Cette étude décrit comment disséquer le sac endolymphatique de l’oreille interne de la souris à différents âges. Le résultat d’une dissection similaire est montré dans un modèle murin Slc26a4-null d’élargissement du sac endolymphatique. Une souris transgénique avec un rapporteur fluorescent exprimé dans le sac endolymphatique est présentée comme un modèle permettant de visualiser facilement le sac endolymphatique, et un outil éducatif.
Article de méthode
Dissection du sac endolymphatique de souris
* These authors contributed equally
Dans cet article
Résumé
Résumé
L’étude de modèles murins mutants de troubles de l’audition et de l’équilibre chez l’homme a mis en évidence de nombreux changements structurels et fonctionnels qui peuvent contribuer aux phénotypes humains. Bien que d’importants progrès aient été réalisés dans la compréhension du développement et de la fonction de l’épithélium neurosensoriel de la cochlée et du vestibula, les connaissances disponibles concernant le développement, la composition cellulaire, les voies moléculaires et les caractéristiques fonctionnelles du sac endolymphatique sont limitées. Cela est dû en grande partie à la difficulté de visualiser et de microdisséquer ce tissu, qui est un épithélium composé d’une seule couche cellulaire. L’étude présentée ici décrit une approche permettant d’accéder et de microdisséquer le sac endolymphatique de l’oreille interne de la souris de type sauvage à différents âges. Le résultat d’une dissection similaire est montré dans un modèle murin déficient en pendrine de l’élargissement de l’aqueduc vestibulaire. Une souris transgénique avec un sac endolymphatique fluorescent est présentée. Cette souris rapporteure peut être utilisée pour visualiser facilement le sac endolymphatique avec une dissection limitée et déterminer sa taille. Il peut également être utilisé comme outil pédagogique pour enseigner comment disséquer le sac endolymphatique. Ces procédures de dissection devraient faciliter la caractérisation de cette partie peu étudiée de l’oreille interne.
Introduction
L’oreille interne des mammifères se compose de la cochlée, du saccule, de l’utricule, de trois canaux semi-circulaires et du sac endolymphatique (Figure 1A). Ces organes comprennent un épithélium continu rempli de liquide appelé labyrinthe membraneux, avec des organes adjacents se connectant directement ou par de petites structures de canal telles que le canal reuniens, le canal sacculaire, le canal utriculaire ou le canal endolymphatique. Comparé à d’autres organes de l’oreille interne, le sac endolymphatique présente des caractéristiques uniques. Tout d’abord, il manque de cellules épithéliales sensorielles. Au lieu de cela, le sac endolymphatique a des cellules spécialisées pour le transport d’ions. Deuxièmement, bien que le labyrinthe membraneux soit enfermé dans le labyrinthe osseux, le sac endolymphatique est une exception, dépassant partiellement de l’os pétreux et dans la cavité intracrânienne. Cette morphologie semble être très conservée au cours de l’évolution de l’oreille interne. Troisièmement, le sac endolymphatique est la première structure à se développer à partir de l’otocyste à un stade embryonnaire précoce avant la formation d’autres organes. De plus, plusieurs pathologies ont été associées à une hypertrophie du sac endolymphatique ou à un compartiment endolymphatique anormal. La présence de variants pathogènes dans SLC26A4 (également connu sous le nom de gène pendrin) conduit à une forme relativement fréquente de perte auditive neurosensorielle, causée par l’élargissement du sac endolymphatique associé à la présence d’un aqueduc vestibulaire élargi (EVA)1. Lorsqu’il est associé au goitre, il est appelé syndrome de Pendred 2,3. La maladie de Ménière est également considérée par certains comme associée à une anomalie du compartiment endolymphatique (hydrops)4. Les caractéristiques uniques du sac endolymphatique et les pathologies associées à un changement de sa morphologie sont compatibles avec un rôle critique pour le développement et l’entretien de l’oreille interne.
Malgré son importance, les connaissances sont encore limitées concernant le développement, la composition cellulaire, les voies moléculaires et les caractéristiques fonctionnelles du sac endolymphatique. Cela est dû au moins en partie à la difficulté de visualiser et de microdisséquer ce tissu. Le sac endolymphatique est une structure en forme de poche, composée d’une seule couche de cellules épithéliales, souvent translucide et très difficile à identifier à partir du tissu conjonctif qui l’entoure par stéréomicroscopie optique. Bien qu’un petit nombre de chercheurs aient développé des techniques de dissection complète et publié leurs résultats expérimentaux 5,6,7,8,9,10, il n’existe aucune publication portant sur les détails techniques de cette procédure.
Dans cette étude, les approches de microdissection développées pour accéder et isoler le sac endolymphatique de l’oreille interne de la souris de type sauvage à différents âges, en monture entière, sont décrites. Les résultats d’une dissection similaire sont montrés dans un modèle murin, sans expression de SLC26A4, qui présente une hypertrophie du canal endolymphatique et du sac. Une lignée de souris avec un transgène codant pour une recombinase Cre exprimée dans le sac endolymphatique est rapportée. En présence d’un rapporteur fluorescent de l’expression de Cre, ici tdTomato, la fluorescence peut être utilisée pour visualiser facilement le sac endolymphatique avec une dissection limitée et pour obtenir des informations sur sa taille. Cette ligne de souris rapporteure peut également être utilisée comme outil pédagogique pour pratiquer et perfectionner les dissections de sac endolymphatique. La capacité de disséquer le tissu du sac endolymphatique devrait faciliter une caractérisation plus poussée de ce composant sous-étudié mais essentiel de l’oreille interne.
Protocole
Toutes les expériences et procédures sur les animaux ont été effectuées conformément aux protocoles approuvés par les comités de soin et d’utilisation des animaux de l’Institut national des maladies neurologiques et des accidents vasculaires cérébraux/Institut national de la surdité et autres troubles de la communication (#1264) et le Comité institutionnel de soin et d’utilisation des animaux de l’Université de médecine et de dentisterie de Tokyo (A2020-058A).
REMARQUE : Souris C57BL/6J (numéro de stock n° 000664), Pds-/-également connues sous le nom de souris Slc26a4-/- (129S-Slc26a4 tm1Egr/AjgJ, n° 018424) 11, B6 ; Les souris CBA-Tg(ATP6V1B1-Cre)1Rnel/Mm 12 et Ai9(LSL-RCL-tdT) (B6.Cg-Gt(ROSA)26Sortm9(CAG-tdTomato)Hze, n° 007909)13 sont disponibles auprès du Jackson Laboratory et sur demande. Toutes les procédures de génotypage ont déjà été décrites. B6 ; Des souris CBA-Tg(ATP6V1B1-Cre)1Rnel/Mm précédemment rétrocroisées avec la souche C57BL/6J pendant au moins cinq générations, ont été sélectionnées pour des expériences. Les animaux des deux sexes peuvent être étudiés avec cette approche sans différence évidente. Le premier jour après l’accouplement nocturne est compté comme le jour embryonnaire 0,5 (E0,5).
1. Prélèvement et fixation de l’oreille interne intacte dans le crâne
- Euthanasier un animal de laboratoire ou une mère gestante à l’aide d’une procédure approuvée par l’établissement, par exemple en utilisant l’inhalation de CO2 . Passez sous une hotte si possible pour éviter ou minimiser la propagation des allergènes de souris. Après avoir vérifié l’absence de réponse à des stimuli douloureux tels que des pincements de patte ou de queue, décapitez l’animal. Pour une mère enceinte depuis longtemps, la luxation cervicale peut être utilisée comme alternative à la décapitation si ses oreilles internes ne sont pas utilisées pour d’autres expériences.
- Récoltez les embryons par laparotomie14 à l’aide de ciseaux artériels avec une pointe sphérique pour protéger les embryons pendant le processus. Manipulez les embryons à l’aide d’une pince à anneau. Placez les cornes utérines dans 4 °C PBS sur de la glace et isolez chaque embryon comme décrit précédemment15 avant de les décapiter.
- Coupez la tête en deux de l’arrière vers l’avant : incisez d’abord le haut de la tête en incisant d’abord la peau, puis le haut du crâne, en incisant environ un tiers à chaque coupe afin qu’il n’y ait pas de flexion du crâne. Coupez ensuite le bas du crâne d’un seul coup.
REMARQUE : Pour les embryons, l’utilisation d’une lame tranchante, plutôt que de ciseaux, est conseillée. Il est essentiel qu’à tous les âges, le crâne ne soit pas déformé lors de sa coupe en deux. - Sans toucher ni plier le crâne, retirez soigneusement l’hémi-encéphale pour révéler le labyrinthe osseux (Figure 1B, Figure supplémentaire 1A-B).
- Pour les souris postnatales 5 ou plus, transectez le conduit auditif externe et tirez la peau vers l’avant vers le nez. Coupez le crâne autour de l’oreille interne (figure supplémentaire 1C).
- Transférez les deux hémi-crânes de chaque animal avec l’oreille interne, aussi intacts que possible, dans un flacon ou un tube en verre contenant 10 ml de paraformaldéhyde (PFA) à 4 °C 4 % dilué dans 1 fois PBS et conservez-le sur de la glace sous une hotte.
REMARQUE : N’essayez pas de retirer l’oreille interne du crâne à cette étape, car cela pourrait endommager le canal endolymphatique et le sac ce faisant. - Incuber pendant 1 h à 4 °C sur un agitateur à bascule. Si vous travaillez avec des tissus d’un animal avec un rapporteur fluorescent, conservez le tube contenant l’échantillon dans du papier d’aluminium ou dans une boîte pour minimiser l’exposition à la lumière.
REMARQUE : Si vous souhaitez étudier les microtubules et les molécules associées, la fixation des tissus doit être effectuée à température ambiante (RT) avec un fixateur RT. - Jetez le PFA dans un récipient approprié dans une hotte. Laver trois fois avec 10 mL de 1x PBS pendant 15 min à chaque fois sur un shaker à bascule à RT pour éliminer le fixateur avant la dissection.
2. Microdissection du sac endolymphatique
- Transférer chaque préparation de l’oreille interne dans une boîte de culture tissulaire de 35 mm contenant 1x PBS.
- Placez la préparation dans le plat de manière à ce que la racine du 8ème nerf crânien soit orientée vers le haut. Maintenez le tissu dans cette position en saisissant la cochlée à l’aide d’une pince #4 (Figure 1C).
- Identifier les points de repère importants : l’aqueduc vestibulaire, les canaux semi-circulaires antérieur et postérieur, les crus communs et le sinus sigmoïde (veine) (Figure 1D).
REMARQUE : Le sac endolymphatique chez la souris de type sauvage est translucide et difficile à visualiser. Pour réussir la microdissection du sac endolymphatique, il est important de comprendre son anatomie et sa localisation (Figure 1E). - Incisez la dure-mère et l’aqueduc vestibulaire, ainsi que les tissus conjonctifs sous-jacents entourant le sac endolymphatique, à l’aide d’une aiguille de 27 G sur une seringue de 1 mL (figures 1D, F).
REMARQUE : Pour une souris adulte, la décalcification de la préparation à l’aide d’EDTA à 10% (pH 7,4) avant la microdissection est utile, mais pas indispensable, pour faciliter l’incision de l’aqueduc vestibulaire. Pour la dissection d’un sac endolymphatique ouvert datant de plus de 5 jours postnatals, il est recommandé de positionner la ligne d’incision sur l’aqueduc vestibulaire légèrement en avant pour faire une incision dans la lumière du sac endolymphatique (Figure 2A). - Tenez le tissu conjonctif situé latéralement au sac endolymphatique à l’aide d’une pince et tirez le tissu vers le haut pour le décoller de l’os temporal (Figure 1G).
- Retirez soigneusement tous les débris restants. La préparation comprend généralement l’épithélium du sac endolymphatique, les tissus conjonctifs environnants, une partie de l’aqueduc vestibulaire et le sinus sigmoïde (Figure 1H-I). Si nécessaire, séparez l’épithélium du sac endolymphatique des tissus environnants (Figure 1J).
- (Facultatif) Pour la dissection du sac endolymphatique ouvert, tenez la partie tige de la préparation de manière à ce que la section transversale de la lumière puisse être observée. Insérez une aiguille de 27 G dans la lumière et déplacez-la pour couper le sac endolymphatique en deux feuilles (Figure 2B-C). Tenez le bord de chaque tissu en forme de feuille à l’aide d’une pince et séparez-les les uns des autres (Figure 2D-F).
3. Immunohistochimie
- Après la microdissection, utilisez la pince #5 pour transférer les sacs endolymphatiques dans une plaque de verre à 9 puits.
- À l’aide du microscope pour vous assurer que les sacs endolymphatiques restent intacts, utilisez une pipette de 200 μL pour prélever tous les 1x PBS sauf une goutte contenant le tissu. Ajouter 200 μL de solution de perméabilisation et de blocage (1x PBS avec 0,15% de Triton X-100 (PBS-TX) et 5% d’albumine sérique bovine (BSA)) et incuber pendant 1 h à RT sur un agitateur orbital.
- Après avoir retiré toute la solution de blocage à l’exception d’une goutte contenant le tissu, ajoutez 200 μL d’anticorps primaires et incubez toute la nuit à 4 °C. Les anticorps anti-pendrine6 dilués 1:1000 dans une solution bloquante peuvent être utilisés pour identifier les cellules riches en mitochondries du sac endolymphatique, bien qu’une faible expression soit également observée dans un sous-ensemble de cellules riches en ribosomes16 (Figure 5).
- Après trois lavages dans 1x PBS pendant 15 min à RT, incuber avec des anticorps secondaires. Pour le marquage présenté ici, incubez 200 μL d’anticorps secondaires conjugués à un colorant fluorescent, dilués à partir du stock commercial à 1:500 dans une solution bloquante, avec le tissu sur une plate-forme à bascule pendant 1 h à RT dans l’obscurité. La phalloïdine conjuguée à un colorant fluorescent, qui reconnaît la β-actine (ACTB), peut être utilisée pour mettre en évidence la présence du sac et du canal endolymphatiques ainsi que du tissu conjonctif qui les entoure (Figure 5A, C, F-G).
- Montez les sacs endolymphatiques entre une lame de verre et une lamelle à l’aide d’un support de montage anti-décoloration avec DAPI. Après avoir laissé sécher les lames à l’abri de la lumière pendant 1 h à RT, appliquez du vernis transparent à la jonction entre la lamelle et la lame de verre pour les sceller et limiter la formation de bulles d’air. Si vous essayez de visualiser la distribution différentielle des protéines à la surface apicale par rapport à la surface basolatérale des cellules épithéliales, il est recommandé d’ouvrir le sac pendant l’étape de montage en incisant un bord et en l’ouvrant.
- Image à l’aide d’un microscope confocal. Visualisez d’abord les préparations de sacs endolymphatiques avec un objectif 10x pour fournir une vue globale de l’étiquetage du sac (Figure 5A-D). Ensuite, utilisez un objectif 63x pour obtenir une vue détaillée de la distribution de la protéine d’intérêt dans les cellules riches en mitochondries et en ribosomes du sac endolymphatique (Figure 5F-G).
Résultats
Chaque étape de cette microdissection d’un sac endolymphatique de type sauvage d’une souris postnatale du jour 5 (P5) est détaillée dans la vidéo associée et des instantanés des étapes clés de cette dissection et de l’ouverture du sac endolymphatique sont présentés dans la figure 1 et la figure 2.
Les résultats représentatifs des dissections du sac endolymphatique avec fluorescence tdTomato au jour embryonnaire 16,5 (E16.5), P5 et P30, suivant ce protocole sont présentés à la figure 3 et à la figure supplémentaire 1 et à la figure supplémentaire 2. À l’aide d’un microscope de dissection à fluorescence, le sac endolymphatique peut être facilement visualisé dans le crâne après l’ablation du cerveau chez les souris porteuses du transgène Tg(ATP6V1B1-Cre) en présence du rapporteur de l’expression de Cre : Ai9 (LSL-RCL-tdT) (voir la figure 3A-B et la figure supplémentaire 1 pour les images capturées en lumière incidente et la fluorescence tdTomato du sac endolymphatique à différents stades de la dissection). Chez ces souris, Cre est exprimé sous la forme d’une mosaïque dans les cellules tout au long du sac et du canal endolymphatiques (Figure 3, voir aussi la Figure supplémentaire 2 pour la visualisation du sac endolymphatique avec ou sans rapporteur fluorescent). Bien que l’expression de ce rapporteur ne soit pas spécifique de l’expression endogène d’Atp6v1b1, qui est limitée aux cellules riches en mitochondries du sac endolymphatique16, l’un des deux types de cellules de cet épithélium (Figure 5E), il s’agit d’une aide utile pour identifier et disséquer le sac endolymphatique.
Des oreilles internes disséquées à partir d’un modèle de souris pour l’élargissement de l’aqueduc vestibulaire sont présentées à la figure 4. Par rapport aux compagnons de portée témoins, les sacs et les canaux endolymphatiques des souris déficientes en SLC26A4 (pendrine) sont élargis.
Des images représentatives de l’immunohistochimie d’un sac endolymphatique intact avec et sans tissu conjonctif sont présentées à la figure 5. Les résultats de l’immunohistochimie du sac endolymphatique ouvert d’une souris de type sauvage P5 sont également présentés (Figure 5F-G). Le sac endolymphatique est composé d’une seule couche d’épithélium pliée dans une structure en forme de poche, contenant dans sa lumière l’endolymphe. Cet épithélium est constitué de deux types de cellules, les cellules riches en mitochondries et les cellules riches en ribosomes (Figure 5E). Un sac endolymphatique complet sera aplati parce que l’endolymphe n’est plus présente. Le sac apparaîtra comme deux couches entrelacées d’épithélium, ce qui rendra difficile la détermination de la localisation subcellulaire des protéines exprimées dans cet épithélium. En ouvrant le sac endolymphatique, l’épithélium monocouche peut être facilement visualisé et la distribution relative des protéines d’intérêt, par rapport à la lumière du sac endolymphatique, peut être déterminée de manière plus définitive. Un enrichissement apical potentiel (luminal, où se trouverait l’endolymphe) par rapport à l’enrichissement basal de ces protéines peut être déterminé avec plus de précision. À titre d’exemple, SLC26A4 est enrichi du côté apical des cellules riches en mitochondries (Figure 5F).
Graphique 1. Dissection complète du sac endolymphatique d’une souris de type sauvage au 5e jour postnatal (P5).
(A) Schéma du labyrinthe membraneux d’une oreille interne de souris développée (à droite). L’emplacement du sac endolymphatique, de la cochlée et des structures vestibulaires sont indiqués. Cette figure a été modifiée de Honda et al.16.
(B) Coupe médio-sagittale montrant l’hémi-crâne gauche. L’emplacement du sac endolymphatique est indiqué (flèche). (O, occipital ; F, frontale)
(C) Capsule otique avec la partie squameuse de l’os temporal.
(D) Points de repère importants superposés sur la boîte pointillée du panneau C. (ES, sac endolymphatique ; DE, canal endolymphatique ; VA, aqueduc vestibulaire ; ASC, canal semi-circulaire antérieur ; CSP, canal semi-circulaire postérieur ; CC, crus communs ; SS, sinus sigmoïde)
(E) Illustration schématique de la coupe transversale avec la ligne blanche continue sur le panneau D à travers le sac endolymphatique. La face proximale du sac endolymphatique est recouverte d’un canal osseux appelé aqueduc vestibulaire, ainsi que le canal endolymphatique. Sur la face distale, le sac endolymphatique, entouré de tissu conjonctif (TDM), s’étend et fait saillie vers l’extérieur du labyrinthe osseux et est pris en sandwich entre la dure-mère (DM) et le sinus sigmoïde avec la partie squameuse de l’os temporal (TB).
(F) Une aiguille fine est utilisée pour couper autour du sac endolymphatique (en suivant les lignes jaunes pointillées sur le panneau D).
(G) La préparation est soigneusement retirée de l’os temporal en maintenant le tissu à la position indiquée par l’astérisque (*, également indiqué dans le panneau E) et en le décollant.
(H) Un sac endolymphatique entier isolé avec les tissus environnants.
(I) Version schématique de ce sac endolymphatique isolé avec les tissus environnants.
(J) Sac endolymphatique isolé sans tissus environnants.
Barres d’échelle : 2 mm (B), 1 mm (J). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Graphique 2. Dissection du sac endolymphatique ouvert d’une souris de type sauvage P5.
(A) À l’étape 2.4, la ligne d’incision sur l’aqueduc vestibulaire est positionnée légèrement en avant (ligne pointillée rouge) pour faire une incision dans la lumière du sac endolymphatique.
(B) Tenez la partie tige de la préparation, insérez une aiguille de calibre 27 dans la lumière et déplacez-la pour couper le sac endolymphatique en deux feuilles.
(C) Illustration schématique du panneau B.
(D) Tenez le bord de chaque feuille à l’aide d’une pince et séparez-les les unes des autres.
(E) Illustration schématique du panneau D.
(F) Le sac endolymphatique est séparé en deux feuilles, y compris l’épithélium et les tissus environnants. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Graphique 3. Dissection du R26LSL-RCL-tdT/+ ; Sac endolymphatique de souris Tg(ATP6V1B1-Cre)1Rnel/Mn à E16.5, P5 et P30. Toutes les images présentées montrent la fluorescence de tdTomato obtenue à l’aide d’un stéréomicroscope avec un objectif 1 x équipé pour la détection de la fluorescence de tdTomato.
(A, B) Coupe médio-sagittale du crâne d’un E16.5 R26LSL-RCL-tdT/+ ; Souris Tg(ATP6V1B1-Cre)1Rnel/Mn avant (A) et après (B) l’ablation du demi-cerveau. La fluorescence tdTomato décrit la position de l’oreille interne. Le sac endolymphatique est facilement visible même sans dissection (pointe de flèche).
(C, E, G) Oreilles internes isolées de souris E16.5, P5 et P30, respectivement.
(D, F et H) Images à plus fort grossissement des sacs et canaux endolymphatiques microdissqués correspondants. À P30, le canal endolymphatique est encapsulé dans l’os, ce qui le rend particulièrement difficile à isoler. Barres d’échelle : 2 mm (A, B, C, E, G), 500 μm (D, F, H). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Graphique 4. Anatomie macroscopique de la capsule otique avec un sac endolymphatique élargi. Oreilles internes des souris Slc26a4+/- (à gauche) et Slc26a4-/- (à droite) chez P105. L’aqueduc vestibulaire et le sac et le canal endolymphatiques (lignes pointillées noires) sont élargis chez la souris Slc26a4-/- par rapport à ceux d’une souris Slc26a4+/. Barre d’échelle : 2 mm. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Graphique 5. SLC26A4 l’expression de cellules riches en mitochondries dans l’épithélium du sac endolymphatique en E16.5 et P5.
(A, B) Sac endolymphatique isolé de souris E16.5 marquée avec un anticorps anti-SLC26A4 (vert) et une phalloïdine qui marque la β-actine (ACTB, rouge).
(C) Une image à faible grossissement du sac endolymphatique ouvert d’une souris P5 marquée avec un anticorps anti-SLC26A4 (vert). La phalloïdine (ACTB, rouge) peut être utilisée pour mettre en évidence la présence du sac endolymphatique ainsi que du tissu conjonctif qui l’entoure.
(D) Sac endolymphatique isolé marqué d’un anticorps anti-SLC26A4 (vert).
(E) Illustration schématique de l’épithélium du sac endolymphatique mettant en évidence la présence de deux types de cellules : les cellules riches en mitochondries, dont la surface apicale est recouverte de microvillosités, et les cellules riches en ribosomes.
(F-G) Images à fort grossissement de l’épithélium du sac endolymphatique à P5, après ouverture du sac endolymphatique et marquage avec un anticorps anti-SLC26A4 (vert) et de la phalloïdine (ACTB, rouge). Une image représentative au niveau de la membrane apicale est montrée en G, et une coupe transversale reconstruite à partir de la pile z au niveau de la ligne blanche ponctuée est montrée en F. Le noyau des cellules est marqué au DAPI (bleu).
Barres d’échelle : 100 μm (A, B) ; 200 μm (C, D) ; 20 μm (F, G). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure supplémentaire 1. Lumière incidente et images de fluorescence tdTomato correspondantes d’un P5 R26LSL-RCL-tdT/+ ; Tg(ATP6V1B1-Cre)1Rnel/Mn oreille interne de souris à trois étapes de la dissection. Le sac et le canal endolymphatiques peuvent être facilement visualisés à l’aide de la fluorescence tdTomato.
(A-B) Région de l’oreille interne dans la partie postérieure d’un demi-crâne intact d’un P5 R26LSL-RCL-tdT/+ ; Tg(ATP6V1B1-Cre)1Rnel/Mn souris.
(C-D) L’ablation de la peau et d’une partie du crâne permet une meilleure visualisation de la région du sac endolymphatique.
(E, F) Oreille interne isolée avec le sac endolymphatique toujours associé au tissu conjonctif.
(A, C, E) Images capturées en lumière incidente. (B, D, F) tdFluorescence de la tomate du tissu correspondant. Barres d’échelle : 2 mm (A-B), 1 mm (C-F). Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.
Figure supplémentaire 2. Comparaison de la fluorescence de sacs endolymphatiques isolés de R26LSL-RCL-tdT/+ ; Tg(ATP6V1B1-Cre)1Rnel/Mnet R26LSL-RCL-tdT/+ souris compagnons de portée à E16.5 et P5. La fluorescence tdTomato facilite grandement la reconnaissance du sac et du canal endolymphatique.
(A-C) Sacs endolymphatiques microdisséqués de E16.5 R26LSL-RCL-tdT/+ ; Tg(ATP6V1B1-Cre)1Rnel/Mn (A) et R26LSL-RCL-tdT/+ souris de portée (B, C).
(D-F) Sacs endolymphatiques microdisséqués de P5 R26LSL-RCL-tdT/+ ; Tg(ATP6V1B1-Cre)1Rnel/Mn (D) et R26LSL-RCL-tdT/+ souris de portée (E, F).
(A, B, D, E) tdFluorescence de la tomate. (C, F) Images de la lumière incidente correspondant à B et E. Barres d’échelle : 500 μm. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.
Discussion
De nombreux chercheurs ont utilisé des coupes enrobées de paraffine ou congelées pour des études morphologiques du sac endolymphatique. L’inconvénient des préparations sectionnées est qu’il peut être difficile d’observer pleinement les contacts complexes de cellule à cellule, car la taille et la forme de chaque cellule épithéliale du sac endolymphatique sont extrêmement variables, formant une couche cellulaire ridée et pseudostratifiée. L’immunomarquage à monture entière et l’imagerie z-stack, décrits dans ce protocole, permettent une meilleure visualisation de la structure tridimensionnelle du sac endolymphatique.
Pour une microdissection réussie, le point critique est de visualiser mentalement tout le contour du sac endolymphatique, même s’il est invisible chez la souris de type sauvage. L’observation du rapporteur fluorescent illustré à la figure 3 et à la figure supplémentaire 1-2 peut être utile pour reconnaître la localisation et la taille du sac endolymphatique chez la souris.
Bien que cette méthode de dissection complète ait été utilisée pour l’immunomarquage dans le protocole ci-dessus, cette technique peut également être utilisée pour prélever du tissu du sac endolymphatique pour l’analyse de l’expression génique, comme la RT-qPCR, l’expression de microréseaux et même le séquençage de l’ARN sur cellule unique. Les résultats de l’analyse de séquençage de l’ARN sur cellule unique à l’aide de tissus préparés avec ce protocole ont déjà été rapportés16. Pour l’analyse de l’expression génique des cellules épithéliales du sac endolymphatique, il est préférable de prélever l’épithélium isolé afin qu’il n’y ait pas de contamination avec d’autres tissus adjacents. Bien que le sac endolymphatique embryonnaire puisse être séparé des tissus conjonctifs adjacents, c’est beaucoup plus difficile à faire à des âges plus avancés. Pour les échantillons provenant de souris plus âgées, l’incubation avec la collagénase/dispase pendant 5 min à 37 °C est encouragée et facilite l’isolement de l’épithélium du sac endolymphatique.
L’un des inconvénients de l’immunomarquage à montage entier décrit dans ce protocole est que la structure tridimensionnelle d’origine peut être affectée par un traumatisme lors de la dissection ou du montage de la préparation entre la lame de verre et la lamelle. Il faut veiller à éviter les artefacts dus à la manipulation.
Déclarations de divulgation
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Remerciements
Cette recherche a été financée en partie par le programme de recherche intra-muros des NIH, le NIDCD (NIH Intramural Research Funds Z01-DC000060 et le ZIC DC000081 to the Advanced Imaging Core). Nous sommes reconnaissants aux Drs Raoul D. Nelson et R. Lance Miller (Université de l’Utah, Salt Lake City, UT) et à la Dre Susan Wall (École de médecine de l’Université Emory, Atlanta, GA) pour avoir partagé les souris Tg(ATP6V1B1-Cre) et au personnel de l’animalerie NIDCD pour avoir pris soin de nos animaux. Nous exprimons notre gratitude au Dr Philine Wangeman pour la belle illustration de l’oreille interne. Nous remercions les Drs Thomas B. Friedman et Robert J. Morell d’avoir révisé de manière critique ce manuscrit.
Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| EDTA 0.5 M | Crystalgen | 221-057 | |
| 1 mL Seringue TUBERCULIN avec 27G x 13mm | BD | 309623 | |
| plaque de verre spot à 9 puits | Pyrex | 13-748B | |
| Alexa Fluor 555-conjuguée phalloïdine | ThermoFisher Scientific | A34055 | |
| Artère ; Ciseaux ;- Pointe de boule | Fine Science Tools | 14080-11 | |
| Albumine sérique bovine | Sigma Aldrich | A3059 | |
| Caméra pour capturer des images en lumière incidente | Leica | DFC 495 | |
| Caméra pour capturer des images fluorescentes | Leica | DFC 7000 GT | |
| Tubes à centrifuger 15 mL | Corning | 430053 | |
| Tubes à centrifuger 50 mL | Corning 430829 | ||
| Collagenase/Dispase | Roche | 10269638001 | |
| Microscope confocal | Zeiss | LSM 880 | |
| Verre de couverture | Corning | 2940-223 | |
| Dumont #4 Forceps | Fine Science Tools | 11241-30 | |
| Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 11251-20 | |
| Dumont #55 Forceps | Fine Science Tools | 11255-20 | |
| Ciseaux Bonn extra fins | Outils de science fine | 14084-08 | |
| Alternative : Micro ciseaux de dissection extra fins ; Droit; Pointes acérées ; Longueur de lame de 20 mm ; 3 1/2" Longueur totale | Roboz | RS-5880 | |
| Chèvre anti-lapin Alexa Fluor 488-anticorps secondaire conjugué | ThermoFisher Scientific | A11034 | |
| MicroSlides Superfrost | VWR | 48311-702 | |
| Agitateur orbital, par exemple Mini Shaker | Daigger | 980275 | |
| Paraformaldéhyde (PFA) 16 % Solution aqueuse | Microscopie électronique Sciences | 15710 | |
| Solution saline tamponnée au phosphate (10X) pH 7,4 | ThermoFisher Scientific | AM9624 | |
| ProLong Gold Antifade Mountant avec DAPI | ThermoFisher Scientific | P36931 | |
| Anticorps anti-Pendrin pour lapin | RRID interne | :AB_2713943, PB826 (Choi et al., 2011) | |
| Pince à anneau | Outils scientifiques | fins11106-09 | |
| Agitateur à bascule, par exemple GyroMini | Labnet | S0500 | |
| Stéréomicroscope équipé d’un objectif PlanApo 1.0x | Leica | ||
| Acier inoxydable à lame unique tranchante, .009" | GEM Personna | 62-0176 | |
| Plat de culture tissulaire 60 mm | Falcon | 353002 | |
| Vernis à | |||
| Triton X-100 | ACROS Organiques | 32737-1000 |
Références
- Dror, A. A., Brownstein, Z., Avraham, K. B. Integration of human and mouse genetics reveals pendrin function in hearing and deafness. Cellular Physiology and Biochemistry. 28 (3), 535-544 (2011).
- Reardon, W., CF, O. M., Trembath, R., Jan, H., Phelps, P. D. Enlarged vestibular aqueduct: a radiological marker of pendred syndrome, and mutation of the PDS gene. QJM. 93 (2), 99-104 (2000).
- Griffith, A. J., Wangemann, P. Hearing loss associated with enlargement of the vestibular aqueduct: mechanistic insights from clinical phenotypes, genotypes, and mouse models. Hearing Research. 281 (1-2), 11-17 (2011).
- Gurkov, R., Pyyko, I., Zou, J., Kentala, E. What is Meniere's disease? A contemporary re-evaluation of endolymphatic hydrops. Journal of Neurology. 263, Suppl 1 71-81 (2016).
- Eckhard, A., et al. Water channel proteins in the inner ear and their link to hearing impairment and deafness. Molecular Aspects of Medicine. 33 (5-6), 612-637 (2012).
- Choi, B. Y., et al. Mouse model of enlarged vestibular aqueducts defines temporal requirement of Slc26a4 expression for hearing acquisition. Journal of Clinical Investigation. 121 (11), 4516-4525 (2011).
- Miyashita, T., et al. Presence of FXYD6 in the endolymphatic sac epithelia. Neuroscience Letters. 513 (1), 47-50 (2012).
- Royaux, I. E., et al. Localization and functional studies of pendrin in the mouse inner ear provide insight about the etiology of deafness in pendred syndrome. Journal of the Association for Research in Otolaryngology. 4 (3), 394-404 (2003).
- Kim, H. M., Wangemann, P. Epithelial cell stretching and luminal acidification lead to a retarded development of stria vascularis and deafness in mice lacking pendrin. PLoS One. 6 (3), 17949(2011).
- Dahlmann, A., von During, M. The endolymphatic duct and sac of the rat: a histological, ultrastructural, and immunocytochemical investigation. Cell and Tissue Research. 282 (2), 277-289 (1995).
- Everett, L. A., et al. Targeted disruption of mouse Pds provides insight about the inner-ear defects encountered in Pendred syndrome. Human Molecular Genetics. 10 (2), 153-161 (2001).
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- Wang, L., Jiang, H., Brigande, J. V. Gene transfer to the developing mouse inner ear by in vivo electroporation. Journal of Visualized Experiments. (64), e3643(2012).
- Currle, D. S., Hu, J. S., Kolski-Andreaco, A., Monuki, E. S. Culture of mouse neural stem cell precursors. Journal of Visualized Experiments. (2), 152(2007).
- Honda, K., et al. Molecular architecture underlying fluid absorption by the developing inner ear. Elife. 6, (2017).
Réimpressions et autorisations
