Dissection des propriétés mécanoenzymatiques des myosines processives avec la spectroscopie ultrarapide à pince de force

L. Gardini; A. V. Kashchuk; F. S. Pavone; M. Capitanio

doi:10.3791/62388

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Article de méthode

Dissection des propriétés mécanoenzymatiques des myosines processives avec la spectroscopie ultrarapide à pince de force

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DOI :

10.3791/62388

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1 juillet 2021

L. Gardini¹^,² , A. V. Kashchuk²^,³ , F. S. Pavone¹^,²^,³ , M. Capitanio²^,³

¹National Institute of Optics, National Research Council, ²LENS, European Laboratory for Non-Linear Spectroscopy, ³Physics Department, University of Florence

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Résumé

Présenté ici est un protocole complet pour effectuer des expériences de serrage de force ultrarapide sur des moteurs de myosine-5 processive, qui pourrait être facilement étendu à l’étude d’autres classes de moteurs processifs. Le protocole détaille toutes les étapes nécessaires, de la configuration de l’appareil expérimental à la préparation des échantillons, en passant par l’acquisition et l’analyse des données.

Résumé

La spectroscopie ultrarapide de pince de force (UFFCS) est une technique à molécule unique basée sur des pinces laser qui permet d’étudier la chimiomécanique des myosines conventionnelles et non conventionnelles sous charge avec une résolution temporelle sans précédent. En particulier, la possibilité de sonder les moteurs de myosine sous force constante juste après la formation de la liaison actine-myosine, ainsi que le taux élevé de retour de force (200 kHz), ont montré que l’UFFCS est un outil précieux pour étudier la dépendance de charge de dynamiques rapides telles que la course de travail de la myosine. De plus, UFFCS permet d’étudier comment les interactions processives et non processives myosine-actine sont influencées par l’intensité et la direction de la force appliquée.

En suivant ce protocole, il sera possible d’effectuer des expériences de serrage de force ultrarapides sur des moteurs de myosine-5 processive et sur une variété de myosines non conventionnelles. Par quelques ajustements, le protocole pourrait également être facilement étendu à l’étude d’autres classes de moteurs processifs tels que les kinésines et les dynéines. Le protocole comprend toutes les étapes nécessaires, de la configuration de l’appareil expérimental à la préparation des échantillons, en passant par les procédures d’étalonnage, l’acquisition et l’analyse des données.

Introduction

Au cours des dernières décennies, les pinces optiques ont été un outil précieux pour élucider la mécanochimie des interactions protéiques au niveau de la molécule unique, en raison de la possibilité frappante de manipulation et de mesure simultanées des changements conformationnels et de la cinétique enzymatique ^1,2. En particulier, la capacité d’appliquer et de mesurer des forces dans la gamme de celles exercées par les moteurs moléculaires dans la cellule, ainsi que la capacité de mesurer les changements conformationnels subnanométriques, ont fait des pincettes optiques un outil unique à molécule unique pou....