Analyse des réponses des lymphocytes T CD4 spécifiques du VHB et identification des épitopes des lymphocytes T CD4 restreints par HLA-DR sur la base d’une matrice peptidique

Résumé

Sur la base d’une matrice peptidique dérivée du virus de l’hépatite B (VHB), les réponses des lymphocytes T CD4 spécifiques du VHB ont pu être évaluées parallèlement à l’identification des épitopes des lymphocytes T CD4 spécifiques du VHB.

Résumé

Les lymphocytes T CD4 jouent un rôle important dans la pathogenèse de l’hépatite B chronique. En tant que population cellulaire polyvalente, les lymphocytes T CD4 ont été classés comme des sous-ensembles fonctionnels distincts en fonction des cytokines qu’ils ont sécrétées : par exemple, IFN-γ pour les lymphocytes T helper 1 CD4, IL-4 et IL-13 pour les cellules CD4 T helper 2, IL-21 pour les cellules folliculaires CD4 T helper et IL-17 pour les cellules CD4 T helper 17. L’analyse des lymphocytes T CD4 spécifiques du virus de l’hépatite B (VHB) basée sur la sécrétion de cytokines après la stimulation des peptides dérivés du VHB pourrait fournir des informations non seulement sur l’ampleur de la réponse des lymphocytes T CD4 spécifiques au VHB, mais également sur les sous-ensembles fonctionnels des lymphocytes T CD4 spécifiques au VHB. De nouvelles approches, telles que la transcriptomique et l’analyse métabolomique, pourraient fournir des informations fonctionnelles plus détaillées sur les lymphocytes T CD4 spécifiques du VHB. Ces approches nécessitent généralement l’isolement de lymphocytes T CD4 viables spécifiques du VHB à partir de multimères du complexe d’histocompatibilité majeur du peptide II, alors qu’actuellement les informations sur les épitopes des lymphocytes T CD4 spécifiques du VHB sont limitées. Sur la base d’une matrice peptidique dérivée du VHB, une méthode a été mise au point pour évaluer les réponses des lymphocytes T CD4 spécifiques au VHB et identifier simultanément les épitopes des lymphocytes T CD4 spécifiques au VHB à l’aide d’échantillons de cellules mononucléaires du sang périphérique provenant de patients atteints d’une infection chronique par le VHB.

Introduction

Actuellement, il existe 3 approches principales pour analyser les lymphocytes T spécifiques de l’antigène. La première approche est basée sur l’interaction entre le récepteur des lymphocytes T et le peptide (épitope). Les lymphocytes T spécifiques de l’antigène pourraient être directement colorés avec des multimères du complexe d’histocompatibilité peptide-majeur (CMH). L’avantage de cette méthode est qu’elle pourrait obtenir des lymphocytes T viables spécifiques à l’antigène, adaptés à l’analyse transcriptomique/métabolomique en aval. Une limitation de cette méthode est qu’elle ne pourrait pas fournir d’informations sur l’ensemble de la réponse des lymphocytes T à un....

Protocole

Le consentement éclairé écrit a été obtenu de chaque patient inclus dans l’étude. Le protocole d’étude est conforme aux directives éthiques de la Déclaration d’Helsinki de 1975, telles qu’elles se reflètent dans l’approbation a priori par le comité d’éthique médicale de l’hôpital du Sud-Ouest.

1. Conception de la matrice peptidique dérivée du VHB

1. Téléchargez les séquences d’acides aminés de l’antigène central du VHB à partir des bases de données NCBI (GenBank: AFY98989.1).
2. Achetez des peptides dérivés de l’antigène de base du VHB (un panel de 35 peptides de 15 mer se chevauchant par 10 résidus, pureté > 90%, 4 mg / pepti....

Résultats

La fréquence de sécrétion de cytokines des lymphocytes T CD4 est calculée comme la somme des producteurs simples et des producteurs doubles. Comme le montre la figure 1,la fréquence de sécrétion de lymphocytes T CD4 par α TNF et la fréquence de sécrétion de lymphocytes T CD4 par γ d’IFN dans le contrôle de fond (DMSO) sont respectivement de 0,154 % et 0,013 %. La fréquence des lymphocytes T CD4 sécrétant des lymphocytes T CD4 α Tnf-γ sécrétant des lymphocytes T CD4 spécifiques pour le pool d.......

Discussion

Les étapes les plus critiques de ce protocole sont énumérées comme suit : 1) suffisamment de PBCC de haute viabilité pour démarrer l’expansion des PBMC ; 2) un environnement approprié pour l’expansion des PBMC; et 3) l’élimination complète des pools de peptides résiduels dans la culture de PBMC avant l’identification de l’épitope.

Toutes les analyses de ce protocole dépendent de la prolifération robuste des lymphocytes T CD4. En général, le nombre de PBCC après une expansion de 10 jours sera d.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Albumine Bovine V (BSA)	Beyotime	ST023
APC-conjugué Anti-humain TNF-&alpha ;	eBioscience	17-7349-82	Garder à l’abri de la lumière
Nucléase benzonase	Sigma-Aldrich	E1014	agglomérantes limites
(BLCL)	FRED HUTCHINSON CANCER RESEARCH CENTER		HLA-DRB1*0803
Lignées cellulaires lymphoblastoïdes B homozygotes (BLCL)	FRED HUTCHINSON CANCER RESEARCH CENTER		HLA-DRB1*1202 homozygote
Fiole de culture cellulaire (T75)	Plaque	Corning 430641
(96 puits, fond plat)	Corning	3599
Plaque de culture cellulaire à fond plat (96 puits, fond rond)	Corning	3799
Passoire cellulaire	Corning	CLS431751	Taille des pores 70  ; &mu ; m, blanc, tube à
centrifuger stérile (15 mL)	Tube	stérile	KIRGEN KG2611
(50 mL)	Centrifugeuse	stérile	430829
réfrigérée	Eppendorf	5804R
réfrigérée	Thermo	ST16R
, réfrigérée	Thermo	Legend Micro 21R
Cytofix/Cytoperm Kit (Transcription Factor Buffer Set)	BD Biosciences	562574	Préparer la solution avant utilisation
Dimethyl Sulfoxide (DMSO)	Sigma-Aldrich	D2650	Conserver à température ambiante pour éviter la cristallisation
Dulbecco' s Phosphate salin			Préparer ddH2O (1000 ml) contenant du NaCl (8000 mg), du KCl (200 mg), du KH2PO4 (200 mg) et du Na2HPO4.7H2O (2160 mg). Ajustez le PH à 7,4. Stériliser par autoclave.
Ficoll-Paque Premium	GE Healthcare	17-5442-03
Dépanneurs filtrants (0.5-10)	Kirgen	KG5131
Dépanneurs filtrants stériles (100-1000)	Kirgen	KG5333	Embouts filtrants stériles
(1-200)	Kirgen	KG5233	Stérile
FITC Conjugué Anti-Human CD4	BioLegend	300506	Garder à l’abri de la lumière
Fixable Viability Dye eFluor780	eBioscience	65-0865-14	Garder à l’abri de
la lumière Inhibiteur de transport de protéines GolgiStop (contenant du monensin)	BD Biosciences	554724	Inhibiteur de transport de protéines
Hémocytomètre	Marque	718620
HBV Core Antigen Derived Peptides	ChinaPeptides
HEPES	Gibco	15630080	100 ml
Sérum Humain AB	Gemini Bio-Products	100-51	100 ml
Ionomycine	Sigma-Aldrich	I0634
KCl	Sangon Biotech	A100395-0500
KH2PO4	Sangon Biotech	A100781-0500
LSRFortessa Cytomètre en Flux	BD
L-glutamine	Gibco	25030081	100 ml
(1,5 mL)	Corning	MCT-150-C	Stérilisation autoclavée avant utilisation
Agitateurs de microplaques	Scientific Industries	MicroPlate Genie
Mitomycin C	Roche	10107409001
Na2HPO4.7H2O	Sangon Biotech	A100348-0500
NaCl	Sangon Biotech	A100241-0500
Tubes PCR (0,2 mL)	Kirgen	KG2331
Anti-humain conjugué PE/Cy7	BioLegend	300914	Garder à l’abri de la lumière
Conjugué PE Anti-humain IFN-&gamma ;	eBioscience	12-7319-42	Conserver à l’abri de
la lumière Pénicilline Streptomycine Gibco		15140122	100 ml
PerCP-Cy5.5-conjugué Anti-humain CD3	eBioscience	45-0037-42	Garder à l’abri de la lumière
Phorbol 12-myristate 13-acétate (PMA)	Sigma-Aldrich	P1585
Recombinant Human IL-2	PeproTech	200-02
Humain recombinant IL-7	PeproTech	200-07
RPMI Medium 1640	Gibco	C11875500BT	500 ml
Pyruvate de sodium, 100mM	Gibco	15360070
Trypan Blue Stain (0,4 %)	Gibco	15250-061
Ultra-LEAF Purified Anti-human HLA-DR	BioLegend	307648
Wizard ADN génomique Kit de purification	Promega	A1125

Cellules lymphoblastoïdes B IHW09126 IHW09121 de culture cellulaire à fond rond à centrifuger Corning, centrifugeuse , centrifugeuse tamponné Tube de microcentrifugation de