Analyse quantitative basée sur la microscopie confocale à balayage laser de la distribution des conidies d’Aspergillus fumigatus dans le poumon de souris optiquement nettoyé à montage entier

Summary

Nous décrivons la méthode d’analyse quantitative de la distribution des conidies d’Aspergillus fumigatus (taille de 3 μm) dans les voies respiratoires de souris. La méthode peut également être utilisée pour l’analyse de la distribution des microparticules et des agglomérats de nanoparticules dans les voies respiratoires dans divers modèles d’état pathologique.

Abstract

Aspergillus fumigatus conidia sont des agents pathogènes en suspension dans l’air qui peuvent pénétrer dans les voies respiratoires humaines. Les personnes immunocompétentes sans allergies présentent une résistance et une tolérance immunologique, tandis que chez les patients immunodéprimés, les conidies peuvent coloniser les voies respiratoires et provoquer de graves troubles respiratoires invasifs. Diverses cellules dans différents compartiments des voies respiratoires sont impliquées dans la réponse immunitaire qui empêche l’invasion fongique; cependant, les aspects spatio-temporels de l’élimination des agents pathogènes ne sont pas encore complètement compris. L’imagerie tridimensionnelle (3D) d’organes de montage entier optiquement nettoyés, en particulier les poumons de souris expérimentales, permet de détecter des agents pathogènes marqués par fluorescence dans les voies respiratoires à différents moments après l’infection. Dans la présente étude, nous décrivons une configuration expérimentale pour effectuer une analyse quantitative de la distribution des conidies d’A. fumigatus dans les voies respiratoires. En utilisant la microscopie à balayage laser confocale fluorescente (CLSM), nous avons tracé l’emplacement des conidies étiquetées par fluorescence dans les branches bronchiques et le compartiment alvéolaire 6 heures après l’application oropharyngée sur des souris. L’approche décrite ici était précédemment utilisée pour la détection de l’emplacement précis de l’agent pathogène et l’identification des cellules interagissant avec l’agent pathogène à différentes phases de la réponse immunitaire. La configuration expérimentale peut être utilisée pour estimer la cinétique de l’élimination de l’agent pathogène dans différentes conditions pathologiques.

Introduction

Sur une base quotidienne, les gens inhalent des agents pathogènes en suspension dans l’air, y compris des spores de champignons opportunistes Aspergillus fumigatus (A. fumigatus conidia) qui peuvent pénétrer dans les voies respiratoires¹. Les voies respiratoires des mammifères sont un système de voies respiratoires de différentes générations qui se caractérisent par les différentes structures des parois des voies^{respiratoires2},^3,4. Les parois trachéobronchiques sont constituées de plusieurs types de cellules parmi lesquelles des cellu....

Protocol

Toutes les méthodes concernant les animaux de laboratoire décrites ici ont été approuvées par le Comité institutionnel de soins et d’utilisation des animaux (IACUC) de l’Institut de chimie bioorganique Shemyakin et Ovchinnikov de l’Académie des sciences de Russie (numéro de protocole 226/2017).

1. Application de A. fumigatus conidia

1. Pour obtenir des conidies A. fumigatus étiquetées par fluorescence, fixez 5 × 10^{à 8} conidies en ajoutant 1 mL de paraformaldéhyde à 3 % à la pastille de conidie. Incuber dans un tube à essai de 50 mL pendant 2 h sur un agitateur à température ambiante.
2. Laver les c....

Results

Suivant le protocole ci-dessus, l’image 3D montrant les voies respiratoires et les conidies d’A. fumigatus dans le lobe pulmonaire d’une souris a été obtenue (Figure 1A). Streptavidine (qui a été utilisé pour la visualisation des voies respiratoires) marqué bronches et bronchioles¹⁵. De plus, les gros vaisseaux, qui se distinguent facilement des voies respiratoires par leur morphologie, et la plèvre sont visualisés dans le canal des voies.......

Discussion

L’imagerie 3D d’organes entiers permet d’obtenir les données sans dissection de l’échantillon, ce qui est d’une grande importance pour étudier les aspects spatiaux de la distribution anatomique de l’agent pathogène dans l’organisme. Il existe plusieurs techniques et modifications du nettoyage optique tissulaire qui aident à surmonter la diffusion de la lumière laser et permettent l’imagerie d’organes entiers^15,16,18,<.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Alexa Fluor 594 NHS Ester	ThermoFisher	A20004
Aspergillus fumigatus conidies	ATCC	46645	La souche AfS150, un dérivé de l’ATCC 46645
Alcool benzylique	Panreac	141081.1611	98.0-100 %
Benzyl benzoate	Acros	AC10586-0010	99+ %
C57Bl/6 souris	Pushchino Animal Centre d’élevage (Russie)		Mâle. 12 - 30 semaines.
Cathéter	Venisystems	G715-A01	18G
Imagerie cellulaire Chambre à fond de verre	Eppendorf	30742028	4 ou 8 puits avec fond en verre de protection
Centrifugeuse	Eppendorf	5804R	Toute centrifugeuse fournie 1000 g peut être utilisée
Microscope confocal à balayage laser	ZEISS	ZEISS LSM780
Sulfoxyde de diméthyle	Sigma-Aldrich	276855	&ge ; 99.9 %
FIJI Logiciel	FIJI		Forcep
	B. Braun Aesculap	BD557R	Pince dentée
	B. Braun Aesculap	BD321R	Pince à pointe fine
	Bochem	1727
Bouteille en verre	DURAN	242101304	Avec couvercle rodé
Éditeur graphique Photoshop	Adobe Inc		Adobe Photoshop CS
GraphPad Software	GraphPad GraphPad		Prism 8
Imaris Logiciel d’imagerie	Oxford Instruments		version d’essai gratuite est disponible https://imaris.oxinst.com/microscopy-imaging-software-free-trial
Isoflurane	Karizoo
NaHCO3	Panreac	141638
Objectif	ZEISS	420640-9800-000	; Plan-Apochromate, 10 & fois ; (NA = 0,3)
Paraformaldéhyde	Sigma-Aldrich	158127
PBS	Paneco	P060&Pi ;
Pipette	ProLine	722020	5 à 50 &mu ; L
Lait en poudre	Roth	T145.2
Mélangeur d’échantillons	Dynal	MXIC1
Ciseaux	B. Braun	BC257R	Blunt
Shaker	Apexlab	GS-20	50-300 tr/min
Skalpel	Bochem	12646
Fil de soie	B. Braun		3 USP
Streptavidin, Alexa Fluor 488 conjugué	ThermoFisher	S11223
Tube à essai	SPL Lifesciences	50050	50 mL
Tris (hydroxyméthyl aminométhane)	Hélicin	H-1702-0.5	; M. 121.14 ; Numéro CAS : 77-86-1
Triton X-100	Amresco	Am-O694-0.1
Logiciel de microscope ZEN	ZEISS	ZEN2012 SP5	https://www.zeiss.com/microscopy/int/products/microscope-software/zen.html