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Article de méthode

Un modèle chirurgical modifié de l’ischémie du membre postérieur chez des souris ApoE-/- utilisant une incision miniature

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DOI :

10.3791/62402

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13 mai 2021

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Surgery, Medical Faculty Manheim, Heidelberg University, 2European Center of Angioscience ECAS, Medical Faculty Manheim, Heidelberg University, 3Computer-Assisted Clinical Medicine, Mannheim Institute for Intelligent Systems in Medicine, Medical Faculty Mannheim, Heidelberg University, 4Cooperative Core Facility Animal Scanner ZI, Medical Faculty Mannheim, Heidelberg University

Dans cet article

Résumé

Cet article démontre une approche chirurgicale efficace pour établir une ischémie aiguë chez la souris avec une petite incision. Cette approche peut être appliquée par la plupart des groupes de recherche sans aucune mise à niveau du laboratoire.

Résumé

Le but de cette étude est d’introduire et d’évaluer une approche chirurgicale modifiée pour induire une ischémie aiguë chez la souris qui peut être mise en œuvre dans la plupart des laboratoires animaliers. Contrairement à l’approche conventionnelle pour la double ligature de l’artère fémorale (DLFA), une incision plus petite sur la région inguinale droite a été faite pour exposer l’artère fémorale proximale (AF) à effectuer DLFA. Ensuite, à l’aide d’une suture 7-0, l’incision a été traînée vers la région du genou pour exposer l’AF distale. L’imagerie par résonance magnétique (IRM) sur les membres postérieurs bilatéraux a été utilisée pour détecter l’occlusion de l’AF après la chirurgie. À 0, 1, 3, 5 et 7 jours après la chirurgie, la récupération fonctionnelle des membres postérieurs a été évaluée visuellement et notée à l’aide de l’échelle de Tarlov. L’évaluation histologique a été réalisée après euthanasie des animaux 7 jours après le DLFA. Les procédures ont été effectuées avec succès sur la jambe droite chez dix souris ApoE- / - et aucune souris n’est morte lors d’une observation ultérieure. Les tailles d’incision chez les 10 souris étaient inférieures à 5 mm (4,2 ± 0,63 mm). Les résultats de l’IRM ont montré que le flux sanguin d’AF du côté ischémique était clairement bloqué. Les résultats de l’échelle de Tarlov ont démontré que la fonction des membres postérieurs a considérablement diminué après la procédure et s’est lentement rétablie au cours des 7 jours suivants. L’évaluation histologique a montré une réponse inflammatoire significative du côté ischémique et une densité microvasculaire réduite dans le membre postérieur ischémique. En conclusion, cette étude introduit une technique modifiée utilisant une incision miniature pour effectuer une ischémie des membres postérieurs (HLI) en utilisant DLFA.

Introduction

Il existe un besoin non satisfait de modèles animaux précliniques pour la recherche sur les maladies vasculaires telles que la maladie artérielle périphérique (MAP). Malgré les développements avancés dans le diagnostic et le traitement, il y avait plus de 200 millions de patients atteints d’AOMI en2018 1, et leur nombre est en constante augmentation. Bien que plusieurs nouvelles approches thérapeutiques2,3,4,5,6,7 aient été décrites, la traduction réussie de ces modalités thérapeutiques en application clinique reste une tâche ardue. Par conséquent, des modèles expérimentaux in vivo fiables et pertinents simulant l’état de la maladie humaine sont nécessaires pour étudier le mécanisme potentiel et l’efficacité de ces nouvelles approches thérapeutiques pour traiter l’AOMI6,7.

L’hyperlipidémie et l’athérosclérose (SA) sont les principaux facteurs de risque de développement de l’AOMI. Les souris ApoE-/- (avec un régime riche en graisses) présentent un métabolisme anormal des graisses et une hyperlipidémie et développent par la suite des plaques d’athérosclérose, ce qui fait des souris ApoE-/- le meilleur choix pour simuler l’AOMI cliniquement pertinente. Les modèles animaux HLI précliniques sont générés par double ligature de l’artère fémorale (DLFA), qui est l’approche la plus largement utilisée dans les laboratoires du monde entier8,9,10,11,12,13,14,15 pour simuler l’ischémie aiguë sur chronique. Cependant, cette approche nécessite généralement une incision relativement grande et invasive. En outre, cela conduit inévitablement les animaux (en particulier les souris) à souffrir d’une douleur accrue et d’une inflammation, ce qui influence également les résultats expérimentaux ultérieurs5,6,16,17. Cet article décrit un modèle HLI aigu sur chronique chez des souris APOE-/- en utilisant une très petite incision.

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Protocole

NOTE: Toutes les procédures expérimentales ont été effectuées conformément à la directive CE 2010/63/UE et ont été approuvées par la législation allemande locale (35-9185.81/G[1]239/18). Dix souris mâles ApoE-/- avec le fond C57BL / 6J, pesant 29,6-38,0 g, ont été logées sur un cycle clair / sombre de 12 h et nourries avec un régime occidental (1,25% de cholestérol et 21% de matières grasses) et de l’eau ad libitum pendant 12 semaines à partir de l’âge de 8 semaines. HLI a été effectué sur des souris âgées de 20 semaines comme décrit ci-dessous.

1. Induction de HLI chez les souris ApoE-/-

  1. Préparer l’équipement et les outils nécessaires pour la chirurgie (voir le tableau des matériaux et la figure 1). Stérilisez les instruments chirurgicaux par autoclavage avant utilisation et utilisez un stérilisateur à billes de verre pendant l’opération.
  2. Anesthésier la souris avec une injection sous-cutanée (S.C.) d’un mélange de midazolam (5 mg/kg), de médétomidine (0,05 mg/ml/kg) et de fentanyl (0,5 mg/kg) avant toutes les interventions chirurgicales.
    1. Après le début de l’anesthésie, utilisez la pommade vétérinaire sur les yeux pour prévenir la sécheresse et confirmez l’absence du réflexe de retrait de la pédale dans le membre antérieur et le membre postérieur.
  3. Ensuite, placez la souris sur un coussin chauffant pour maintenir la température corporelle centrale à environ 37 ° C. À l’aide de cotons-tiges et de crème dépilatoire, retirez soigneusement les poils de la peau des membres postérieurs du côté droit.
    REMARQUE: La crème dépilatoire doit être utilisée en quantité suffisante pour couvrir les membres postérieurs, en particulier la région inguinale où l’incision sera faite. La crème dépilatoire doit être utilisée pendant une durée inférieure à 3 minutes et doit ensuite être retirée avec des cotons-tiges humidifiés 2 à 3 fois.
  4. Posez la souris en position couchée sur le coussin chauffant sous un microscope à dissection. Utilisez un antiseptique cutané (voir le Tableau des matériaux)pour désinfecter la peau de la souris. Ensuite, utilisez des pinces pointues et des ciseaux chirurgicaux pour faire une incision d’environ 3-4 mm au milieu de la région inguinale. Voir la figure 2 pour un schéma de la procédure.
  5. Retirez soigneusement le tissu adipeux sous-cutané à l’aide d’une pince pointue fine pour exposer le faisceau neurovasculaire fémoral proximal. Utilisez soigneusement les pinces pointues fines pour percer la membrane de la gaine fémorale. Utilisez un coton-tige humidifié avec une solution saline pour éloigner soigneusement l’artère fémorale (AF) du nerf fémoral (FN) et de la veine fémorale (FV).
  6. Passez deux sutures résorbables 7-0 à travers le FA proximal et faites des nœuds doubles à l’aide de ciseaux à ressort pour transecter le FA entre les deux attaches.
  7. Pour exposer l’AF distale, passez une suture résorbable 7-0 à travers le bord inférieur de l’incision et faites glisser doucement l’incision vers la région du côté droit du genou du membre postérieur.
  8. Déplacez soigneusement le tissu sous-cutané pour exposer le faisceau neurovasculaire. Utilisez de fines pinces pointues pour percer la membrane de la gaine fémorale et disséquer l’AF du FV et du FN.
  9. Passez deux sutures résorbables 7-0 à travers le FA distal et faites des nœuds doubles. Utilisez des ciseaux à ressort pour transecter le FA entre les deux traverses.
    REMARQUE: Aucune ligature n’a été effectuée sur le membre gauche, qui a servi de contrôle chez chaque souris.
  10. Ensuite, utilisez 6-0 sutures résorbables pour coudre l’incision. Placez la souris sur un coussin chauffant dans une cage propre et continuez à surveiller ses paramètres vitaux jusqu’à la récupération. Fournir des analgésiques postopératoires : Buprénorphine s.c. (0,1 mg/kg de poids corporel toutes les 8 heures pendant 48 h). 48 h après l’opération, administrer du métamizole dans l’eau potable (24 mg/5 mL d’eau correspond à une dose de 200 mg/kg 4 fois par jour).

2. Imagerie par résonance magnétique

REMARQUE: Un jour après DLFA, les souris doivent subir une IRM pour évaluer le blocage de l’AF.

  1. Placez la souris dans une chambre d’induction transparente et anesthésiez la souris avec 1,5 à 2% d’isoflurane dans l’air ambiant jusqu’à perte du réflexe de redressement.
  2. Placez la souris sur un lit d’animal chauffé équipé d’un porte-morsure et positionné vers l’aimant avec un système contrôlé par laser. Maintenir la température corporelle à 37±1 °C.
  3. Lors de l’acquisition d’images, maintenez l’anesthésie avec 1,5 à 2% d’isoflurane dans l’air ambiant et surveillez la respiration à l’aide d’une sonde de pression.
  4. Acquérir des images dans l’orientation transversale de la tranche en utilisant une séquence d’angiographie tridimensionnelle (3D) en temps de vol (TOF) avec paramètre temps d’écho (TE)/temps de répétition (TR)/angle de retournement (FA) = 2 ms/12 ms/13°, quatre moyennes, une matrice d’acquisition de 178 x 144 reconstruite en 256 x 192 et 121 tranches, résultant en une résolution isotrope de 0,15 mm3. Pour supprimer le signal des veines, placez une tranche de saturation distalement sur les membres postérieurs.

3. Évaluation clinique et suivi

  1. Estimer la récupération fonctionnelle dans les1er,3e,5eet 7e jours après la chirurgie en utilisant l’échelle de Tarlov de notation fonctionnelle18,19 (Tableau 1).

4. Évaluation histologique

  1. Sept jours après la chirurgie, appliquer une injection de pentobarbital (115 mg / kg) pour euthanasier les souris.
  2. Perfuser une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) contenant 1 % de paraformaldéhyde (PFA) à travers le ventricule cardiaque gauche (100 mL par souris). Fixer le gastrocnémien bilatéral (Gm) des souris dans 4% de PFA pendant la nuit à 4 ° C.
  3. Incorporer l’échantillon dans de la paraffine selon le protocole20décrit précédemment.
    1. Couper des sections de 4 à 5 μm d’épaisseur du bloc de tissu incorporé à la paraffine sur un microtome. À l’aide d’un pinceau rond, placez les sections de tissu coupé dans le bain-marie maintenu à 42 ° C.
    2. Insérez la lame du microscope dans l’eau à un angle de 45° et positionnez-la soigneusement sous le groupe de sections à collecter.
    3. Soulevez délicatement la glissière de l’eau et laissez les sections s’attacher à la glissière et sécher pendant la nuit dans l’incubateur de paillasse à 37 ° C.
  4. Effectuer une coloration à l’hématoxyline/éosine (HE) des sections de paraffine.
    1. Placez les diapositives contenant les sections dans des supports de diapositives. Préparez 3 récipients de xylène frais et placez les lames dans chaque récipient pendant 5 minutes pour déparaffiniser les sections.
    2. Réhydrater les sections en trempant successivement les tranches dans de l’éthanol à 96%, 80%, 70%, 50%, 30% et de l’eau désionisée pendant 5 min chacune.
    3. Tache dans la solution d’hématoxyline pendant 10 min.
    4. Transférer les tranches dans un récipient d’eau désionisée et rincer en les plaçant sous l’eau courante du robinet pendant 5 min.
    5. À l’aide d’un microscope, vérifiez l’intensité de la coloration à l’hématoxyline. Si la coloration permet d’identifier clairement les noyaux cellulaires, passez à l’étape suivante. Si l’intensité de coloration ne facilite pas l’identification des noyaux cellulaires ou si l’intensité de la coloration est faible, placez la lame dans la solution d’hématoxyline pendant 1 min, répétez le lavage à l’eau (étape 4.4.4), puis vérifiez à nouveau.
    6. Contre-tache dans une solution d’éosine-Y pendant 5 min.
    7. Déshydrater les sections en trempant successivement les tranches dans des récipients contenant de l’eau désionisée et de l’éthanol 30%, 50%, 70%, 80% et 96% successivement pendant une durée de 10 s chacun. Ensuite, placez les sections séquentiellement dans trois récipients de xylène frais pendant 10 s chacun.
    8. Placez les diapositives horizontalement sur des cartes de stockage de diapositives microscopiques avec les sections orientées vers le haut. Ajoutez suffisamment de support de montage sur la diapositive et montez les diapositives avec des couvercles.
  5. Effectuer la coloration immunohistochimique (IHC) des sections de paraffine.
    1. Répétez les étapes de déparaffinisation et de réhydratation 4.4.1 à 4.4.2. Ensuite, immergez les sections dans un récipient avec un tampon de citrate de sodium de 10 mM, pH 6, et portez l’échantillon à ébullition au micro-ondes.
      REMARQUE: Comme le surchauffage ou le sous-échauffement des échantillons peut provoquer des taches incohérentes, maintenez la température juste en dessous du point d’ébullition pendant 10 minutes.
    2. Ensuite, refroidissez les sections sur une paillasse pendant 30 minutes. Par la suite, lavez les sections dans PBS trois fois pendant 5 min. Séchez soigneusement la zone autour de l’échantillon et dessinez un grand cercle autour de l’échantillon à l’aide d’un stylo hydrophobe. .
      REMARQUE: Ne touchez jamais l’échantillon. Le marquage avec un stylo hydrophobe crée une limite hydrophobe, ce qui facilite l’utilisation d’un plus petit volume de solution d’anticorps.
    3. Étancher l’activité endogène de la peroxydase en plaçant la section dans 0,3% H2O2 dans PBS pendant 10 min. Sections de bloc avec 400 μL de tampon bloc (PBS contient 3% d’albumine sérique bovine et 0,3% de détergent non ionique) pendant 1 h à température ambiante dans une chambre humidifiée.
    4. Lavez les sections dans PBS pendant 5 min. Ensuite, ajoutez 100-400 μL d’anticorps anti-CD31 dilués (1:250) assez pour couvrir la section. Ensuite, incuber des sections pendant la nuit à 4 °C dans une chambre humidifiée.
      REMARQUE: Assurez-vous que la section est complètement recouverte de la solution d’anticorps.
    5. Retirez l’anticorps primaire et lavez les sections trois fois dans du PBS pendant une durée de 5 minutes chacune.
    6. Préparer le mélange de 3,3'-diaminobenzidine (DAB) en ajoutant 1 goutte du concentré DAB à 1 mL du diluant DAB, et bien mélanger. Ensuite, ajoutez 100 à 400 μL de mélange DAB aux sections et surveillez attentivement à l’œil nu pendant 2 minutes jusqu’à ce qu’une intensité de coloration acceptable soit observée.
      REMARQUE: Assurez-vous que la section est complètement recouverte du mélange DAB.
    7. Ensuite, rincez à l’eau courante du robinet pendant 5 min. Effectuer la coloration à l’hématoxyline comme décrit aux étapes 4.4.3-4.4.5.
    8. Effectuer la coloration à l’éosine-Y décrite à l’étape 4.4.6. Effectuer les étapes de déshydratation décrites à l’étape 4.4.7.
    9. Montez les sections avec des couvercles à l’aide d’un support de montage - effectué. Utilisez ImageJ pour estimer le pourcentage de la surface CD31 positive (%) dans 5 champs sélectionnés au hasard (40x) qui peuvent être considérés comme une densité microvasculaire comme décrit précédemment21.

5. Analyse statistique

  1. Utilisez un logiciel d’analyse statistique pour exprimer les résultats sous forme de moyenne ±'écart-type et pour effectuer un test tnon apparié sur les comparaisons. Considérez P < 0,05 comme étant statistiquement significatif.

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Résultats

Caractéristiques des souris ApoE-/-
Les chirurgies DLFA ont été effectuées avec succès sur 10 souris pour établir le modèle HLI, et aucune des souris n’est morte après la procédure. Pour suivre les changements de poids corporel, les souris ont été pesées avant la procédure DLFA (pré-DLFA) et 7 jours après la chirurgie DLFA (post-DLFA). Les poids pré-DLFA variaient de 29,6 à 38,0 g (moyenne de 34,74 ± 2,47 g), et les poids post-DLFA variaient de 26,5 à 34,1 ...

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Discussion

Cette étude rapporte une approche modifiée, simplifiée et chirurgicalement efficace pour établir un modèle HLI chez des souris ApoE- / - en utilisant une double ligature dans les régions proximale et distale de l’AF à travers une incision de 3-4 mm sans aucune mise à niveau de laboratoire requise. La principale caractéristique de cette méthode est la plus petite taille de l’incision par rapport aux études précédemment rapportées décrivant les modèles HLI de souris8,

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Déclarations de divulgation

Les auteurs déclarent que le contenu de l’article a été composé en l’absence de relations commerciales ou financières qui pourraient être interprétées comme un conflit d’intérêts potentiel.

Remerciements

Les auteurs remercient Viktoria Skude, Alexander Schlund et Felix Hörner pour l’excellent support technique.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
10x Tampon phosphate salinRoth9143.1Utilisé pour la coloration à l’hématoxyline et à l’éosine et la coloration immunohistochimique
30 % H2O2Roth9681.2Utilisé pour la coloration immunohistochimique
6-0 sutures résorbablesPROLENE8776HUtilisé pour la suture
cutanée 6-0 suture absroablePROLENEEP8706Utilisé en chirurgie
Sutures résorbables 7-0PROLENEEH8021EUtilisé pour la ligature de l’artère
Suture absroable 7-0PROLENEEP8755Utilisé en chirurgie
Acide acétiqueRoth6755.1Utilisé pour la coloration à l’hématoxyline et à l’éosine
Albumine Fraktion VRoth8076.2Utilisé pour la coloration en immunohistochimie
AutoclaveSystec GmbHSystec VX-150Utilisé pour la stérilisation des instruments chirurgicaux
Axio vert A1 microscopeCarl ZeissZEISS Axio Vert.A1Utilisé pour l’observation et la prise de photos à partir d’une coloration à l’hématoxyline et à l’éosine et d’une coloration immunohistochimique
Bruker BioSpec 94/20 AVIIIBruker Biospin MRI GmbHN/ABalayage de l’obstruction de l’artère fémorale
Buprenovet Sine 0,3mg/mlBayer AG2542 (WDT)Utilisé dans la gestion de la douleur postopératoire. Dose - 0,1 mg/kg de poids corporel toutes les 8 heures pendant 48 h après l’opération
Anticorps CD31Abcamab28364Utilisé pour la coloration immunohistochimique
d’éosine Y 0,5 % dans l’eauRothX883.1Utilisé pour la coloration à l’hématoxyline et à l’éosine Solution de récupération d’épitopes
pH 6Leica Biosystems6046945Utilisé pour la coloration immunohistochimique
Éthanol &ge ; 99,5 %Roth5054.1Utilisé pour la coloration à l’hématoxyline et à l’éosine et la coloration immunohistochimique
FentanylCayman Chemical437-38-7Utilisé pour l’anesthésie
Pince à pointe fineMedixplus93-4505SUtilisé pour séparer l’artère du nerf et de la veine
Stérilisateur à billes de verreSimon KellerType 250Utilisé pour la stérilisation des instruments chirurgicaux
Graefe iris pince courbéeVUBU VUBU-02-72207Utilisé pour la séparation brutale de la peau et du tissu sous-cutané
Crème décapante, Veet (à l’aloe vera)Reckitt Benckiser108972Enlever les poils des membres postérieurs des souris
Plaque chauffanteSTÖ ; RK-TRONIC7042092Maintenir la température moyenne des souris
HématoxylineRothT865.2Utilisé pour la coloration à l’hématoxyline et à l’éosine et la coloration immunohistochimique
Microscope chirurgical LeicaLeicaM651Agrandir le champ de vision pour faciliter l’opération
Liquide DAB+Substrat Chromogen SystemDakoK3468Utilisé pour la coloration
immunohistochimiqueSouris mâles ApoE-/-River LaboratoriesN/AUtilisé pour établir la maladie artérielle périphérique modèle de souris
MedetomidineCayman Chemical128366-50-7Utilisé pour l’anesthésie
Micro Porte-aiguilleNoir & Black SurgicalB3B-18-8Maintien de l’aiguille
Pince de serrage de micro-sutureLife Saver Surgical IndustriesPS-MSF-145Utilisé pour aider au nouage pendant la chirurgie
MicrotomeBiobaseBk-Mt268mUtilisé pour la section tissulaire
MidazolamRatiopharm44856.01.00Utilisé pour l’anesthésie
Système de surveillance et de contrôle des petits animaux compatible avec l’IRM Modèle 1025SA InstrumentsN/asurveillance des signes vitaux de l’animal lors de l’IRM
Octeniderm farblosSchü ; lke & Mayr GmbH180212utilisé pour la désinfection de la peau
Pommade pour les yeux et le nezBayer AG1578675Garder les yeux humides sous l’anesthésie
ParaformaldéhydeRoth0335.1Utilisé pour la fixation du tissu
PentobarbitalNembutal76-74-4Utilisé pour l’anesthésie
Saline DeltaSelect1299.99.99Utilisé pour Anesthésie
Ciseaux à ressort à pointes fines et pointuesNoir & Noir ChirurgicalB66167Utilisé pour couper l’artère
Ciseaux SuperCutNoir & Noir ChirurgicalB55992Utilisé pour couper la peau
Triton X-100Roth9002-93-1Utilisé pour l’immunohistochimie coloration
régime occidental, 1,25 % Cholestérolssniff Spezialdiä ; ten GmbHE15723-34Régime alimentaire pour les souris
XylèneRoth4436.3Utilisé pour la coloration à l’hématoxyline et à l’éosine et la coloration immunohistochimique
Solution Charles

Références

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