Article de méthode

Coloration immunofluorescente pour la visualisation des protéines associées à l’hétérochromatine dans les glandes salivaires de la drosophile

DOI :

10.3791/62408

⸱

21 août 2021

 ,  , 
1Instituto de Biotecnología, Departamento de Genética del Desarrollo y Fisiología Molecular, Universidad Nacional Autónoma de México

Dans cet article

Résumé

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Ce protocole vise à visualiser les agrégats d’hétérochromatine dans les cellules de polytène de drosophile.

Résumé

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La visualisation des agrégats d’hétérochromatine par immunostaining peut être provocante. De nombreux composants mammifères de la chromatine sont conservés chez Drosophila melanogaster. Par conséquent, c’est un excellent modèle pour étudier la formation et l’entretien de l’hétérochromatine. Les cellules polyténisées, telles que celles trouvées dans les glandes salivaires des larves de D. melanogaster du troisième stade, fournissent un excellent outil pour observer la chromatine amplifiée près de mille fois et ont permis aux chercheurs d’étudier les changements dans la distribution de l’hétérochromatine dans le noyau. Bien que l’observation des composants de l’hétérochromatine puisse être effectuée directement dans des préparations chromosomiques polytènes, la localisation de certaines protéines peut être modifiée par la gravité du traitement. Par conséquent, la visualisation directe de l’hétérochromatine dans les cellules complète ce type d’étude. Dans ce protocole, nous décrivons les techniques immunostaining utilisées pour ce tissu, l’utilisation des anticorps fluorescents secondaires, et la microscopie confocale d’observer ces agrégats d’hétérochromatine avec une plus grande précision et détail.

Introduction

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Depuis les premières études d’Emil Heitz1,l’hétérochromatine a été considérée comme un régulateur important des processus cellulaires tels que l’expression des gènes, la séparation méiotique et mitotique des chromosomes et le maintien de la stabilité du génome2,3,4.

L’hétérochromatine est principalement divisée en deux types: l’hétérochromatine constitutive qui définit de manière caractéristique les séquences répétitives, et les éléments transposables qui sont présents à des sites chromosomiques spécifiques tels que les télomères et les centromères. Ce type d’hétérochromatine est principalement défini épigénétiquement par des marques d’histones spécifiques telles que la di ou tri-méthylation de la lysine 9 de l’histone H3 (H3K9me3) et la liaison de la protéine hétérochromatine 1a (HP1a)5,6. D’autre part, l’hétérochromatine facultative se localise à travers les bras du chromosome et se compose principalement de gènes7,8. L’immunomarquage de blocs d’hétérochromatine dans les cellules métaphases, ou l’observation d’agrégats d’hétérochromatine dans les cellules interphases, a dévoilé beaucoup de lumière dans la compréhension de la formation et de la fonction des régions hétérochromatiques9.

L’utilisation de la drosophile comme système modèle a permis le développement d’outils essentiels pour étudier l’hétérochromatine sans l’utilisation de la microscopie électronique10. Depuis la description de la panachation de l’effet de position et la découverte de protéines associées à l’hétérochromatine, telles que HP1a, et de modifications post-traductionnelles des histones, de nombreux groupes ont développé plusieurs techniques immunohistochimiques qui permettent la visualisation de ces régions hétérochromatiques10,11.

Ces techniques sont basées sur l’utilisation d’anticorps spécifiques qui reconnaissent les protéines associées à l’hétérochromatine ou les marques d’histones. Pour chaque type de cellule et anticorps, les conditions de fixation et de perméabilisation doivent être déterminées empiriquement. En outre, les conditions peuvent varier si des procédés mécaniques supplémentaires tels que des techniques d’écrasement sont utilisés. Dans ce protocole, nous décrivons l’utilisation des glandes salivaires de drosophile d’étudier les foyers hétérochromatiques. Les glandes salivaires ont des cellules polyténisées qui contiennent plus de 1 000 copies du génome, fournissant ainsi une vue amplifiée de la plupart des caractéristiques de la chromatine, à l’exception de l’ADN satellite et de certaines régions hétérochromatiques qui sont sous-répliquées. Néanmoins, les régions d’hétérochromatine sont facilement visualisées dans des préparations de chromosome de polytène, mais les techniques d’écrasement peuvent parfois perturber des complexes caractéristiques liés à la chromatine ou l’architecture de chromatine. Par conséquent, l’immunolocalisation des protéines dans le tissu entier des glandes salivaires peut dépasser ces effets indésirables. Nous avons utilisé ce protocole pour détecter plusieurs protéines liées à la chromatine, et nous avons démontré que ce protocole combiné avec des stocks de drosophile mutants peut être utilisé pour étudier la perturbation de l’hétérochromatine12.

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Protocole

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1. Culture de larves du troisième stade

  1. Préparez 1 litre de milieux standards en ajoutant 100 g de levure, 100 g de sucre de canne entier non raffiné, 16 g de gélose, 10 mL d’acide propionique et 14 g de gélatine. Dissoudre tous les ingrédients sauf la levure dans 800 mL d’eau du robinet, puis dissoudre la levure. Autoclave immédiatement pendant 30 minutes.
    1. Ensuite, laissez le support refroidir à 60 °C et ajoutez l’acide propionique à une concentration finale de 0,01 %. Laissez la bouteille reposer jusqu’à ce que la gélatine soit formée.
  2. Pour optimiser la culture de larves de 3o stades, collectez d’abord des adultes âgés de 5 à 10 jours et placez-en 50 (25 mâles et 25 femelles) dans une large bouteille à col de milieux standard.
  3. Placez la bouteille avec les mouches dans un incubateur à température contrôlée à 25 °C jusqu’à ce que le nombre d’œufs pondus soit de 50 (environ 12 heures pour la souche de type sauvage).
  4. Une fois le temps d’incubation terminé, retirez les adultes et transférez-les dans une nouvelle bouteille pour répéter la procédure. Laisser les embryons grandir à 18 °C pendant 72 heures
    REMARQUE : Pour en savoir plus sur les conditions de maintien du stock de drosophiles, voir Tennessen &Thymmel13.

2. Collecte de larves

  1. Pour la collecte des larves, choisissez les larves errantes qui n’ont pas de spiracles everted. Après l’éversion des spiracles, la larve entre dans la phase prépupale, tout en conservant d’excellents chromosomes polytènes adaptés à l’analyse. Ce n’est qu’après 12 heures que les cellules de la glande salivaire commencent à se préparer à la mort cellulaire programmée14,15.
  2. Prenez quinze larves de 3° et mettez-les dans un verre de montre pour les laver. Puis les transférer dans une solution saline glacée ou PBS (1x PBS : NaCl 137 mM, KCl 2,7 mM, 10 mMNa2HPO4,2 mMKH2PO4,ajuster le pH à 7,4).
  3. Disséquer 15 à 30 paires de glandes salivaires (ou autant que possible en 30 minutes) dans du PBS froid avec des inhibiteurs de la protéase au microscope stéréoscopique. Transférer les glandes salivaires dans un tube de 1,5 mL avec du PBS glacé.
  4. Laver une fois avec 1 mL de PBS plus inhibiteurs de la protéase. Attendez que le tissu atteigne le fond du tube.
  5. Après le lavage, retirez le PBS avec une pipette de 1000 μL. Veillez à ne pas toucher le tissu.
    1. Alternativement, disséquer les glandes salivaires dans 5 mL de PBS pour éliminer le besoin de cette étape de lavage et passer à l’étape 3 en transférant les glandes salivaires à 0,5 mL du tampon de fixation Ruvkun décrit ci-dessous.

3. Fixation des tissus des glandes salivaires

  1. Après avoir retiré le PBS de la dernière étape, ajouter directement 0,5 mL de tampon de fixation Ruvkun 1x, avec 50% de méthanol (ajouter 0,5 mL de méthanol) et 2% de formaldéhyde.
    REMARQUE: 2x la solution de Ruvkun est 160 mM KCl, 40 mM NaCl, 20 mM EGTA, 30 mM PIPES à pH 7,4.
  2. Incuber pendant 2 heures à 4 °C avec une rotation douce.

4. Lavage des tissus des glandes salivaires

  1. Effectuer un lavage par rotation de 5 minutes avec 1 mL de tampon Tris/Triton (100 mM Tris pH 7,4, 1% Triton X-100 et 1 mM EDTA).
    REMARQUE: Attendez que le tissu atteigne le fond du tube.

5. Perméabilisation

  1. Incuber les glandes salivaires dans 1 mL de Tris/Triton X-100 (le même que ci-dessus). Pour certaines protéines, il peut être nécessaire d’ajouter 1% β-mercaptoéthanol.
  2. Incuber pendant 2 heures à 37 ° C avec une légère secousse (300 rpm).

6. Étape de préservation (facultatif)

REMARQUE: Si vous ne procèdez pas immédiatement à l’incubation avec l’anticorps, conservez le tissu comme suit.

  1. Laver avec 1 mL de tamponBO3 (0,01 MH3BO3 pH 9,2 + 0,01 M NaOH) puis incuber dansBO3/10mM de TNT à 37°C avec de légères secousses (300 rpm) pendant 15 minutes.
  2. A la fin de la période d’incubation, effectuer un lavage avec 1 mL de tamponBO3 seul.
    REMARQUE: Attendez que le tissu atteigne le fond du tube.
  3. Ajouter 1 mL de PBS. Conservez le tissu de cette solution à 4 °C jusqu’à 72 heures, puis passez à l’étape suivante. Cette étape est particulièrement utile lorsque vous travaillez avec différentes souches mutantes qui peuvent présenter un cycle de vie retardé, de sorte que l’immunodétection peut être effectuée en même temps avec les contrôles.

7. Blocage des tissus

  1. Incuber les glandes salivaires dans 1 mL de tampon B (PBS + 0,1% BSA + 0,5% Triton X-100 + 1 mM EDTA) pendant 2 heures à température ambiante avec rotation.

8. Immunomarquage

  1. Retirez tout le tampon B et ajoutez le tampon A (PBS + BSA 0,1%) plus l’anticorps d’intérêt.
    REMARQUE: Nous utilisons le HP1a C1A9c (anticorps concentré) de Hybridoma Bank jusqu’à 1:3000. Lors de l’utilisation des C1A9 (surnageant), nous avons essayé de 1:100 à une dilution de 1:500 et toute dilution entre ce rang fonctionne bien) pendant la nuit à 4 oC avec rotation. À ce stade, il est important que la secousse ne soulève pas de bulles qui pourraient endommager l’anticorps.

9. Lavage immunomarquage

  1. Effectuer des lavages de 3 x 15 minutes avec tampon B sous agitation à température ambiante en utilisant 1 mL à chaque fois.
  2. Transférer les glandes au tampon B avec l’anticorps secondaire couplé à un fluorophore pendant 2 heures sous rotation à 4 oC (l’anticorps secondaire Alexa fluor 568 Invitrogen a été utilisé 1:3000).
    1. Couvrez le tube avec une feuille de papier d’aluminium pour protéger l’anticorps secondaire de la lumière.
  3. Effectuer des lavages de 2 x 15 minutes à température ambiante en rotation avec 1 mL de tampon B.
  4. Incuber avec un marqueur d’ADN tel que Sytox (prendre 2 μL de stock de 5 mM et dissoudre dans 1 mL de tampon B) ou Hoechst (prendre 1 μL de stock de 10 mg/mL et dissoudre dans 1 mL de tampon B) pendant 10 minutes à température ambiante avec rotation.
  5. Effectuer un lavage avec le tampon B et une fois avec du PBS, chaque lavage durant 10 minutes tout en tournant à température ambiante.
    REMARQUE: N’oubliez pas de le protéger de la lumière.

10. Imagerie

  1. Montez les glandes salivaires sur un toboggan, en faisant une piscine avec une lamelle.
  2. Mettez les glandes salivaires au milieu de la piscine et couvrez de citifluor AF1 pour éviter la formation de bulles prolongeant le liquide visqueux partout. Ensuite, scellez tous les côtés avec du vernis à ongles clair.
  3. Observer sous un microscope à fluorescence ou confocal. Si l’échantillon ne doit pas être observé le même jour, conserver à l’abri de la lumière à 4 °C.
  4. Utilisez GraphPad Prism 6 pour générer tous les graphiques et analyses statistiques.
  5. Analyser les données de la distribution de HP1a dans les glandes salivaires en utilisant le test de Kruskal-Wallis. La signification statistique a été fixée à (p < 0,05*, < 0,01 **, < 0,001***, < 0,0001****).

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Résultats

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Les résultats représentatifs de l’immunomarquage de HP1a dans les glandes salivaires de la drosophile sont illustrés à la figure 1. Un résultat positif est d’observer un point focal(figure 1a)(agrégat ou condensat hétérochromatique). Un résultat négatif est l’absence de signal ou un signal dispersé. Parfois, un double signal peut être observé, c’est-à-dire avec un point double (Figure 1c), mais il se produit généralement en...

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Discussion

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La fonction cellulaire des organismes eucaryotes peut définir la structure 3D dans le noyau, qui est soutenue par des interactions entre différentes protéines avec la chromatine et diverses molécules, y compris l’ARN. Au cours des trois dernières années, les condensats biologiques qui ont eu de la pertinence, y compris l’hétérochromatine, ont joué un rôle fondamental dans la détermination de la séparation de phase favorisant l’organisation spatiale nucléaire distincte de la chromatine active et répressive

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Déclarations de divulgation

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Les auteurs déclarent qu’ils n’ont pas d’intérêts concurrents.

Remerciements

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Nous remercions Marco Antonio Rosales Vega et Abel Segura d’avoir pris certaines des images confocales, Carmen Muñoz pour la préparation des médias et le Dr Arturo Pimentel, M.C. Andrés Saralegui et le Dr Chris Wood de la LMNA pour des conseils sur l’utilisation des microscopes.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Tubes de microcentrifugation de 1,5 mLAxygen MCT-150-C11351904marque non critique
16 % formaldéhydeThermo Scientific28908
AF1 CitifluorTed pella1947025 mL
BSA, biologie moléculaire QualitéRoche10735078001marque non critique
Complet, inhibiteurs de protéase Ultra sans EDTA
protéase inhibiteurs		Merck5892953001
CoverslipCorningCLS285022-200EA22x22, marque non critique
DTTSigmad9779marque non critique
EDTASigmaE5134marque non critique
EGTAmarque non critique
Glissière en verreseal3011marque non critique
H3BO3Baker0084-01marque non critique
H3K9me3Abcam8889
HP1aHybridoma BankC1A9Forme du produit  ; Concentré 0,1 mL
KClBaker3040-01marque non critique
MéthanolBaker9070-03marque non critique
NaClSigma71376marque non critique
marque NaOHnon critique
PIPESnon critique
RotatorThermo Scientific13-687-12Q  ; Labquake Tube Shaker
Thermo Mixer CEppendorf13527550SmartBlock 1,5 mL
TrisMilipore648311marque non critique
Triton X-100SigmaT8787100 mL, marque non critique
&bêta ;-mercaptoéthanolBio-Rad161071025 mL, marque non critique
Gold marque

Références

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