Coloration immunofluorescente pour la visualisation des protéines associées à l’hétérochromatine dans les glandes salivaires de la drosophile

Résumé

Ce protocole vise à visualiser les agrégats d’hétérochromatine dans les cellules de polytène de drosophile.

Résumé

La visualisation des agrégats d’hétérochromatine par immunostaining peut être provocante. De nombreux composants mammifères de la chromatine sont conservés chez Drosophila melanogaster. Par conséquent, c’est un excellent modèle pour étudier la formation et l’entretien de l’hétérochromatine. Les cellules polyténisées, telles que celles trouvées dans les glandes salivaires des larves de D. melanogaster du troisième stade, fournissent un excellent outil pour observer la chromatine amplifiée près de mille fois et ont permis aux chercheurs d’étudier les changements dans la distribution de l’hétérochromatine dans le noyau. Bien que l’observation des composants de l’hétérochromatine puisse être effectuée directement dans des préparations chromosomiques polytènes, la localisation de certaines protéines peut être modifiée par la gravité du traitement. Par conséquent, la visualisation directe de l’hétérochromatine dans les cellules complète ce type d’étude. Dans ce protocole, nous décrivons les techniques immunostaining utilisées pour ce tissu, l’utilisation des anticorps fluorescents secondaires, et la microscopie confocale d’observer ces agrégats d’hétérochromatine avec une plus grande précision et détail.

Introduction

Depuis les premières études d’Emil Heitz^1,l’hétérochromatine a été considérée comme un régulateur important des processus cellulaires tels que l’expression des gènes, la séparation méiotique et mitotique des chromosomes et le maintien de la stabilité du génome^2,3,4.

L’hétérochromatine est principalement divisée en deux types: l’hétérochromatine constitutive qui définit de manière caractéristique les séquences répétitives, et les éléments transposables qui sont présents à des sites chromosomiques spécifiques tels que les télo....

Protocole

1. Culture de larves du troisième stade

1. Préparez 1 litre de milieux standards en ajoutant 100 g de levure, 100 g de sucre de canne entier non raffiné, 16 g de gélose, 10 mL d’acide propionique et 14 g de gélatine. Dissoudre tous les ingrédients sauf la levure dans 800 mL d’eau du robinet, puis dissoudre la levure. Autoclave immédiatement pendant 30 minutes.
   1. Ensuite, laissez le support refroidir à 60 °C et ajoutez l’acide propionique à une concentration finale de 0,01 %. Laissez la bouteille reposer jusqu’à ce que la gélatine soit formée.
2. Pour optimiser la culture de larves de 3o stades, collectez d’abord des adultes âgés de 5 à....

Résultats

Les résultats représentatifs de l’immunomarquage de HP1a dans les glandes salivaires de la drosophile sont illustrés à la figure 1. Un résultat positif est d’observer un point focal(figure 1a)(agrégat ou condensat hétérochromatique). Un résultat négatif est l’absence de signal ou un signal dispersé. Parfois, un double signal peut être observé, c’est-à-dire avec un point double (Figure 1c), mais il se produit généralement en.......

Discussion

La fonction cellulaire des organismes eucaryotes peut définir la structure 3D dans le noyau, qui est soutenue par des interactions entre différentes protéines avec la chromatine et diverses molécules, y compris l’ARN. Au cours des trois dernières années, les condensats biologiques qui ont eu de la pertinence, y compris l’hétérochromatine, ont joué un rôle fondamental dans la détermination de la séparation de phase favorisant l’organisation spatiale nucléaire distincte de la chromatine active et répressive

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Tubes de microcentrifugation de 1,5 mL	Axygen MCT-150-C	11351904	marque non critique
16 % formaldéhyde	Thermo Scientific	28908
AF1 Citifluor	Ted pella	19470	25 mL
BSA, biologie moléculaire Qualité	Roche	10735078001	marque non critique
Complet, inhibiteurs de protéase Ultra sans EDTA protéase inhibiteurs	Merck	5892953001
Coverslip	Corning	CLS285022-200EA	22x22, marque non critique
DTT	Sigma	d9779	marque non critique
EDTA	Sigma	E5134	marque non critique
EGTA			marque non critique
Glissière en verre	seal	3011	marque non critique
H3BO3	Baker	0084-01	marque non critique
H3K9me3	Abcam	8889
HP1a	Hybridoma Bank	C1A9	Forme du produit  ; Concentré 0,1 mL
KCl	Baker	3040-01	marque non critique
Méthanol	Baker	9070-03	marque non critique
NaCl	Sigma	71376	marque non critique
marque NaOH			non critique
PIPES			non critique
Rotator	Thermo Scientific	13-687-12Q	; Labquake Tube Shaker
Thermo Mixer C	Eppendorf	13527550	SmartBlock 1,5 mL
Tris	Milipore	648311	marque non critique
Triton X-100	Sigma	T8787	100 mL, marque non critique
&bêta ;-mercaptoéthanol	Bio-Rad	1610710	25 mL, marque non critique