Article de méthode

Analyse quantitative basée sur la microscopie confocale à balayage laser de la distribution des conidies d’Aspergillus fumigatus dans le poumon de souris optiquement nettoyé à montage entier

DOI :

10.3791/62436

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18 septembre 2021

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1Research Center for Molecular Mechanisms of Aging and Age-Related Diseases, Moscow Institute of Physics and Technology, 2Department of Immunology, Shemyakin and Ovchinnikov Institute of Bioorganic Chemistry, Russian Academy of Sciences, 3Institute of Biological Information Processing (IBI-7: Structural Biochemistry), Forschungszentrum Jülich

Dans cet article

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nous décrivons la méthode d’analyse quantitative de la distribution des conidies d’Aspergillus fumigatus (taille de 3 μm) dans les voies respiratoires de souris. La méthode peut également être utilisée pour l’analyse de la distribution des microparticules et des agglomérats de nanoparticules dans les voies respiratoires dans divers modèles d’état pathologique.

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aspergillus fumigatus conidia sont des agents pathogènes en suspension dans l’air qui peuvent pénétrer dans les voies respiratoires humaines. Les personnes immunocompétentes sans allergies présentent une résistance et une tolérance immunologique, tandis que chez les patients immunodéprimés, les conidies peuvent coloniser les voies respiratoires et provoquer de graves troubles respiratoires invasifs. Diverses cellules dans différents compartiments des voies respiratoires sont impliquées dans la réponse immunitaire qui empêche l’invasion fongique; cependant, les aspects spatio-temporels de l’élimination des agents pathogènes ne sont pas encore complètement compris. L’imagerie tridimensionnelle (3D) d’organes de montage entier optiquement nettoyés, en particulier les poumons de souris expérimentales, permet de détecter des agents pathogènes marqués par fluorescence dans les voies respiratoires à différents moments après l’infection. Dans la présente étude, nous décrivons une configuration expérimentale pour effectuer une analyse quantitative de la distribution des conidies d’A. fumigatus dans les voies respiratoires. En utilisant la microscopie à balayage laser confocale fluorescente (CLSM), nous avons tracé l’emplacement des conidies étiquetées par fluorescence dans les branches bronchiques et le compartiment alvéolaire 6 heures après l’application oropharyngée sur des souris. L’approche décrite ici était précédemment utilisée pour la détection de l’emplacement précis de l’agent pathogène et l’identification des cellules interagissant avec l’agent pathogène à différentes phases de la réponse immunitaire. La configuration expérimentale peut être utilisée pour estimer la cinétique de l’élimination de l’agent pathogène dans différentes conditions pathologiques.

Introduction

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Sur une base quotidienne, les gens inhalent des agents pathogènes en suspension dans l’air, y compris des spores de champignons opportunistes Aspergillus fumigatus (A. fumigatus conidia) qui peuvent pénétrer dans les voies respiratoires1. Les voies respiratoires des mammifères sont un système de voies respiratoires de différentes générations qui se caractérisent par les différentes structures des parois des voiesrespiratoires2,3,4. Les parois trachéobronchiques sont constituées de plusieurs types de cellules parmi lesquelles des cellules ciliées qui fournissent la clairance mucociliaire5. Dans les alvéoles, il n’y a pas de cellules ciliées et les agents pathogènes pénétrants de l’espace alvéolaire ne peuvent pas être éliminés par la clairance mucociliaire6. De plus, chaque génération de voies respiratoires est une niche pour de multiples populations de cellules immunitaires et des sous-ensembles de ces populations sont uniques pour certains compartiments des voies respiratoires. Ainsi, les macrophages alvéolaires résident dans les compartiments alvéolaires, tandis que la trachée et les voies respiratoires conductrices sont tapissées de cellules dendritiques intraépithéliales7,8.

La taille approximative des conidies d’A. fumigatus est de 2 à 3,5 μm9. Étant donné que le diamètre des petites voies respiratoires chez l’homme et même chez la souris dépasse 3,5 μm, il a été suggéré que les conidies peuvent pénétrer dans l’espace alvéolaire2,10,11. En fait, l’examen histologique a montré la croissance fongique dans les alvéoles des patients souffrant d’aspergillose12. Des conidies ont également été détectées dans les alvéoles de souris infectées à l’aide d’une imagerie vivante des tranches pulmonaires épaisses13. Simultanément, des conidies ont été détectées dans le côté luminal de l’épithélium bronchique de souris14.

L’imagerie tridimensionnelle (3D) des poumons de souris à monture entière optiquement dégagés permet une analyse morphométrique des voies respiratoires15. En particulier, l’analyse quantitative de la distribution du nerf pleural viscéral a été réalisée à l’aide d’échantillons pulmonaires de souris optiquement éliminés15. Récemment, Amich et al.16 ont étudié la croissance fongique après application intranasale de conidies sur des souris immunodéprimées à l’aide d’une microscopie à fluorescence à feuille de lumière d’échantillons pulmonaires de souris optiquement nettoyés. L’emplacement précis des conidies de repos dans les voies respiratoires à différents moments après l’infection est important pour identifier les populations cellulaires qui peuvent fournir une défense antifongique suffisante dans certaines phases de l’inflammation. Cependant, en raison de sa taille relativement petite, les aspects spatio-temporels de la distribution des conidies d’A. fumigatus dans les voies respiratoires sont mal caractérisés.

Nous présentons ici une configuration expérimentale pour l’analyse quantitative de la distribution des conidies d’A. fumigatus dans les voies respiratoires de souris infectées. En utilisant la microscopie confocale à balayage laser fluorescent (CLSM) des poumons optiquement nettoyés de souris qui ont reçu une application oropharyngée des conidies A. fumigatus étiquetées fluorescentes, nous obtenons des images 3D et effectuons le traitement d’image. En utilisant l’imagerie 3D du lobe pulmonaire à monture entière, nous avons précédemment montré la distribution des conidies d’A. fumigatus dans les voies respiratoires conductrices de souris 72 heures après l’application de conidies8.

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Protocole

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Toutes les méthodes concernant les animaux de laboratoire décrites ici ont été approuvées par le Comité institutionnel de soins et d’utilisation des animaux (IACUC) de l’Institut de chimie bioorganique Shemyakin et Ovchinnikov de l’Académie des sciences de Russie (numéro de protocole 226/2017).

1. Application de A. fumigatus conidia

  1. Pour obtenir des conidies A. fumigatus étiquetées par fluorescence, fixez 5 × 10à 8 conidies en ajoutant 1 mL de paraformaldéhyde à 3 % à la pastille de conidie. Incuber dans un tube à essai de 50 mL pendant 2 h sur un agitateur à température ambiante.
  2. Laver les conidies avec 20 mL de solution saline tampon phosphate (PBS) : centrifuger à 1 000 x g pendant 15 min, retirer doucement le surnageant et ajouter le PBS frais dans un volume de 20 mL. Répéter.
  3. Dissoudre les conidies dans 900 μL de 0,1 MNaHCO3.
  4. Dissoudre l’ester de succinimidyle du colorant fluorescent de 594 nm dans 100 μL de sulfoxyde de diméthyle et ajouter aux conidies.
  5. Incuber les conidies avec le colorant pendant 1 h sur un agitateur à 150 tr/min à température ambiante.
  6. Laver les conidies deux fois avec 20 mL de PBS dans la centrifugeuse à 1 000 x g pendant 15 min.
  7. Diluer les conidies à une concentration de 1 × 108 conidies/mL dans du PBS et conserver à 4 °C.
  8. Anesthésiez la souris avec 0,5-3% de vapeur d’isoflurane. Placez la souris sur le support, fixez la langue avec une pince lisse et tenez les narines. Prenez une pipette à canal unique et appliquez 50 μL de suspension de conidies sur le pharynx de la souris. Attendez que la suspension soit inhalée.

2. Préparation de l’échantillon

  1. Préparer le tube à essai de 50 mL et le remplir de 15 mL de paraformaldéhyde frais à 2 %. Placer les instruments médicaux (pinces à dissection dentées de 15 cm, pinces à pointe fine de 8 cm et ciseaux de 10 cm aux extrémités émoussées) dans une solution d’éthanol à 70%.
  2. Euthanasier la souris conformément au protocole IACUC. Ensuite, placez la souris en position dorsale et fixez les pattes de la souris avec des aiguilles.
    REMARQUE: Si vous utilisez la luxation cervicale pour l’euthanasie, assurez-vous de l’intégrité de la trachée.
    1. Traitez la souris avec de l’éthanol à 70% à l’aide d’un pulvérisateur.
    2. Faites une coupe longitudinale médiane dans la peau ventrale des pattes postérieures aux pattes antérieures et au menton.
    3. Séparez la peau du tissu sous-cutané à l’aide de pinces dentées et de ciseaux fermés. Fixez les extrémités supérieures de la peau avec des aiguilles.
    4. Faites une incision dans la paroi abdominale et séparez le foie du diaphragme. Choisissez soigneusement le diaphragme avec des ciseaux fermés, puis coupez le diaphragme.
    5. Faites une coupe médiale des tissus conjonctifs du thorax et du cou jusqu’à ce que la trachée soit visible.
  3. Passez un fil de soie sous la trachée et faites un nœud chirurgical à l’aide de deux pinces.
    REMARQUE: Alternativement, utilisez de la soie dentaire au lieu de fil de soie.
    1. Tirez soigneusement le fil et coupez les poumons du tissu conjonctif avec des ciseaux. Tenez les ciseaux perpendiculairement à la table.
    2. Mettez les poumons dans le tube à essai de 50 mL avec 2% de paraformaldéhyde. Laissez les extrémités du fil à l’extérieur du tube, placez le couvercle hermétiquement et retournez le tube pour couvrir les poumons de paraformaldéhyde. Maintenez les poumons pendant la nuit à 4 °C.
  4. Disséquez les lobes pulmonaires du cœur et les uns des autres avec un scalpel.
    1. Placez les lobes pulmonaires dans une plaque de 24 puits, chaque lobe présentant un puits séparé. Laver les lobes pulmonaires dans 1 mL de solution saline tamponnée Tris (TBS) pH 7,4, 5 fois pendant 1 h chacun sur un agitateur à 150 tr/min.
    2. Remplacer 1 mL de TBS par 1 mL de tampon bloquant (1 % de Triton X 100, 5 % de lait en poudre dans tbS) et laisser l’échantillon toute la nuit à température ambiante sur un agitateur.
    3. Remplacer le tampon bloquant par 1 mL de conjugué streptavidine-488 nm fluorchrome dilué 1:30 dans tbS. Laisser l’échantillon pendant au moins 72 h à température ambiante sur un agitateur (150 tr/min).
  5. Laver l’échantillon 5 fois pendant 1 h chacun dans 1 mL de TBS à température ambiante sur un agitateur (150 tr/min). Transférer l’échantillon dans les nouveaux puits et le recouvrir de 2 % de paraformaldéhyde pendant la nuit à 4 °C pour la post-fixation.

3. Clairance optique du lobe pulmonaire de la souris

  1. Placer l’échantillon dans la bouteille en verre de 5 mL remplie de 3 mL de solution méthanol-eau à 50 % et le mettre sur le mélangeur d’échantillons à température ambiante pendant 1 h.
  2. Remplacez 3 mL de méthanol à 50 % par 3 mL de méthanol à 100 % et mettez-les sur le mélangeur d’échantillons pendant 2 h. Préparer un mélange 1:2 v/v d’alcool benzylique et de benzoate de benzyle (BABB) dans un volume total de 1 mL.
  3. Transférer l’échantillon dans une plaque de 24 puits et recouvrir de 1 mL de mélange BABB pendant au moins 30 min. Ne laissez pas le spécimen dans BABB pendant une longue période; BABB peut endommager la plaque en plastique et rendre l’échantillon trop rigide.
  4. Placez l’échantillon dans la chambre à fond de verre de couverture d’imagerie cellulaire. L’échantillon est prêt pour l’imagerie.

4. Imagerie du lobe pulmonaire de souris avec CLSM

  1. Allumez le système de microscope. Ouvrez le logiciel du microscope. Allumez le voyant de transmission dans l’onglet Localiser. Sélectionnez l’objectif 10x.
    REMARQUE: Pour une analyse plus détaillée, utilisez l’objectif 20x, mais il augmente la durée de l’expérience et la taille du fichier image.
  2. Placez la chambre avec l’échantillon dans le porte-glissière du couvercle. Placez le support sur la scène XY au-dessus de l’objectif. Centrez l’échantillon à l’aide des commandes XY de la scène au-dessus de l’objectif. Utilisez le voyant de transmission et l’oculaire pour trouver manuellement le plan Z de l’échantillon.
  3. Basculez le logiciel vers l’onglet Acquisition. Sélectionnez CLSM λ-mode. Allumez les lasers 488 nm et 561 nm. Sélectionnez le miroir dichroïque 488/561 nm. Modifiez la plage spectrale du détecteur à 490-695 nm. Réglez la puissance du laser à la plage appropriée (10-50 μW). Réglez le gain du détecteur entre 750 et 900.
    REMARQUE: Des paramètres de gain plus élevés ne sont pas souhaitables en raison du bruit.
  4. Réduisez le sténopé à 1 unité aérée en cliquant sur le bouton 1 UA. Définissez la résolution des pixels sur 512 × 512 pixels.
  5. Activez le mode Z-stack. Démarrez Live Imaging. Sélectionnez le plan focal dans lequel les deux colorants sont visibles.
    REMARQUE: Si nécessaire, ajustez la puissance du laser pour normaliser la luminosité des deux colorants fluorescents. Utilisez le mode Galerie et Le mode Monocanal pour éviter l’écrêtage et pour faire correspondre précisément l’intensité de fluorescence.
  6. Développez le volet Z-stack qui apparaît. Utilisez la molette de mise au point et recherchez le plan le plus bas de l’échantillon. Utilisez le bouton Premier dans le volet Z-stack. Déplacez le plan focal vers le haut pour trouver la limite supérieure de l’échantillon et enregistrez la position à l’aide du bouton Dernier. Vérifiez la représentation de la profondeur de l’échantillon dans le volet Z-stack.
    Remarque : Une représentation de la profondeur de l’échantillon apparaîtra dans le volet Z-stack une fois que les positions Première et Dernière positions auront été choisies.
  7. Positionnez l’objectif à l’aide de la molette de mise au point près du bas de l’échantillon, en regardant le volet Z-stack. Il s’agit d’environ 20 μm du fond de l’échantillon.
  8. Désactivez le mode Z-stack et activez le mode Tile Scan. Acquérir l’image avec un nombre approprié de tuiles pour la taille de l’échantillon. 5 × 5 tuiles sont un bon point de départ.
  9. Ajustez le nombre de tuiles et la position XY de l’échantillon jusqu’à ce que tout le poumon rentre à l’intérieur de l’image carrelée. Revérifiez l’exactitude des positions Z-stack avec la position XY nouvellement obtenue du centre de l’échantillon.
  10. Activez les modes Z-stack et Tile Scan. Définissez l’étape Z (dans le volet Z-stack) sur 5 μm. Réglez la vitesse de numérisation sur 6. Activez la fonction d’enregistrement automatique. Activez l’option Enregistrement des vignettes séparées. Nommez le fichier. Appuyez sur le bouton Démarrer l’expérience.
  11. Vérifier que l’expérience ne dépasse pas le temps alloué au microscope; si c’est le cas , ajustez la vitesse.
    REMARQUE: La taille approximative du fichier est supérieure à 10 Go; assurez-vous qu’il y a suffisamment d’espace sur le disque dur.

5. Démélange spectral et couture

  1. Utilisez le logiciel pour le traitement initial de l’image. Pour le démélange spectral, sélectionnez l’option Démixage. Sélectionnez deux régions correspondant à la streptavidine/voies respiratoires et aux conidies pour acquérir les spectres de l’image. Cliquez sur Démarrer le démixage.
    REMARQUE: Vous pouvez également utiliser les spectres existants pour les fluorochromes de 488 et 594 nm.
  2. Ouvrez le fichier pour le traitement de l’image et sélectionnez l’onglet Traitement. Dans la section Méthodes, sélectionnez Géométrique et couture. Dans la section Paramètre, sélectionnez La nouvelle sortie et cochez l’option Fusionner les vignettes. Utilisez le mode de référence avec le canal sélectionné correspondant à la fluorescence des voies respiratoires. Appliquez l’assemblage en cliquant sur Appliquer.

6. Traitement d’image: rendu de surface

  1. Ouvrez l’image en tant que vue 3D surpassée. Créez une surface des voies respiratoires à l’aide de l’option Surface pour le canal utilisé pour la visualisation des voies respiratoires. Choisissez le paramètre de lissage de 10 μm.
    REMARQUE: Choisissez également la valeur de seuil automatique.
  2. Inspectez visuellement la surface. Choisissez les seuils pour réduire le signal extérieur. Enlevez les surfaces de la plèvre et des vaisseaux.
  3. Créez un masque pour la surface des voies respiratoires à l’aide des options Modifier et Masquer tout. Sélectionnez le canal des voies respiratoires et réglez Voxels à l’extérieur de la surface sur 0,001.
  4. Enregistrez le fichier avec le masque des voies respiratoires en tant que série TIFF dans le dossier. Enregistrez le fichier avec le canal conidia en tant que série TIFF dans le dossier séparé.

7. Traitement de l’image: correction du masque

  1. Ouvrez le fichier avec le masque des voies respiratoires dans une plate-forme open source pour l’analyse d’imagesbiologiques 17 en tant qu’image 8 bits. Rendez l’image binaire en cliquant sur Processus | | binaire Rendre binaire.
    REMARQUE: Si nécessaire, corrigez le masque: supprimez les surfaces excessives à l’aide de la sélection de polygones et de l’onglet Supprimer. Vous pouvez également utiliser l’outil de remplissage d’inondation.
  2. Dessinez les surfaces manquantes en utilisant plusieurs fois Dilate (3D): cliquez sur Plugins | | de processus Dilater (3D). Remplissez les trous en cliquant sur Processus | | binaire Remplir les trous. Utilisez la sélection et l’interpolation du gestionnaire de retour sur investissement pour remplir manuellement les trous résiduels dans le masque. Appliquer plusieurs options Erode (3D) (Plugins | | de processus Éroder (3D)pour rééchantillonnage de l’épaisseur du masque.
    REMARQUE: Créer des macros à l’aide de plugins | Options de macros pour plusieurs répétitions Dilate (3D) et Erode (3D).
    Assurez-vous que le nombre d’Érodes (3D) est égal au nombre d’applications dilatées (3D).
  3. Enregistrez le masque dans un nouveau dossier en tant que série TIFF.

8. Analyse quantitative des conidies

  1. Ouvrez l’application dans la plate-forme de programmation et de calcul numérique : https://www.mathworks.com/matlabcentral/fileexchange/84525-conidia_counter.
  2. Appuyez sur le bouton Ajouter des fichiers. Sélectionnez le dossier du masque des voies respiratoires et le dossier des conidies.
  3. Définissez un seuil personnalisé compris entre 0 et 1. Appuyez sur le bouton OK.
  4. Enregistrez la table de sortie dans le fichier .xls personnalisé.
  5. Analysez les données avec un logiciel d’analyse statistique.

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Résultats

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Suivant le protocole ci-dessus, l’image 3D montrant les voies respiratoires et les conidies d’A. fumigatus dans le lobe pulmonaire d’une souris a été obtenue (Figure 1A). Streptavidine (qui a été utilisé pour la visualisation des voies respiratoires) marqué bronches et bronchioles15. De plus, les gros vaisseaux, qui se distinguent facilement des voies respiratoires par leur morphologie, et la plèvre sont visualisés dans le canal des voies...

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Discussion

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L’imagerie 3D d’organes entiers permet d’obtenir les données sans dissection de l’échantillon, ce qui est d’une grande importance pour étudier les aspects spatiaux de la distribution anatomique de l’agent pathogène dans l’organisme. Il existe plusieurs techniques et modifications du nettoyage optique tissulaire qui aident à surmonter la diffusion de la lumière laser et permettent l’imagerie d’organes entiers15,16,18,<...

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Déclarations de divulgation

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Les auteurs ne signalent aucun conflit d’intérêts dans ce travail.

Remerciements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les auteurs remercient le professeur Sven Krappmann (hôpital universitaire d’Erlangen et FUA Erlangen-Nürnberg, Allemagne) d’avoir fourni la souche AfS150 de conidies Aspergillus fumigatus. Les auteurs remercient le service de presse du MIPT. V.B. remercie le Ministère des sciences et de l’enseignement supérieur de la Fédération de Russie (#075-00337-20-03, projet FSMG-2020-0003). Les travaux concernant l’imagerie et la quantification des conidies d’A. fumigatus ont été soutenus par RSF n° 19-75-00082. Les travaux concernant l’imagerie des voies respiratoires ont été soutenus par le RFBR No 20-04-60311.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Alexa Fluor 594 NHS EsterThermoFisherA20004
Aspergillus fumigatus conidiesATCC46645La souche AfS150, un dérivé de l’ATCC 46645
Alcool benzyliquePanreac141081.161198.0-100 %
Benzyl benzoateAcrosAC10586-001099+ %
C57Bl/6 sourisPushchino Animal Centre d’élevage (Russie)Mâle. 12 - 30 semaines.
CathéterVenisystemsG715-A0118G
Imagerie cellulaire Chambre à fond de verreEppendorf307420284 ou 8 puits avec fond en verre de protection
CentrifugeuseEppendorf5804RToute centrifugeuse fournie 1000 g peut être utilisée
Microscope confocal à balayage laserZEISSZEISS LSM780
Sulfoxyde de diméthyleSigma-Aldrich276855&ge ; 99.9 %
FIJI LogicielFIJIForcep
B. Braun AesculapBD557RPince dentée
B. Braun AesculapBD321RPince à pointe fine
Bochem1727
Bouteille en verreDURAN242101304Avec couvercle rodé
Éditeur graphique PhotoshopAdobe IncAdobe Photoshop CS
GraphPad SoftwareGraphPad GraphPadPrism 8
Imaris Logiciel d’imagerieOxford Instrumentsversion d’essai gratuite est disponible https://imaris.oxinst.com/microscopy-imaging-software-free-trial
IsofluraneKarizoo
NaHCO3Panreac141638
ObjectifZEISS420640-9800-000  ; Plan-Apochromate, 10 & fois ; (NA = 0,3)
ParaformaldéhydeSigma-Aldrich158127
PBSPanecoP060&Pi ;
PipetteProLine7220205 à 50 &mu ; L
Lait en poudreRothT145.2
Mélangeur d’échantillonsDynalMXIC1
CiseauxB. BraunBC257RBlunt
ShakerApexlabGS-2050-300 tr/min
SkalpelBochem12646
Fil de soieB. Braun3 USP
Streptavidin, Alexa Fluor 488 conjuguéThermoFisherS11223
Tube à essaiSPL Lifesciences5005050 mL
Tris (hydroxyméthyl aminométhane)HélicinH-1702-0.5  ; M. 121.14 ; Numéro CAS : 77-86-1
Triton X-100AmrescoAm-O694-0.1
Logiciel de microscope ZENZEISSZEN2012 SP5https://www.zeiss.com/microscopy/int/products/microscope-software/zen.html
libre lisse Une

Références

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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Mots-clés

Confocal Laser MicroscopyOptical ClearingMouse Lung ImagingAirway DistributionThree Dimensional ImagingSpectral UnmixingAirway MaskingImmune Response

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