Profilage des composés volatils dans les fruits de cassis à l’aide de la microextraction en phase solide de l’espace de tête couplée à la chromatographie en phase gazeuse-spectrométrie de masse

La saveur est un trait de qualité essentiel pour tout fruit, ayant un impact sur l’acceptation des consommateurs et affectant ainsi considérablement la commercialisation. La perception de la saveur implique une combinaison des systèmes gustatif et olfactif et dépend chimiquement de la présence et de la concentration d’un large éventail de composés qui s’accumulent dans les parties comestibles de la plante ou, dans le cas des COV, sont émis par le fruit ^mûr1,2. Alors que la sélection traditionnelle s’est concentrée sur des caractéristiques agronomiques telles que le rendement et la résistance aux ravageurs, l’amélioration des caractéristiques de qualité des fruits, y compris la saveur, a longtemps été négligée en raison de la complexité génétique et de la difficulté de phénotyper correctement ces caractéristiques, ce qui a entraîné le mécontentement des ^{consommateurs3,4}. Les progrès récents des plateformes métabolomiques ont permis d’identifier et de quantifier les composés clés responsables du goût et de ^l’arôme des ^{fruits5,6,7,8}. De plus, la combinaison du profilage des métabolites avec des outils génomiques ou transcriptomiques permet d’élucider la génétique sous-jacente à la saveur des fruits, ce qui aidera les programmes de sélection à développer de nouvelles variétés aux caractéristiques organoleptiques améliorées2,4,9,10,11,12,13,14.

Les baies de cassis (Ribes nigrum) sont très appréciées pour leur saveur et leurs propriétés nutritionnelles, étant largement cultivées dans les zones tempérées d’Europe, d’Asie et de Nouvelle-Zélande15. La majeure partie de la production est transformée pour les produits alimentaires et les boissons, qui sont très populaires dans les pays nordiques, principalement en raison des propriétés organoleptiques des baies. La couleur et la saveur intenses du fruit sont le résultat d’une combinaison d’anthocyanes, de sucres, d’acides et de COV présents dans les fruits mûrs16,17,18. L’analyse des volatiles du cassis remonte aux années 196019,20,21. Plus récemment, plusieurs études se sont concentrées sur les COV de cassis, identifiant des composés importants pour la perception de l’arôme des fruits et évaluant l’impact du génotype, de l’environnement ou des conditions de stockage et de traitement sur la teneur en COV5,17,18,22,23.

En raison de ses nombreux avantages, la technique de choix pour le profilage volatil à haut débit est HS-SPME/GC-MS24,25. Une fibre de silice, recouverte d’une phase polymère, est montée sur un dispositif de seringue, permettant l’adsorption des volatiles dans la fibre jusqu’à ce qu’une phase d’équilibre soit atteinte. L’extraction de l’espace de tête protège la fibre des composés non volatils présents dans la ^matrice24. SpME peut isoler avec succès un grand nombre de COV présents à des concentrations très variables (parties par milliard à parties par million)²⁵. De plus, il s’agit d’une technique sans solvant qui nécessite un traitement limité des échantillons. Les autres avantages de HS-SPME sont la facilité d’automatisation et son coût relativement faible.

Cependant, son succès peut être limité, en fonction de la nature chimique des COV, du protocole d’extraction (y compris le temps, la température et la concentration en sel), de la stabilité de l’échantillon et de la disponibilité de tissus fruitiers ^{suffisants26,27}. Cet article présente un protocole pour les COV de cassis isolés par HS-SPME et analysés par chromatographie en phase gazeuse couplés à un spectromètre de masse à piège à ions. Un équilibre entre la quantité de matière végétale, la stabilité de l’échantillon et la durée d’extraction et de chromatographie a été atteint pour pouvoir traiter un grand nombre d’échantillons de cassis, dont certains présentés dans cette étude. En particulier, les profils de COV et/ou les chromatogrammes de cinq cultivars (« Andega », « Ben Tron », « Ben Gairn », « Ben Tirran » et « Tihope ») seront présentés et discutés à titre d’exemples de données. En outre, le même protocole a été mis en pratique avec succès pour la mesure des COV chez d’autres espèces de baies de fruits telles que la fraise (Fragaria x ananassa), la framboise (Rubusidaeus) et la myrtille (Vaccinium spp.).

1. Récolte des fruits

1. Cultiver entre 4 et 6 plantes par génotype et/ou traitement pour assurer une matière fruitière et une variabilité suffisantes.
2. Si possible, récolter les échantillons à la même date; s’il n’y a pas assez de matières fruitières, regrouper les échantillons récoltés à des dates différentes.
   REMARQUE: Il est recommandé que l’heure de la récolte (matin, midi, après-midi) reste à peu près identique car les profils de COV sont affectés par le rythme diurne / circadien28,29,30,31.
3. Évaluer le stade de maturation des fruits par observation ^visuelle32. Mettre en commun les fruits du même stade de maturation, car l’état de maturation a un impact important sur les émissions de COV. Jetez tous les fruits endommagés ou infectés par des agents pathogènes.
   REMARQUE: Pour mieux évaluer la maturité des fruits, une analyse de texture peut être ^effectuée33. En outre, le comptage des jours après la floraison peut être utilisé pour s’assurer que les fruits mis en commun appartiennent à un stade de maturation similaire.
4. Inclure un minimum de 10 à 15 fruits par réplique biologique (3 à 5) pour l’analyse des COV.
   NOTE: Ici, trois pools distincts de 13 à 20 fruits (répliques biologiques) de « Andega », « Ben Tron », « Ben Gairn », « Ben Tirran » et « Tihope » cultivars ont été récoltés dans deux endroits (Pologne et Écosse) à l’été 2018 et directement congelés dans de l’azote liquide. Les échantillons ont ensuite été envoyés au laboratoire et traités comme décrit ci-dessous.
5. Une fois récoltés, congeler immédiatement tous les fruits dans de l’azote liquide, puis les conserver à -80 °C jusqu’au traitement.
   REMARQUE: Si possible, les fruits peuvent être directement transformés après la récolte. Dans ce cas, les fruits frais peuvent être homogénéisés dans un mélangeur, pesés et directement analysés (étape 3.1 et suivantes). Toutefois, pour éviter que les fruits ne subissent d’autres processus de dégradation après la récolte, la matière fraîche doit être stockée dans une glacière (4 °C) et traitée le plus rapidement possible. S’il n’est pas manipulé correctement, l’azote liquide peut produire des brûlures froides et provoquer une asphyxie dans des espaces mal ventilés.

2. Préparation de l’échantillon de fruits et du réactif

1. Broyer les fruits en une poudre fine, en prenant soin de toujours les garder congelés à l’aide d’azote liquide. Utilisez un broyeur cryogénique, un broyeur à billes ou un mortier et un pilon pour l’homogénéisation. Prérefroidir les pots de broyage en acier inoxydable ou le mortier et le pilon avec de l’azote liquide pour éviter la décongélation des échantillons.
   REMARQUE: Il est essentiel d’homogénéiser les échantillons en une poudre fine pour assurer une extraction correcte des COV.
2. Peser 1 g de matière congelée (à partir de l’étape 2.1.) dans un tube de 5 mL préalablement refroidi à l’azote liquide et noter le poids exact. Conserver le matériau à -80 °C jusqu’à l’étape de traitement 3.1.
3. Inclure des échantillons « de référence » ou de « contrôle » dans l’analyse pour vérifier les variations techniques, y compris l’extraction des COV et les performances HS-SPME/GC-MS. À cette fin, regrouper un mélange d’échantillons de fruits choisis au hasard et inclure au moins un échantillon témoin par jour pour l’analyse des COV. De plus, utilisez une norme interne, comme décrit à l’étape 2.5., pour minimiser l’impact de la dérive d’intensité.
4. Préparer une solution de chlorure de sodium à 20 % (p/v) dans de l’eau de qualité chromatographie liquide à haute performance (CLHP) (ci-après dénommée solution de NaCl). Dissoudre le NaCl à l’aide d’un agitateur magnétique; s’assurer de la disponibilité de 1 mL de la solution par échantillon.
5. Préparer une solution de 1 ppm dans du méthanol de qualité CLHP de N-pentadécane (D32, 98 %) de la norme commerciale pure (ci-après, appelée l’étalon interne).
   REMARQUE: N-pentadécane-d32 sera utilisé comme étalon interne, et 5 μL par échantillon seront nécessaires. Le méthanol doit être manipulé sous une hotte aspirante.
6. Préparer des solutions de 1 ppm dans du méthanol de qualité CLHP conforme aux normes commerciales pures pour l’identification des COV (voir le tableau 1 pour la liste des normes commerciales utilisées dans cette étude).
7. Préparez des flacons d’espace de tête à bouchon à vis de 10 mL en ajoutant 0,5 g de NaCl dans chaque flacon nécessaire. Assurez-vous que les bouchons à vis comprennent un septum composé d’un matériau souple, c’est-à-dire du silicone, avec un mince film de polytétrafluoroéthylène sur la face interne, pour éviter toute contamination.

3. Préparation de l’échantillon

1. Ajouter 1 mL de solution de NaCl dans le tube de 5 mL contenant l’échantillon congelé pesé. Agiter le tube jusqu’à ce que l’échantillon soit complètement décongelé et homogénéisé.
2. Centrifuger à 5000 × g pendant 5 min à température ambiante.
3. Transférer le surnageant avec une pointe de pipette de 1000 μL dans le flacon d’espace de tête contenant du NaCl. Coupez l’extrémité de la pointe pour faciliter ce processus.
4. Ajouter 5 μL d’étalon interne à chaque flacon d’espace de tête contenant un échantillon.

4. Acquisition de données HS-SPME/GC-MS

1. Placez le flacon d’espace de tête fermé dans un échantillonneur automatique GC-MS à température ambiante, pour une exécution automatisée HS-SPME/GC-MS, décrite à la section 4. Ne placez pas de répliques biologiques dans des positions successives dans l’échantillonneur automatique; au lieu de cela, répartissez-les au hasard pour minimiser l’impact de la dérive d’intensité.
   REMARQUE: Environ 10 à 12 flacons peuvent être placés à la fois dans l’échantillonneur automatique, sans affecter la stabilité de l’échantillon.
2. Préincuber les flacons d’espace de tête 10 min à 50 °C avec agitation à 17 x g.
3. Insérez un dispositif SPME dans le flacon pour exposer la fibre à l’espace de tête pour l’extraction des COV pendant 30 min à 50 °C avec agitation à 17 x g.
4. Introduire la fibre dans l’orifice d’injection pendant 1 min à 250 °C en mode splitless pour une désorption volatile.
5. Nettoyez la fibre dans une station de nettoyage SPME avec de l’azote (1 bar _N2, ≥ pur à 99,8 %) pendant 5 min à 250 °C. Réutilisez la fibre environ 100x.
6. Analyser les COV avec un chromatographe en phase gazeuse couplé à un spectromètre de masse à piège à ions (voir le tableau des matériaux), et effectuer la chromatographie sous un flux constant d’hélium (He ≥ pureté de 99,9999%) de 1 mL / min, avec une colonne de dimensions de 60 m x 0,25 mm x 1 μm d’épaisseur. Utilisez un programme de température du four isotherme à 40 °C pendant 3 min, suivi d’une rampe de 8 °C/min à 250 °C et en maintenant à 250 °C pendant 5 min. Pour la spectrométrie de masse, réglez la température de la ligne de transfert et de la source d’ions à 260 °C et 230 °C, respectivement. Réglez l’énergie d’ionisation sur 70 eV et la plage de masse enregistrée sur m/z 35-220 à 6 balayages par s.
7. Extraire et analyser des solutions de 1 ppm de normes commerciales comme décrit ci-dessus. En outre, exécuter un mélange contenant tous les étalons commerciaux dilués mélangés à une solution de NaCl de 300 μL et à 900 μL d’eau de qualité CLHP avant l’acquisition des données de l’échantillon pour vérifier l’étalonnage correct de l’équipement. De plus, inclure un échantillon vierge contenant une solution de NaCl seule dans chaque lot.

5. Analyse des chromatogrammes de profil GC-MS : identification et semi-quantification des COV

1. Ouvrez les fichiers de profil GC-MS bruts avec le logiciel fourni par le fabricant. Pour identifier les composés, comparez leurs temps de rétention et leurs spectres de masse et les indices de rétention linéaires de Kovats déterminés à partir des chromatogrammes des échantillons avec les indices de rétention obtenus à partir d’étalons authentiques. Pour chaque norme commerciale, annotez le temps de rétention et les ions m/z les plus abondants. Sélectionnez ensuite un ion m/z spécifique pour chaque COV (tableau 1).
2. Intégrez automatiquement les pics de COV en fonction des temps de rétention standard et des ions m/z choisis des fichiers bruts GC-MS sélectionnés. Pour cela, fournissez une liste pour chaque COV avec le temps de rétention et l’ion m/z sélectionné. Bien que le logiciel intègre automatiquement la zone de crête correspondant au même temps de rétention et à l’ion m/z que ceux fournis dans la configuration de la séquence, vérifiez l’intégration correcte de chaque pic et corrigez-la manuellement si nécessaire.
3. Calculer la zone de crête de chaque COV par rapport à celle de l’étalon interne afin de minimiser la variation instrumentale et la dérive d’intensité.
   REMARQUE: Lors de l’analyse de fruits de différents génotypes ou conditions de croissance et de stockage, il est fortement recommandé de déterminer la teneur en COV par rapport à la teneur en poids sec du fruit afin d’exclure les effets de dilution dus aux différences de teneur en eau.
4. Pour la correction de l’effet de lot, normalisez la zone de crête de COV de chaque échantillon à la zone de crête correspondante dans l’échantillon de contrôle analysé au cours de la même série.
   NOTE: Une quantification relative des COV est obtenue; toutefois, aux fins de l’expérience, la teneur en COV peut ensuite être déterminée par rapport à n’importe quel échantillon (p. ex., fruits non traités pour comparer l’effet de l’entreposage sur les concentrations de COV).

Le profilage des COV à haut débit dans un grand nombre de cultures fruitières cultivées dans des conditions ou des emplacements différents ou appartenant à des génotypes distincts est nécessaire pour un phénotypage précis des arômes. Ici, une plate-forme HS-SPME/GC-MS rapide et semi-automatisée pour la quantification relative des COV dans les cultivars de cassis est présentée. La détection et l’identification des COV étaient fondées sur une bibliothèque qui a été élaborée pour établir le profil des espèces de fruits à baies (tableau 1). Un profil volatil typique de cassis mûr (chromatogramme ionique total) obtenu par HS-SPME/GC-MS dans les conditions susmentionnées est illustré à la figure 1A. Au total, 63 COV ont été identifiés, appartenant à plusieurs classes chimiques, la majorité étant des esters (27), des aldéhydes (12), des alcools (8), des cétones (7), des terpènes (5) et des furanes (3) (tableau 1).

Les composés terpénoïdes, les esters et les composés en C6 ont été décrits comme dominant le volatilome du cassis et comme étant importants pour l’arôme du fruit frais5,17. En accord avec ces études antérieures, certains des pics les plus abondants observés dans la figure 1A correspondent à deux monoterpènes (linalol et terpinéol) et deux composés en C6 ((E)-2-hexénal et (Z)-3-hexénal). Des exemples de spectres de masse obtenus à partir de profils de cassis et leur comparaison avec les spectres d’étalons commerciaux purs sont présentés pour (E)-2-hexénal et terpinéol dans les figures 1B et 1C, respectivement.

Figure 1: Chromatogrammes représentatifs de fruits mûrs de cassis obtenus par HS-SPME/GC-MS (à partir du cultivar 'Andega'). (A) Chromatogramme ionique total. Les pics (Z)-3-hexénal (temps de rétention 14,33 min), (E)-2-hexénal (15,86 min), linalol (21,65 min) et terpinéol (24,01 min) sont indiqués par les chiffres 1, 2, 3 et 4, respectivement. (B) Spectre massique correspondant au pic (E)-2-hexénal à partir d’un profil de cassis et comparaison avec une norme commerciale pure. (C) Spectre massique correspondant au pic de terpinéol à partir d’un profil de cassis et comparaison avec une norme commerciale pure. Abréviation : HS-SPME/GC-MS = microextraction en phase solide de l’espace de tête couplée à la chromatographie en phase gazeuse-spectrométrie de masse. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Alors que les terpènes ont été décrits comme des indicateurs de la fraîcheur des fruits de cassis, les composés C6 sont connus sous le nom de « volatiles des feuilles vertes », conférant des notes « vertes » à l’arôme des fruits et légumes34. Ainsi, la semi-quantification de ces COV émis par les fruits mûrs de différentes variétés de cassis peut être la première étape dans l’amélioration des traits liés à la saveur. En outre, étant donné que l’environnement et les conditions de croissance des plantes ont un impact important sur la teneur en COV des fruits, ce qui est l’un des principaux inconvénients de la sélection aromatique, l’un des objectifs de cette étude était de valider l’hypothèse selon laquelle la semi-quantification des COV identifiés dans les mêmes cultivars (« Ben Tron », « Ben Gairn », « Ben Tirran » et « Tihope ») était reproductible dans des endroits européens diamétralement opposés tels que la Pologne et l’Écosse. Comme prévu, l’analyse en composantes principales (APC) des profils de COV de quatre cultivars de cassis différents a montré que l’environnement a un impact important sur le contenu volatil, car le composant principal (PC) 1 sépare les échantillons en fonction de leur emplacement (Figure 2). Cependant, l’effet du génotype peut être observé avec le PC2, car « Ben Tirran » est clairement séparé des cultivars restants (Figure 2).

La figure 3 montre la teneur relative en linalol et en (E)-2-hexénal dans les quatre cultivars de cassis évalués. Pour les deux emplacements, la teneur en COV a été normalisée sur le même échantillon témoin, pour lequel la semi-quantification a confirmé que la teneur en linalol était généralement plus élevée en Pologne qu’en Écosse, tandis que (E)-2-hexénal montre la tendance inverse (figure 3). Ce résultat démontre l’impact environnemental sur la teneur en COV des fruits de cassis, bien que la proportion des deux substances volatiles présentes dans les quatre cultivars évalués soit constante, les cultivars « Ben Tirran » et « Ben Tron » affichant les plus grandes quantités de linalol et de (E)-2-hexénal, respectivement (figure 3). Pris ensemble, ces résultats indiquent que la méthode proposée est valide pour la teneur en phénotype des COV et, combinée à des approches génétiques, peut être utilisée aux fins de la sélection de la qualité des fruits.

Figure 2 : APC pour évaluer la variance entre les profils de COV dans les quatre cultivars de cassis cultivés en Pologne et en Écosse. PC1 (environnement) explique 46,2 % de la variabilité, tandis que PC2 (génotype) contribue à 24,8 % de la variance de l’ensemble de données. Abréviations : APC = analyse en composantes principales; PC1 = premier composant principal; PC2 = deuxième composante principale; COV = composé organique volatil. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 3 : Teneur relative de deux COV représentatifs dans les profils aromatiques de cassis -linalol et (E)-2-hexénal, récoltés en Écosse et en Pologne. Quatre cultivars de cassis différents ont été évalués (« Ben Gairn », « Ben Tirran », « Ben Tron » et « Tihope »). Les barres représentent les valeurs moyennes de deux réplicats biologiques, et les barres d’erreur représentent l’écart-type. Des comparaisons statistiques ont été effectuées par ANOVA unidirectionnelle suivie du test post-hoc de Tukey pour déterminer les différences significatives dans la teneur en COV entre les cultivars et les pays. Pour les teneurs en COV avec les mêmes lettres minuscules (a, ab, b), aucune différence significative n’a été observée à P < 0,05. Abréviations : COV = composés organiques volatils; ANOVA = analyse de la variance. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Tableau 1 : Liste des COV identifiés par HS-SPME/GC-MS dans les cassis. Le temps de rétention (min), l’ion m/z sélectionné pour l’identification et la semi-quantification des COV, la description de l’arôme, la classe chimique et la formule, ainsi que le numéro CAS sont indiqués. Abréviations : HS-SPME/GC-MS = espace de tête microextraction en phase solide couplée à la chromatographie en phase gazeuse-spectrométrie de masse ; COV = composés organiques volatils; KRI = indice de rétention de Kovats; Numéro CAS = Numéro d’enregistrement du Chemical Abstracts Service. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.

Les auteurs ne déclarent aucun conflit d’intérêts.