Préparation d’homogénats de muscles squelettiques de rat pour les mesures de nitrates et de nitrites

Résumé

Nous présentons des protocoles pour trois méthodes différentes d’homogénéisation de quatre groupes musculaires différents de tissu musculaire squelettique de rat afin de mesurer et de comparer les niveaux de nitrate et de nitrite. De plus, nous comparons différents poids d’échantillon pour déterminer si la taille de l’échantillon de tissu affecte les résultats de l’homogénéisation.

Résumé

On pensait autrefois que les ions nitrate (NO₃^-) étaient des produits finaux inertes du métabolisme de l’oxyde nitrique (NO). Cependant, des études antérieures ont démontré que les ions nitrate peuvent être reconvertis en NO chez les mammifères par un mécanisme de réduction en deux étapes: le nitrate étant réduit en nitrite (NO₂^-) principalement par des bactéries commensales orales, puis le nitrite étant réduit en NO par plusieurs mécanismes, y compris via des protéines contenant de l’hème ou du molybdène. Cette voie réductrice du nitrate contribue à améliorer les voies de signalisation médiées par le NO, en particulier dans le système cardiovasculaire et pendant l’exercice musculaire. Les niveaux de nitrate dans l’organisme avant cette utilisation sont déterminés par deux sources différentes: l’oxydation endogène du NO et l’apport alimentaire en nitrates, principalement à partir de plantes. Pour élucider le cycle complexe du NO dans des circonstances physiologiques, nous avons examiné plus en détail la dynamique de ses métabolites, les ions nitrate et nitrite, qui sont relativement stables par rapport au NO. Dans des études antérieures, le muscle squelettique a été identifié comme un organe de stockage majeur pour les ions nitrate chez les mammifères, ainsi qu’une source directe de NO pendant l’exercice. Par conséquent, l’établissement d’une méthodologie fiable pour mesurer les niveaux de nitrate et de nitrite dans le muscle squelettique est important et devrait être utile pour étendre son application à d’autres échantillons de tissus. Cet article explique en détail la préparation d’échantillons de muscles squelettiques, à l’aide de trois méthodes d’homogénéisation différentes, pour les mesures de nitrate et de nitrite et aborde des questions importantes liées aux processus d’homogénéisation, y compris la taille des échantillons. Les concentrations de nitrate et de nitrite ont également été comparées dans quatre groupes musculaires différents.

Introduction

L’oxyde nitrique (NO), une petite molécule de signalisation gazeuse, joue un rôle essentiel dans les processus physiologiques et physiopathologiques¹. Le NO peut être produit à partir de la L-arginine par des enzymes endogènes de la famille des oxydes nitriques synthases (NOS) avant de subir une oxydation rapide en nitrate (NO 3-) et, éventuellement, en nitrite (NO 2^-) dans le sang et les tissus ^2,3. Récemment, il a été démontré que ces anions sont réduits à NO dans les systèmes de mammifères⁴. Le nitrate est converti e....

Protocole

Le protocole animal a été approuvé par le Comité de soin et d’utilisation des animaux du NIDDK (ASP K049-MMB-20). Les animaux ont été manipulés et traités conformément au Guide de soin et d’utilisation des animaux de laboratoire disponible gratuitement sur le site Web de l’AAALAC.

1. Collection de muscles squelettiques de rat

1. Pendant qu’un rat est sous anesthésie profonde (isoflurane à 5%, confirmée par l’absence de réaction au pincement de la queue / de la jambe), commencez la perfusion avec une solution saline contenant de l’héparine en plaçant une aiguille de 19 G dans un apex du ventricule gauche et en faisant une entaille sur....

Résultats

Pour obtenir des résultats représentatifs, des tissus musculaires squelettiques de 8 rats Wistar (mâles et femelles, poids 250 ± 50 g) ont été utilisés. Les homogénats de muscles squelettiques de rat (50 mg de muscle grand fessier pour chaque méthode) ont été préparés par trois outils d’homogénéisation différents (homogénéisateur rotatif, homogénéisateur de billes et pulvérisateur). Les teneurs en nitrates et nitrites de ces homogénats ont ensuite été déterminées à l’aide d’un analyseur d’oxyde nitrique (NOA) (

Discussion

Pour surveiller l’évolution des métabolites du NO, nitrate et nitrite, en fonction des interventions physiologiques, il est impératif de mesurer les niveaux de ces ions dans les différents organes critiques dans leur métabolisme. Comme l’hémoglobine dans le sang réagit avec le NO et ses métabolites, il est également important de prélever le sang rapidement des échantillons de tissus autant que possible. Ainsi, les animaux ont été perfusés avec une solution saline avant de recueillir les tissus musculaires squelettiques (.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
dissociateur gentleMACS	Miltenyi Biotec	130-093-235
tube doux MACS M	Miltenyi Biotec	130-093-236	Longueur : 87 mm ; Diamètre : 30 mm
Héparine sodique	Hospira	NDC-0409-7620-13
Isoflurane	Baxter	NDC-10019-360-60
Méthanol	Sigma	646377
Homogénéisateur de billes Minilys	Bertin Instruments	P000673-MLYS0-A
NEM ; N-éthylmaléimide	Sigma	4260
Analyseur d’oxyde nitrique	GE	Sievers NOA 280i
NP-40 ; 4-Nonylphénylpolyéthylène glycol	Sigma	74385
Ferricyanure de potassium ; K3Fe(CN)6	Sigma	702587
Precellys kit de lysage	Bertin Instruments	P000911-LYSK0-A	contient des tubes de 2 mL avec des billes de céramique (oxyde de zirconium) de 2,8 mm pour l’homogénéisation
Kit de pulvérisation	Cellcrusher	Kit Cellcrusher