Isolement des cellules valvulaires interstitielles de souris pour étudier la calcification de la valve aortique in vitro

Résumé

Cet article décrit l’isolement des cellules de valve aortique de souris par un procédé en deux étapes de collagénase. Les cellules valvulaires isolées de la souris sont importantes pour effectuer différents essais, tels que ce test de calcification in vitro, et pour étudier les voies moléculaires menant à la minéralisation de la valve aortique.

Résumé

La calcification des cellules de valve aortique est le cachet de la sténose aortique et est associée à la fibrose de cuspide de valve. Les cellules interstitielles valvulaires (VICs) jouent un rôle important dans le processus de calcification dans la sténose aortique par l’activation de leur programme de dédifférenciation aux cellules osteoblast-comme. Les circuits vit de souris sont un bon outil in vitro pour l’élucidation des voies de signalisation conduisant à la minéralisation de la cellule valvulaire aortique. La méthode décrite ici, utilisée avec succès par ces auteurs, explique comment obtenir des cellules fraîchement isolées. Un procédé en deux étapes de collagénase a été exécuté avec 1 mg/mL et 4.5 mg/mL. La première étape est cruciale pour enlever la couche cellulaire endothéliale et éviter toute contamination. La deuxième incubation de la collagénase consiste à faciliter la migration des CCI du tissu vers la plaque. En outre, un procédé de souillure d’immunofluorescence pour la caractérisation de phénotype des cellules d’isolement de valve de souris est discuté. En outre, l’analyse de calcification a été exécutée in vitro en utilisant le procédé de mesure de réactif de calcium et la souillure rouge d’alizarin. L’utilisation de la culture primaire de cellules de valve de souris est essentielle pour tester de nouvelles cibles pharmacologiques afin d’inhiber la minéralisation cellulaire in vitro.

Introduction

La valvulopathie aortique calcifiée (CAVD) est la maladie cardiaque valvulaire la plus répandue dans les populations occidentales, affectant près de 2,5 % des personnes âgées de plus de 65 ans^1. Le CAVD affecte plus de six millions d’Américains et est associé à des changements dans les propriétés mécaniques des folioles qui altèrent le flux sanguin normal^1,2. Actuellement, il n’existe aucun traitement pharmacologique pour arrêter la progression de la maladie ou pour activer la régression minérale. La seule thérapie efficace pour traiter le CAVD est le remplacement de la valve aortique par chirurgie ou le remplacement de la valve aortique transcathéter³. Il est donc impératif d’étudier les mécanismes moléculaires conduisant à la minéralisation valvulaire pour identifier de nouvelles cibles pharmacologiques. En effet, la sténose aortique non traitée a plusieurs conséquences néfastes telles que le dysfonctionnement du ventricule gauche et l’insuffisance cardiaque^4.

La valve aortique se compose de trois couches connues sous le nom de fibrosa, spongiosa, et ventriculaireis, qui contiennent des VICs comme type prédominant de cellules^5. La fibrose et le ventriculaire sont recouverts d’une couche de cellules endothéliales vasculaires (VECs)^5. Les VECs règlent la perméabilité des cellules inflammatoires ainsi que des signaux paracrines. Une augmentation du stress mécanique peut affecter l’intégrité des VECs et perturber l’homéostasie de la valve aortique, conduisant à une invasion cellulaire inflammatoire⁶. Les analyses de microscopie électronique de balayage ont montré l’endothélium perturbé dans une valve aortique calcifiée humaine^7.

Les analyses histologiques du tissu calcifié indiquent la présence des osteoblasts et des osteoclasts. En outre, la différenciation ostéogénique des CCI a été observée à la fois in vitro et dans le tissu valvulaire humain^8. Ce processus est principalement orchestré par le facteur de transcription lié à Runt 2 (Runx2) et les protéines morphogénétiques osseuses (PGO)^8,9.

Protocole

REMARQUE: Toutes les procédures animales décrites ici ont été approuvées par l’École de médecine Icahn du noyau institutionnel et du comité d’utilisation du Mont Sinaï.

1. Préparation avant l’isolement des cellules valvulaires de souris adultes

1. Nettoyer et stériliser tous les instruments chirurgicaux illustrés à la figure 1A en utilisant 70% d’éthanol v/v et ensuite les autoclaver pendant 30 min. nettoyer l’espace de travail chirurgical avec 70% d’éthanol.
2. Ajouter 500 μL de pénicilline-streptomycine à 50 mL de HEPES de 10 mm. Préparer une partie aliquote de 50 mL de 1x solution saline tamponnée au phosphate (PBS). Gardez les solutions sur la glace.
3. Préparer des solutions de collagénase de 1 mg/mL et de 4,5 mg/mL et utiliser 5 mL de chaque solution dans des tubes de 15 mL pour effectuer l’ensemble de la procédure. Pour préparer 5 mL de collagénase à 1 mg/mL, mélanger 5 mg de collagénase avec 2,5 mL de Milieu Eagle modifié de Dulbecco (DMEM, sérum fœtal bovin (FBS)-sans) et 2,5 mL de HEPES de 10 mM complétés par des antibiotiques (1 % de pénicilline-streptomycine de l’étape 1.2). Filtrer les solutions à travers un filtre de 0,22 μm pour éliminer toute contamination.
   REMARQUE: Gardez les solutions sur la glace pour protéger les enzymes.
4. Réchauffer la solution de DMEM à 37 °C avant utilisation dans toutes les étapes décrites ci-dessous. Préparer le milieu complet en complétant le DMEM avec 1 % de pénicilline-streptomycine, 1 % de pyruvate de sodium, 5 mL de L-glutamine de 200 mM, 1 mL de réactif d’élimination des mycoplasmes (voir la table des matériaux)et 10 % de FBS.

2. Isolement des cellules valvulaires

1. Pour obtenir 10⁶ cellules pour l’expérience, utilisez cinq souris âgées de 8 semaines (minimum de trois). Placez la souris dans une chambre d’induction avec un petit morceau de papier de soie imbibé de 1 mL d’isoflurane, mais ne permettez pas le contact avec le tissu. Pour confirmer que l’animal est entièrement anesthésié; vérifier le réflexe de pincement des pincements, puis euthanasier la souris par luxation cervicale. Utilisez l’isoflurane pour soulager toute douleur avant la luxation cervicale, car la procédure décrite ci-dessous est terminale.
2. Placez la souris sur une plate-forme de dissection et fixez les pattes avec des canules pour la maintenir en place. Nettoyez la poitrine et l’abdomen avec de l’éthanol; ouvrez l’abdomen et la poitrine avec des ciseaux. Avec de petits ciseaux chirurgicaux, coupez entre l’oreillette gauche et le ventricule gauche pour exsanguiner la souris. Imprérifez le cœur avec 10 ml de PBS 1x froid pour enlever le sang du cœur.
3. Couper le cœur et garder 3 mm de l’aorte ascendante comme le montre la figure 1B. Disséquer la valve aortique sous un stéréomicroscope. Couper le cœur horizontalement au milieu des ventricules(figure 1C). Couper le ventricule gauche vers l’aorte et disséquer soigneusement la valve aortique(figure 1D-F). Regroupez les valves dans un petit plat de culture de tissus de 35 mm.
4. Laver les valves isolées dans un plat de culture cellulaire de 75 mm avec 5 mL d’HEPES froid (10 mM) complété par des antibiotiques (1 % de pénicilline-streptomycine) pour éliminer le sang(figure 2). Préparer deux tubes de 15 mL de collagénase 1 mg/mL et 4,5 mg/mL comme décrit ci-dessus à l’étape 1.3.
   REMARQUE: Après la dissection, manipuler les valves isolées dans une hotte de biosécurité stérile pour minimiser la contamination.
5. Incuber les valves dans la collagénase de type I (1 mg/mL) pendant 30 min à 37 °C avec des secousses continues(figure 2). Centrifuger le tube pendant 5 min à 150 × g,laver la pastille une fois avec 2 mL d’HEPES (10 mM), et vortex pendant 30 s à grande vitesse. Versez le contenu de ce tube dans un plat de culture de 35 mm et transférez soigneusement les fragments de tissu à l’aide d’une pince à épiler mince dans un nouveau tube.
   REMARQUE: À ce stade, les circuits d’intérêt clés du réseau ne sont toujours pas dissociés du tissu et le culot contient des morceaux de tissu. Pour éviter la contamination par les cellules endothéliales, ne centrifugez pas après le vortex à l’étape 2.5.
6. Incuber le culot dans un tube de 15 mL avec 5 mL de collagénase de type I (4,5 mg/mL) à 37 °C sous agitation continue pendant 35 min. Suspendre à nouveau les cellules à l’aide d’une pipette de 1 mL pour séparer les cellules et centrifuger à 150 × g pendant 5 min à 4 °C.
7. Jetez le surnageant et re-suspendez le granulé dans 2 mL de DMEM complet. Centrifuger à 150 × g pendant 5 min à 4 °C. Répétez cette étape deux fois pour nettoyer les cellules.
   REMARQUE: Le culot aura toujours quelques fragments de tissu.
8. Re-suspendre le culot dans 1 mL de milieu complet, et plaquer les cellules dans un puits d’un plat de culture cellulaire de 6 puits dans une quantité minimale de milieu pour faciliter leur fixation à la boîte de culture. Laissez les cellules, intactes, dans un incubateur à 37 °C avec 5 % de dioxyde de carbone.
9. Après 3 jours, vérifiez les cellules au microscope pour vérifier une bonne croissance près des débris tissulaires. Une fois que 1 000 cellules sont visibles au microscope, retirez soigneusement les débris tissulaires à l’aide d’une pince autoclavée et changez le milieu.
   NOTA : La plaque ne doit pas être dérangée; si le nombre requis de cellules n’est pas observé, replacez le plat de culture cellulaire dans l’incubateur pendant encore 2 jours.
10. Lorsque les cellules sont confluentes à 70% (2,5 × 10^5),trypsiniser puis les transférer dans un plat de culture tissulaire de 75 mm.

3. Analyse de l’identité cellulaire et de la morphologie

REMARQUE: La coloration par immunofluorescence a été utilisée pour étudier la morphologie cellulaire et la contamination des cellules endothéliales.

1. Nettoyez la hotte avec 70% v/v/ éthanol. Placez les lamelles stériles (22 mm x 22 mm) dans des plaques à 6 puits.
   REMARQUE: Pour stériliser les lamules de couverture, lavez-les avec de l’éthanol à 70% et conservez-les dans le capot pendant la nuit sous la lumière ultraviolette.
2. Ensemencez 100 000 cellules par puits dans une plaque de 6 puits. Après 24 h, laver les cellules deux fois dans 1x PBS, et les fixer dans 4% de paraformaldéhyde (PFA) pendant 20 min. Lavez à nouveau les cellules deux fois avec 1x PBS.
   REMARQUE: À ce stade, les cellules pourraient être conservées dans du PBS à 4 °C jusqu’au début de la procédure de coloration.
3. Pour vérifier la pureté des CIRCUITS D’INTÉRÊT, utilisez l’actine alpha-muscle lisse (αSMA), la vimentine et le cluster de différenciation 31 (CD31) pour détecter la contamination par les VECs.
4. Préparer une partie aliquote du tampon de blocage en mélangeant 500 μL de sérum normal (la même espèce que l’anticorps secondaire), 9,5 mL de 1x PBS et 30 μL de Triton X-100. Incuber les cellules dans 2 mL du tampon de blocage pendant 1 h.
5. Préparer le tampon de dilution d’anticorps contenant 30 μL de Triton X-100, 10 mL de 1x PBS et 0,1 g d’albumine sérique bovine (BSA).
6. Prenez une boîte de pointes vide, remplissez la moitié de la boîte avec de l’eau pour créer une chambre humide. Couvrez le porte-pointe avec un mouchoir humide, puis avec une feuille de parafilm.
7. Prendre 1 μL de l’anticorps primaire, et le mélanger avec 100 μL du tampon de dilution préparé à l’étape 3.5. Placer 50 μL de l’anticorps dilué sur le parafilm. Prenez les lamaux des puits, retournez-les et placez-les sur le dessus des gouttes d’anticorps; incuber les cellules pendant la nuit avec l’anticorps.
8. Ajouter 1 mL de PBS dans la plaque de 6 puits. Retirez soigneusement la lamelle du parafilm, retournez-la et placez-la dans le puits. Laver les cellules avec une agitation douce continue pendant 5 min. Remplacer le système de fourchettes de prix par un nouveau système de fourchettes de prix; laver les cellules 3 fois.
9. Incuber les cellules avec l’anticorps secondaire dilué (1/500) (Alexa-488, Alexa-555) pendant 1 h. Ajouter 1 μL de l’anticorps secondaire à 500 μL du tampon de dilution d’anticorps (préparé à l’étape 3.5). Couvrez la plaque de papier d’aluminium. Laver les cellules 3 fois avec 1 mL de PBS 1x avec agitation continue.
10. Montez les lamelles avec 50 μL de milieu de montage au 4′,6-diamidino-2-phénylindole (DAPI) et observez les cellules au microscope pour analyser la morphologie des cellules et la contamination par le VEC.

4. Essai de calcification in vitro

1. Nettoyez la hotte avec de l’éthanol à 70%, réchauffez le milieu DMEM à 37 °C.
2. Ensemencez 100 000 cellules/condition dans des plaques de 6 puits en DMEM complet, et culturez pendant 24 h à 37 °C.
3. Préparer le milieu calcifiant en mélangeant 2 mM de_NaH2PO4,d’insuline 10-7 M et d’acide ascorbique 50 μg/mL dans du DMEM avec 5 % de FBS. Pour 93 mL de DMEM, ajouter 5 mL de FBS, 1 mL d’antibiotiques (concentration finale 1 %), 1 mL de pyruvate de sodium (100 mM), 27,5 mg de_NaH2PO4, 5,8 μL d’insuline et 5 mg d’acide ascorbique.
   REMARQUE : Filtrez la solution à l’aide d’un filtre de 0,22 μm avant utilisation.
4. Après 24 h, remplacez le milieu surnageant par le milieu calcifiant. Incuber les cellules pendant 7 jours à 37 °C. Le^3ème jour, remplacez par un milieu calcifiant frais et replacez la plaque dans l’incubateur pour compléter les 7 jours de traitement.
5. Après 7 jours, retirez le milieu et lavez les cellules deux fois avec 2 mL de 1x PBS. Incuber les cellules dans 1 mL d’acide chlorhydrique (HCl) 0,6 N pendant 24 h à 37 °C. Recueillir le HCl dans un tube de 1,5 mL et l’évaporer dans un évaporateur rotatif. Suspendre à nouveau le contenu de tous les tubes dans 60 μL de HCl.
   REMARQUE: La procédure de séchage est importante pour concentrer la solution et avoir le même volume pour chaque condition.
6. Utilisez une plaque de 96 puits pour mesurer la concentration de calcium à l’aide du réactif Arsenazo III, disponible dans une trousse prête à l’emploi (voir la table des matériaux pour plus de détails).
7. Préparer une solution étalon de calcium d’une concentration de 10 mg/dl. Peser 10 mg d’hydroxyde de calcium_(Ca(OH)2)et dissoudre dans 100 mL d’eau distillée.
8. Dans une plaque claire de 96 puits, piper 2 μL de solution à blanc (HCl, 0,6 N), la solution étalon, l’échantillon par puits (10 mg/dL) et les échantillons. Effectuer l’expérience en trois exemplaires pour vérifier la variabilité du pipetage. Ajouter 200 μL du réactif pour chaque condition.
   NOTA : Les échantillons supérieurs à 15 mg/dl doivent être dilués 1:1 avec une solution saline, réanalysés et le résultat multiplié par deux.
9. Incuber la réaction pendant 15 min à température ambiante.
   REMARQUE: La réaction est stable pendant 60 min.
10. Lire et enregistrer l’absorbance de la plaque à 650 nm. Utilisez la formule suivante pour calculer la quantité de calcium dans les échantillons :
    Calcium (mg/mL) = (Absorbance de l’échantillon/absorbance de l’étalon) × Concentration de l’étalon

Résultats

Comme les valves aortiques murines mesurent généralement 1 mm de diamètre, au moins trois valves doivent être regroupées pour recueillir un million de cellules viables pour différentes procédures expérimentales. Les différentes étapes du processus d’isolation VIC sont illustrées à la figure 1 et à la figure 2. Comme il est difficile de gratter manuellement le tissu valvulaire, il est préférable d’utiliser le stress de cisaillement créé par le vortexing pour élim...

Discussion

Cet article présente un protocole détaillé d’isolement de cellules de valve de souris pour la culture primaire. Trois valves aortiques de souris de 8 semaines ont été mises en commun pour obtenir un nombre proportionné de cellules. De plus, ce protocole décrit la caractérisation du phénotype VIC et l’analyse de minéralisation in vitro. La méthode a été adaptée du protocole précédemment décrit de Mathieu et al.^7.

Lors de l’isolement des valves aortique...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Ciseaux tranchants de 3 mm	F.S.T	15000-00
Muscle lisse anti-alpha Anticorps anti-actine	abcam
Anti-souris, conjugué Alexa Fluor 488	Signalisation cellulaire	4412
Ensemble de réactifs Arsenazo-III	POINT SCIENTIFIC	C7529-500	un kit pour mesurer la concentration de calcium
Ciseaux de Bonn	F.S.T	14184-09
Hydroxyde de calcium	SIGMA -Aldrich 31219	31219
CD31	Novusbio
Collagénase de type I  ; (125 unités/mg)	Thermofisher Scientific	17018029
DMEM	Tthermofisher	11965092
Pince Graefe extra fine	F.S.T	11150-10
FBS	Gibco 16000044
Pince fine	F.S.T Dumont
HCl	SIGMA-ALDRICH	H1758
HEPES 1 M solution	STEMCELLS TECHNOLOGIES
L-Glutamine 100x	Thermofisher Scientific	A2916801
Mycozap	Lanza	VZA-2011	Réactif d’élimination des mycoplasmes
PBS 10x	SIGMA-ALDRICH
pénicilline streptomycine 100x	Thermofisher Scientific	10378016
Pyruvate de sodium 100 mM	Thermofisher Scientific
Pince à motif standard	; F.S.T	11000-12
Ciseaux chirurgicaux - Sharp-Blunt	F.S.T	14008-14
Trypsine 0.05 %	Thermofisher Scientific	25300054
Vimentin	abcam