Extraction, purification et profilage des gangliosides

Résumé

Les gangliosides sont des glycosphingolipides porteurs d’acide sialique qui sont particulièrement abondants dans le cerveau. Leur nature amphipathique nécessite des techniques d’extraction et de purification organiques/aqueuses pour assurer une récupération optimale et des analyses précises. Cet article fournit des aperçus de l’extraction, de la purification et de l’analyse par chromatographie sur couche mince à l’échelle analytique et préparative.

Résumé

Les gangliosides sont des glycosphingolipides qui contiennent un ou plusieurs résidus d’acide sialique. Ils se trouvent sur toutes les cellules et tissus des vertébrés, mais sont particulièrement abondants dans le cerveau. Exprimés principalement sur la feuillet externe des membranes plasmiques des cellules, ils modulent les activités des protéines de surface cellulaire par association latérale, agissent comme récepteurs dans les interactions cellule-cellule et sont des cibles pour les agents pathogènes et les toxines. La dérégulation génétique de la biosynthèse des gangliosides chez l’homme entraîne de graves troubles congénitaux du système nerveux. En raison de leur nature amphipathique, l’extraction, la purification et l’analyse des gangliosides nécessitent des techniques qui ont été optimisées par de nombreux chercheurs au cours des 80 années qui ont suivi leur découverte. Nous décrivons ici des méthodes au niveau du banc pour l’extraction, la purification et les analyses qualitatives et quantitatives préliminaires des principaux gangliosides de tissus et de cellules qui peuvent être complétées en quelques heures. Nous décrivons également des méthodes d’isolement et de purification à plus grande échelle des principales espèces de gangliosides du cerveau. Ensemble, ces méthodes fournissent un accès à l’échelle analytique et préparative à cette classe de molécules bioactives.

Introduction

Les gangliosides sont définis comme des glycosphingolipides portant un ou plusieurs résidus d’acide ^sialique1. Ils sont exprimés principalement à la surface de la cellule avec leur fraction lipidique céramide hydrophobe intégrée dans la feuillet externe de la membrane plasmique et leurs glycanes hydrophiles s’étendant dans l’espace ^{extracellulaire2}. Bien que largement distribués dans les cellules et les tissus des vertébrés, ils sont particulièrement abondants dans le cerveau des vertébrés3, où ils ont été découverts et nommés pour la première ^fois4.

Protocole

Le prélèvement de tissus a été effectué dans les conditions autorisées par le Comité de soins et d’utilisation des animaux de Johns Hopkins.

1. Extraction de gangliosides à petite échelle et purification partielle

ATTENTION : Utilisez une ventilation appropriée lorsque vous travaillez avec des solvants volatils et toxiques. Évitez le plastique partout; les solvants extraient les composants chimiques de nombreux plastiques qui interfèrent avec les analyses ultérieures. Le polytétrafluoroéthylène (PTFE) est une exception; Des fermetures revêtues de PTFE doivent être utilisées pour boucher les flacons de stockage en v....

Résultats

Les méthodes décrites à la rubrique 1 (petite échelle) fournissent des gangliosides en quantité et en pureté suffisantes pour la détermination qualitative et quantitative des principaux gangliosides cérébraux. La récupération du cerveau de la souris est d’environ 1 μmol de ganglioside par g de poids humide du cerveau (1 nmol / μL) lorsqu’il est préparé comme décrit. La résolution TLC de 1 μL (1 nmol) à l’aide de la section 3 fournit suffisamment de matériel pour la détection du résorcinol et résout tous les principaux ga.......

Discussion

Les méthodes d’extraction et d’isolement des gangliosides à petite et à grande échelle décrites ici ne sont pas uniques - il existe de nombreuses approches différentes d’extraction et de purification par solvant qui donnent d’excellents ^résultats12. Les méthodes rapportées ici pour la purification à petite échelle du cerveau, de Fredman et ^{Svennerholm13}, ont été montrées pour optimiser la récupération et se sont avérées robustes et simples pendant de nombreuses années dans .......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Cerveau de bovin, dépouillé	PelFreez	57105-1
Étalons de ganglioside	Matreya	GM1, 1061 ; GD1a, 1062 ; GD1b, 1501 ; GT1b, 1063
Flacon en verre avec bouchon doublé de PTFE	Fisher Scientific	02-911-739
Flacon centrifuge en verre	Fisher Scientific	05-586B
Tubes de culture en verre, 16 x 125 mm	VWR	60825-430	pour la collecte des fractions HPLC
Entonnoir séparateur en verre (2 L)	Pyrex	6400-2L
Seringue d’injection - Hamilton 1750 étanche au gaz 500 & micro ; l	Hamilton	81265
p-Anisaldéhyde, 98 %	Sigma-Aldrich	; A88107
Homogénéisateur Potter-Elvhjem	Fisher Scientific	08-414-14A	Choisissez l’option de volume appropriée
Reprosil 100 NH2 10µ ; m 5x4mm	Colonnes de garde Analytics-Shop	AAVRS1N-100540-5
Reprospher 100 NH2, 5 &mu ; m, 250 mm x 20 mm Colonne HPLC	Analytics-Shop	emballé sur mesure	autres tailles disponibles
Resorcinol	Sigma-Aldrich	30752-1
Évaporateur rotatif	Buchi	R-300
Boucle d’échantillonnage pour modèle 7725 Injecteur (5 ml)	Sigma-Aldrich	57632
Sep-Pak tC18 Cartidges Vac 35 cc (10 g)	Waters	WAT043350
Sep-Pak tC18 Plus Cartouche courte, 400 mg	Waters	WAT036810
Seringue Spotting - Hamilton 701N 10 µ ; l	Hamilton	80300
Tubes à essai à paroi épaisse de 13 mm de diamètre avec bouchons doublés de PFTE Fisher	Scientific	14-933A
Flacons filetés de 2 ml avec bouchons doublés de PFTE	Fisher Scientific	14-955-323	Pour le stockage des gangliosides
Plaques TLC, HPTLC Gel de silice 60 F254 Multiformat	Fisher Scientific	M1056350001	L’imprégnation par fluorescence (F254) stabilise le sorbant pulvérisateur
réactifs TLC	Fisher Scientific	05-723-26A
Chambre de coulée TLC pour plaques de 10 x 10 cm	Camag	22.5155
Waring 1 litre en acier inoxydable résistant aux explosions Blender	Waring	E8520