Article de méthode

Profilage des composés volatils dans les fruits de cassis à l’aide de la microextraction en phase solide de l’espace de tête couplée à la chromatographie en phase gazeuse-spectrométrie de masse

DOI :

10.3791/62421

⸱

9 juin 2021

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1Departamento de Biología Molecular y Bioquímica, Campus de Teatinos, Instituto de Hortofruticultura Subtropical y Mediterránea “La Mayora”, Universidad de Málaga-Consejo Superior de Investigaciones Científicas

Dans cet article

Résumé

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Une plate-forme de microextraction-chromatographie en phase solide et de chromatographie en phase gazeuse est décrite ici pour une identification et une quantification rapides, fiables et semi-automatisées des volatiles dans les fruits mûrs du cassis. Cette technique peut être utilisée pour augmenter les connaissances sur l’arôme des fruits et pour sélectionner des cultivars à saveur améliorée à des fins de sélection.

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

On s’intéresse de plus en plus à la mesure des composés organiques volatils (COV) émis par les fruits mûrs dans le but de sélectionner des variétés ou des cultivars aux caractéristiques organoleptiques améliorées et, par conséquent, d’accroître l’acceptation des consommateurs. Des plateformes métabolomiques à haut débit ont récemment été développées pour quantifier un large éventail de métabolites dans différents tissus végétaux, y compris des composés clés responsables du goût des fruits et de la qualité des arômes (volatilomique). Une méthode utilisant la microextraction en phase solide de l’espace de tête (HS-SPME) couplée à la chromatographie en phase gazeuse-spectrométrie de masse (GC-MS) est décrite ici pour l’identification et la quantification des COV émis par les fruits mûrs de cassis, une baie très appréciée pour sa saveur et ses bienfaits pour la santé.

Les fruits mûrs des plantes de cassis (Ribes nigrum) ont été récoltés et directement congelés dans de l’azote liquide. Après homogénéisation tissulaire pour produire une poudre fine, les échantillons ont été décongelés et immédiatement mélangés avec une solution de chlorure de sodium. Après centrifugation, le surnageant a été transféré dans un flacon en verre contenant du chlorure de sodium. Les COV ont ensuite été extraits à l’aide d’une fibre de microextraction en phase solide (SPME) et d’un chromatographe en phase gazeuse couplé à un spectromètre de masse à piège à ions. La quantification volatile a été effectuée sur les chromatogrammes ioniques résultants en intégrant la zone de crête, en utilisant un ion m/z spécifique pour chaque COV. L’annotation correcte des COV a été confirmée en comparant les temps de rétention et les spectres de masse des étalons commerciaux purs exécutés dans les mêmes conditions que les échantillons. Plus de 60 COV ont été identifiés dans des fruits mûrs de cassis cultivés dans des endroits européens contrastés. Parmi les COV identifiés, des composés aromatiques clés, tels que les terpénoïdes et les volatiles C6, peuvent être utilisés comme biomarqueurs de la qualité des fruits de cassis. En outre, les avantages et les inconvénients de la méthode sont discutés, y compris les améliorations prospectives. En outre, l’utilisation de contrôles pour la correction des lots et la minimisation de l’intensité de la dérive a été soulignée.

Introduction

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La saveur est un trait de qualité essentiel pour tout fruit, ayant un impact sur l’acceptation des consommateurs et affectant ainsi considérablement la commercialisation. La perception de la saveur implique une combinaison des systèmes gustatif et olfactif et dépend chimiquement de la présence et de la concentration d’un large éventail de composés qui s’accumulent dans les parties comestibles de la plante ou, dans le cas des COV, sont émis par le fruit mûr1,2. Alors que la sélection traditionnelle s’est concentrée sur des caractéristiques agronomiques telles que le rendement et la résistance aux ravageurs, l’amélioration des caractéristiques de qualité des fruits, y compris la saveur, a longtemps été négligée en raison de la complexité génétique et de la difficulté de phénotyper correctement ces caractéristiques, ce qui a entraîné le mécontentement des consommateurs3,4. Les progrès récents des plateformes métabolomiques ont permis d’identifier et de quantifier les composés clés responsables du goût et de l’arôme des fruits5,6,7,8. De plus, la combinaison du profilage des métabolites avec des outils génomiques ou transcriptomiques permet d’élucider la génétique sous-jacente à la saveur des fruits, ce qui aidera les programmes de sélection à développer de nouvelles variétés aux caractéristiques organoleptiques améliorées2,4,9,10,11,12,13,14.

Les baies de cassis (Ribes nigrum) sont très appréciées pour leur saveur et leurs propriétés nutritionnelles, étant largement cultivées dans les zones tempérées d’Europe, d’Asie et de Nouvelle-Zélande15. La majeure partie de la production est transformée pour les produits alimentaires et les boissons, qui sont très populaires dans les pays nordiques, principalement en raison des propriétés organoleptiques des baies. La couleur et la saveur intenses du fruit sont le résultat d’une combinaison d’anthocyanes, de sucres, d’acides et de COV présents dans les fruits mûrs16,17,18. L’analyse des volatiles du cassis remonte aux années 196019,20,21. Plus récemment, plusieurs études se sont concentrées sur les COV de cassis, identifiant des composés importants pour la perception de l’arôme des fruits et évaluant l’impact du génotype, de l’environnement ou des conditions de stockage et de traitement sur la teneur en COV5,17,18,22,23.

En raison de ses nombreux avantages, la technique de choix pour le profilage volatil à haut débit est HS-SPME/GC-MS24,25. Une fibre de silice, recouverte d’une phase polymère, est montée sur un dispositif de seringue, permettant l’adsorption des volatiles dans la fibre jusqu’à ce qu’une phase d’équilibre soit atteinte. L’extraction de l’espace de tête protège la fibre des composés non volatils présents dans la matrice24. SpME peut isoler avec succès un grand nombre de COV présents à des concentrations très variables (parties par milliard à parties par million)25. De plus, il s’agit d’une technique sans solvant qui nécessite un traitement limité des échantillons. Les autres avantages de HS-SPME sont la facilité d’automatisation et son coût relativement faible.

Cependant, son succès peut être limité, en fonction de la nature chimique des COV, du protocole d’extraction (y compris le temps, la température et la concentration en sel), de la stabilité de l’échantillon et de la disponibilité de tissus fruitiers suffisants26,27. Cet article présente un protocole pour les COV de cassis isolés par HS-SPME et analysés par chromatographie en phase gazeuse couplés à un spectromètre de masse à piège à ions. Un équilibre entre la quantité de matière végétale, la stabilité de l’échantillon et la durée d’extraction et de chromatographie a été atteint pour pouvoir traiter un grand nombre d’échantillons de cassis, dont certains présentés dans cette étude. En particulier, les profils de COV et/ou les chromatogrammes de cinq cultivars (« Andega », « Ben Tron », « Ben Gairn », « Ben Tirran » et « Tihope ») seront présentés et discutés à titre d’exemples de données. En outre, le même protocole a été mis en pratique avec succès pour la mesure des COV chez d’autres espèces de baies de fruits telles que la fraise (Fragaria x ananassa), la framboise (Rubusidaeus) et la myrtille (Vaccinium spp.).

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Protocole

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1. Récolte des fruits

  1. Cultiver entre 4 et 6 plantes par génotype et/ou traitement pour assurer une matière fruitière et une variabilité suffisantes.
  2. Si possible, récolter les échantillons à la même date; s’il n’y a pas assez de matières fruitières, regrouper les échantillons récoltés à des dates différentes.
    REMARQUE: Il est recommandé que l’heure de la récolte (matin, midi, après-midi) reste à peu près identique car les profils de COV sont affectés par le rythme diurne / circadien28,29,30,31.
  3. Évaluer le stade de maturation des fruits par observation visuelle32. Mettre en commun les fruits du même stade de maturation, car l’état de maturation a un impact important sur les émissions de COV. Jetez tous les fruits endommagés ou infectés par des agents pathogènes.
    REMARQUE: Pour mieux évaluer la maturité des fruits, une analyse de texture peut être effectuée33. En outre, le comptage des jours après la floraison peut être utilisé pour s’assurer que les fruits mis en commun appartiennent à un stade de maturation similaire.
  4. Inclure un minimum de 10 à 15 fruits par réplique biologique (3 à 5) pour l’analyse des COV.
    NOTE: Ici, trois pools distincts de 13 à 20 fruits (répliques biologiques) de « Andega », « Ben Tron », « Ben Gairn », « Ben Tirran » et « Tihope » cultivars ont été récoltés dans deux endroits (Pologne et Écosse) à l’été 2018 et directement congelés dans de l’azote liquide. Les échantillons ont ensuite été envoyés au laboratoire et traités comme décrit ci-dessous.
  5. Une fois récoltés, congeler immédiatement tous les fruits dans de l’azote liquide, puis les conserver à -80 °C jusqu’au traitement.
    REMARQUE: Si possible, les fruits peuvent être directement transformés après la récolte. Dans ce cas, les fruits frais peuvent être homogénéisés dans un mélangeur, pesés et directement analysés (étape 3.1 et suivantes). Toutefois, pour éviter que les fruits ne subissent d’autres processus de dégradation après la récolte, la matière fraîche doit être stockée dans une glacière (4 °C) et traitée le plus rapidement possible. S’il n’est pas manipulé correctement, l’azote liquide peut produire des brûlures froides et provoquer une asphyxie dans des espaces mal ventilés.

2. Préparation de l’échantillon de fruits et du réactif

  1. Broyer les fruits en une poudre fine, en prenant soin de toujours les garder congelés à l’aide d’azote liquide. Utilisez un broyeur cryogénique, un broyeur à billes ou un mortier et un pilon pour l’homogénéisation. Prérefroidir les pots de broyage en acier inoxydable ou le mortier et le pilon avec de l’azote liquide pour éviter la décongélation des échantillons.
    REMARQUE: Il est essentiel d’homogénéiser les échantillons en une poudre fine pour assurer une extraction correcte des COV.
  2. Peser 1 g de matière congelée (à partir de l’étape 2.1.) dans un tube de 5 mL préalablement refroidi à l’azote liquide et noter le poids exact. Conserver le matériau à -80 °C jusqu’à l’étape de traitement 3.1.
  3. Inclure des échantillons « de référence » ou de « contrôle » dans l’analyse pour vérifier les variations techniques, y compris l’extraction des COV et les performances HS-SPME/GC-MS. À cette fin, regrouper un mélange d’échantillons de fruits choisis au hasard et inclure au moins un échantillon témoin par jour pour l’analyse des COV. De plus, utilisez une norme interne, comme décrit à l’étape 2.5., pour minimiser l’impact de la dérive d’intensité.
  4. Préparer une solution de chlorure de sodium à 20 % (p/v) dans de l’eau de qualité chromatographie liquide à haute performance (CLHP) (ci-après dénommée solution de NaCl). Dissoudre le NaCl à l’aide d’un agitateur magnétique; s’assurer de la disponibilité de 1 mL de la solution par échantillon.
  5. Préparer une solution de 1 ppm dans du méthanol de qualité CLHP de N-pentadécane (D32, 98 %) de la norme commerciale pure (ci-après, appelée l’étalon interne).
    REMARQUE: N-pentadécane-d32 sera utilisé comme étalon interne, et 5 μL par échantillon seront nécessaires. Le méthanol doit être manipulé sous une hotte aspirante.
  6. Préparer des solutions de 1 ppm dans du méthanol de qualité CLHP conforme aux normes commerciales pures pour l’identification des COV (voir le tableau 1 pour la liste des normes commerciales utilisées dans cette étude).
  7. Préparez des flacons d’espace de tête à bouchon à vis de 10 mL en ajoutant 0,5 g de NaCl dans chaque flacon nécessaire. Assurez-vous que les bouchons à vis comprennent un septum composé d’un matériau souple, c’est-à-dire du silicone, avec un mince film de polytétrafluoroéthylène sur la face interne, pour éviter toute contamination.

3. Préparation de l’échantillon

  1. Ajouter 1 mL de solution de NaCl dans le tube de 5 mL contenant l’échantillon congelé pesé. Agiter le tube jusqu’à ce que l’échantillon soit complètement décongelé et homogénéisé.
  2. Centrifuger à 5000 × g pendant 5 min à température ambiante.
  3. Transférer le surnageant avec une pointe de pipette de 1000 μL dans le flacon d’espace de tête contenant du NaCl. Coupez l’extrémité de la pointe pour faciliter ce processus.
  4. Ajouter 5 μL d’étalon interne à chaque flacon d’espace de tête contenant un échantillon.

4. Acquisition de données HS-SPME/GC-MS

  1. Placez le flacon d’espace de tête fermé dans un échantillonneur automatique GC-MS à température ambiante, pour une exécution automatisée HS-SPME/GC-MS, décrite à la section 4. Ne placez pas de répliques biologiques dans des positions successives dans l’échantillonneur automatique; au lieu de cela, répartissez-les au hasard pour minimiser l’impact de la dérive d’intensité.
    REMARQUE: Environ 10 à 12 flacons peuvent être placés à la fois dans l’échantillonneur automatique, sans affecter la stabilité de l’échantillon.
  2. Préincuber les flacons d’espace de tête 10 min à 50 °C avec agitation à 17 x g.
  3. Insérez un dispositif SPME dans le flacon pour exposer la fibre à l’espace de tête pour l’extraction des COV pendant 30 min à 50 °C avec agitation à 17 x g.
  4. Introduire la fibre dans l’orifice d’injection pendant 1 min à 250 °C en mode splitless pour une désorption volatile.
  5. Nettoyez la fibre dans une station de nettoyage SPME avec de l’azote (1 bar N2, ≥ pur à 99,8 %) pendant 5 min à 250 °C. Réutilisez la fibre environ 100x.
  6. Analyser les COV avec un chromatographe en phase gazeuse couplé à un spectromètre de masse à piège à ions (voir le tableau des matériaux), et effectuer la chromatographie sous un flux constant d’hélium (He ≥ pureté de 99,9999%) de 1 mL / min, avec une colonne de dimensions de 60 m x 0,25 mm x 1 μm d’épaisseur. Utilisez un programme de température du four isotherme à 40 °C pendant 3 min, suivi d’une rampe de 8 °C/min à 250 °C et en maintenant à 250 °C pendant 5 min. Pour la spectrométrie de masse, réglez la température de la ligne de transfert et de la source d’ions à 260 °C et 230 °C, respectivement. Réglez l’énergie d’ionisation sur 70 eV et la plage de masse enregistrée sur m/z 35-220 à 6 balayages par s.
  7. Extraire et analyser des solutions de 1 ppm de normes commerciales comme décrit ci-dessus. En outre, exécuter un mélange contenant tous les étalons commerciaux dilués mélangés à une solution de NaCl de 300 μL et à 900 μL d’eau de qualité CLHP avant l’acquisition des données de l’échantillon pour vérifier l’étalonnage correct de l’équipement. De plus, inclure un échantillon vierge contenant une solution de NaCl seule dans chaque lot.

5. Analyse des chromatogrammes de profil GC-MS : identification et semi-quantification des COV

  1. Ouvrez les fichiers de profil GC-MS bruts avec le logiciel fourni par le fabricant. Pour identifier les composés, comparez leurs temps de rétention et leurs spectres de masse et les indices de rétention linéaires de Kovats déterminés à partir des chromatogrammes des échantillons avec les indices de rétention obtenus à partir d’étalons authentiques. Pour chaque norme commerciale, annotez le temps de rétention et les ions m/z les plus abondants. Sélectionnez ensuite un ion m/z spécifique pour chaque COV (tableau 1).
  2. Intégrez automatiquement les pics de COV en fonction des temps de rétention standard et des ions m/z choisis des fichiers bruts GC-MS sélectionnés. Pour cela, fournissez une liste pour chaque COV avec le temps de rétention et l’ion m/z sélectionné. Bien que le logiciel intègre automatiquement la zone de crête correspondant au même temps de rétention et à l’ion m/z que ceux fournis dans la configuration de la séquence, vérifiez l’intégration correcte de chaque pic et corrigez-la manuellement si nécessaire.
  3. Calculer la zone de crête de chaque COV par rapport à celle de l’étalon interne afin de minimiser la variation instrumentale et la dérive d’intensité.
    REMARQUE: Lors de l’analyse de fruits de différents génotypes ou conditions de croissance et de stockage, il est fortement recommandé de déterminer la teneur en COV par rapport à la teneur en poids sec du fruit afin d’exclure les effets de dilution dus aux différences de teneur en eau.
  4. Pour la correction de l’effet de lot, normalisez la zone de crête de COV de chaque échantillon à la zone de crête correspondante dans l’échantillon de contrôle analysé au cours de la même série.
    NOTE: Une quantification relative des COV est obtenue; toutefois, aux fins de l’expérience, la teneur en COV peut ensuite être déterminée par rapport à n’importe quel échantillon (p. ex., fruits non traités pour comparer l’effet de l’entreposage sur les concentrations de COV).

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Résultats

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Le profilage des COV à haut débit dans un grand nombre de cultures fruitières cultivées dans des conditions ou des emplacements différents ou appartenant à des génotypes distincts est nécessaire pour un phénotypage précis des arômes. Ici, une plate-forme HS-SPME/GC-MS rapide et semi-automatisée pour la quantification relative des COV dans les cultivars de cassis est présentée. La détection et l’identification des COV étaient fondées sur une bibliothèque qui a été élaborée pour établir le profil des espèces de fruits à

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Discussion

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La sélection pour l’arôme des fruits a longtemps été entravée par la génétique et la biochimie complexes qui sous-tendent la synthèse de composés volatils et le manque de technologies pour un phénotypage approprié. Cependant, les progrès récents des plateformes métabolomiques, combinés à des outils génomiques, permettent enfin d’identifier les métabolites responsables des préférences des consommateurs et de produire des cultures avec une saveur améliorée3. Bien que la plupart des progrès aient été...

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Déclarations de divulgation

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Les auteurs ne déclarent aucun conflit d’intérêts.

Remerciements

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Les auteurs remercient les Servicios Centrales de Apoyo a la Investigación de l’Université de Malaga pour les mesures HS-SPME/GC-MS. Nous remercions Sara Fernández-Palacios Campos pour son aide dans la quantification des volatiles. Nous remercions également les membres du consortium GoodBerry d’avoir fourni le matériel fruitier.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Flacons à vis de 10 mLThermo Scientific10-HSV
Bouchon à vis 18 mm Silicone/PTFEThermo Scientific18-MSC
Tube de 5 mL avec bouchon à vis en PEHDVWR216-0153
CentrifugeuseThermo Scientific75002415
Méthanol pour HPLCMerck34860-1L-R
N-pentadécane (D32, 98 %)Cambridge Isotope LaboratoriesDLM-1283-1
Chlorure de sodiumMerckS9888
Fibre SPME PDMS/DVBMerck57345-U
Bocaux de broyage en acier inoxydable pour TissueLyserQiagen69985
TissueLyser IIQiagen85300Peut être remplacé par un mortier et un pilon ou un broyeur cryogénique
Chromatographe en phase gazeuse Trace GC-ITQ900 Spectromètre de masse à piège ioniqueThermo Scientific
Triplus RSH échantillonneur automatique avec dispositif SPME automatiséThermo Scientific1R77010-0450
Eau pour HPLCMerck270733-1L
Xcalibur 4.2 SP1Logiciel Thermo Scientific

Références

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Mots-clés

Volatile Organic CompoundsBlackcurrant FruitHeadspace Solid Phase MicroextractionGas Chromatography Mass SpectrometryFruit Aroma ProfilingVOC QuantificationMetabolomic PlatformsAroma BiomarkersPrincipal Component AnalysisTerpenoid Compounds

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