Boîte de Pétri de 10,0 cm, polystyrène, traitée TC, ventilée | Starstedt | 83.3902 | |
| 15 mL Tube à centrifuger en PP haute clarté, fond conique, avec bouchon à vis d’étanchéité en dôme, Sterile | Falcon | 352097 | |
| 1 puits Chamlide CMS pour lamelle de 22 mm x 22 mm | Quorum Technologies | CM-S22-1 | |
| Boîte de culture cellulaire de 35 mm traitée TC de style facile | à saisir Falcon | 353001 | |
| Tube à centrifuger de 50 ml, transparent, Plug Seal | Nest | 602002 | |
| Boîtes de culture cellulaire de 6,0 cm traitées pour une meilleure fixation cellulaire, | VWR | 10861-658 | |
| Arp2/3 stérile I, Caméra | 182515 | Millipore Sigma | |
| Objectif principal 95B-25MM | Photometrics | ||
| Dimethyl Sulfoxide, Stérile | BioShop | DMS666 | |
| DMEM, 1x, 4,5 g/L de glucose, avec L-Glutamine, Pyruvate de sodium et Rouge de Phénol | Wisent Bioproducts | 319-005 CL | |
| DMEM/F-12, HEPES, Sans Rouge Phénol | Gibco | 11039021 | |
| D-PBS, 1X | Wisent Bioproducts | 311-425 CL | |
| Sérum fœtal bovin | Wisent Bioproducts | 080-110 | |
| Fiji Software | ImageJ | ||
| HEPES (1 M) | Gibco | 15630080 | |
| Plasma humain Fibronectine Protéine purifiée 1 mg | Millipore Sigma | FC010 | |
| Huile d’immersion | Cargille | 16241 | |
| L-Glutamine Solution (200 mM) | Wisent Bioproducts | 609-065-EL | |
| MEM Solution d’acides aminés non essentiels (100X) | Gibco | 11140050 | |
| Micro Cover Glasses, carré, n° 11/2 22 x 22 mm VWR | CA48366-227-1 | ||
| Corps de microscope, Eclipse Ti2-E | |||
| , CFI Plan Apo Lambda 60X Huile | Nikon | MRD01605 | |
| Pénicilline-Streptomycine | Sigma | P4333 | |
| Disque tournant, Crest Light V2 | CrestOptics | ||
| Spyder | Anaconda | ||
| Stage top incubateur | Tokai Hit | ||
| Statistics Software, prisme | GraphPad | ||
| pince à épiler, Style 2 | Electron Microscopy Sciences | 78326-42 |
Références
- Mullins, R. D., Heuser, J. A., Pollard, T. D. The interaction of Arp2/3 complex with actin: Nucleation, high affinity pointed end capping, and formation of branching networks of filaments. Proceedings of the National Academy of Sciences. 95 (11), 6181-6186 (1998).
- Yang, C., Czech, L., Gerboth, S., Kojima, S., Scita, G., Svitkina, T.
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Réimpressions et autorisations
