Isolement de cellules valvulaires primaires humaines pour la modélisation in vitro de maladies

Résumé

Ce protocole décrit la collecte de valves aortiques humaines extraites au cours de procédures chirurgicales de remplacement de valve aortique ou de tissu cadavérique, ainsi que l’isolement, l’expansion et la caractérisation ultérieurs de cellules endothéliales et interstitielles valvulaires primaires spécifiques au patient. Sont inclus des détails importants concernant les processus nécessaires pour assurer la viabilité cellulaire et la spécificité du phénotype.

Résumé

La valvulopathie aortique calcifiée (CAVD) est présente chez près d’un tiers de la population âgée. L’épaississement, le raidissement et la calcification de la valve aortique provoquent une sténose aortique et contribuent à l’insuffisance cardiaque et aux accidents vasculaires cérébraux. La pathogenèse de la maladie est multifactorielle et les stress tels que l’inflammation, le remodelage de la matrice extracellulaire, l’écoulement turbulent et le stress et la tension mécaniques contribuent à la différenciation ostéogénique des cellules endothéliales valvulaires et interstitielles valvulaires. Cependant, les facteurs initiateurs précis qui conduisent la transition ostéogénique d’une cellule saine dans une cellule calcifiante ne sont pas entièrement définis. De plus, le seul traitement actuel pour la sténose aortique induite par la CAVD est le remplacement valvulaire aortique, par lequel la valve native est retirée (remplacement chirurgical de la valve aortique, SAVR) ou une valve de remplacement entièrement repliable est insérée via un cathéter (remplacement transcathéter de la valve aortique, TAVR). Ces interventions chirurgicales ont un coût élevé et comportent des risques graves; Il est donc impératif d’identifier de nouvelles cibles thérapeutiques pour la découverte de médicaments. À cette fin, la présente étude développe un flux de travail où les tissus prélevés chirurgicalement sur les patients et les tissus de cadavres de donneurs sont utilisés pour créer des lignées primaires de cellules valvulaires spécifiques au patient pour la modélisation in vitro de la maladie. Ce protocole introduit l’utilisation d’une solution de stockage frigorifique, couramment utilisée dans la transplantation d’organes, pour réduire les dommages causés par le temps d’approvisionnement souvent long entre l’excision tissulaire et le traitement en laboratoire avec l’avantage de stabiliser considérablement les cellules du tissu excisé. Les résultats de la présente étude démontrent que les cellules valvulaires isolées conservent leur capacité proliférative et leurs phénotypes endothéliaux et interstitiels en culture jusqu’à plusieurs jours après le retrait de la valve du donneur. L’utilisation de ces matériaux permet la collecte de cellules témoins et de cellules CAVD, à partir desquelles les lignées cellulaires de contrôle et de maladie sont établies.

Introduction

La valvulopathie aortique calcifiée (CAVD) est une pathologie chronique caractérisée par une inflammation, une fibrose et une macrocalcification des feuillets valviques aortiques. Le remodelage progressif et la calcification des feuillets (appelé sclérose aortique) peuvent entraîner une obstruction du flux sanguin (sténose aortique) qui contribue à un accident vasculaire cérébral et conduit à une insuffisance cardiaque. Actuellement, le seul traitement de la CAVD est le remplacement chirurgical ou transcathéter de la valve aortique (SAVR et TAVR, respectivement). Il n’y a pas d’option non chirurgicale pour arrêter ou inverser la progression de la CAVD, et sans remplac....

Protocole

Tous les échantillons de patients sont prélevés auprès de personnes inscrites à des études approuvées par le comité d’examen institutionnel de l’Université de Pittsburgh conformément à la Déclaration d’Helsinki. Les tissus cadavériques obtenus par l’intermédiaire du Center for Organ Recovery and Education (CORE) ont été approuvés par le Comité de surveillance de la recherche et de la formation clinique impliquant des défunts (CORID) de l’Université de Pittsburgh.

1. Homologation et sécurité

1. Obtenir l’approbation du Comité d’examen institutionnel (CISR) ou une note de service exemptée pour toute collecte d’échantillons de patients ....

Résultats

Le protocole ci-dessus décrit les étapes nécessaires à la manipulation des tissus valvulaires humains et à l’isolement et à l’établissement de lignées cellulaires viables à partir de ces tissus. Les feuillets de la valve aortique sont traités pour l’incorporation de paraffine, congelés pour un stockage à long terme pour analyse biochimique ou génétique et digérés pour l’isolement des CVÉ et des CIV (Figure 1). Alors que les échantillons chirurgicaux auront probablement un diagnostic clinique.......

Discussion

L’obtention de tissus témoins et de tissus pathogènes chez l’homme est essentielle pour la modélisation in vitro et ex vivo des maladies; Cependant, alors que l’on parle souvent des défis de combler l’écart entre le banc et le chevet du patient, l’ordre inverse - passer du bloc opératoire au banc - est souvent tout aussi décourageant. Il est essentiel pour un scientifique fondamental d’obtenir des échantillons primaires de tissus humains en collaboration avec un chirurgien scientifique investi qui dispose d’une équipe d’.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
0,45 &mu ; m filter	Thermo Scientific	7211345	Plaque de préparation avec revêtement en collagène
Plaque de culture cellulaire de 10 cm	Greiner Bio-One	664160	Culture cellulaire/expansion de lignées cellulaires
10 mL pipette sérologique	Fisher	14955234	Isolement VEC/VIC, culture cellulaire, expansion de lignées cellulaires
1000 &mu ; Embouts filtrants en L	VWR	76322-154	Culture cellulaire/expansion de lignées cellulaires
10XL embouts	filtrants VWR	76322-132	Culture cellulaire/expansion de lignées
cellulaires 15 mL tubes coniques	Thermo Scientific	339650	Stockage de tissus, isolement VIC/VEC
16 % de solution aqueuse de paraformaldéhyde	Microscopie électronique Sciences	15710S	Fixateur de tissus et de cellules
190 proof éthanol	Decon	2801	Désinfection
1x DPBS : pas de calcium, pas de magnésium	Gibco	14190250	solution saline. Isolation VIC/VEC
1x PBS	Fisher	BP2944100	Solution saline. Préparation tissulaire, isolement VIC/VEC
20 &mu ; Embouts filtrants L	VWR	76322-134	Culture cellulaire/expansion de lignées cellulaires
Éthanol 200 proof	Decon	2701	Déparaffinisation d’échantillons de tissus
2-propanol	Fisher	A416P 4	Fabrication de plaques recouvertes de collagène
Pipette sérologique	Fisher	14955233	Isolement VEC/VIC, culture cellulaire, expansion de lignées cellulaires
50 mL Tubes coniques	Thermo Scientific	339652	Stockage de tissus, isolation VIC/VEC
Antenne de 60 mm	GenClone	25-260	Isolation VEC
Plaque de culture cellulaire à 6 puits	Corning	3516	Culture cellulaire/expansion de lignées cellulaires
Acide acétique, glaciaire	Fisher	BP2401 500	Fabrication de plaques recouvertes de collagène
AlexaFluor 488 phalloïdine	Invitrogen	A12379	Fluorescent f-actine counterstain
Belzer UW Cold Storage Transplant Solution	Bridge to Life	BUW0011L	Solution de stockage tissulaire
Albumine sérique bovine, fraction V - Sans acides gras 25g	Bioworld	220700233	confirmation VEC avec CD31+ Dynabeads
Calponine 1 anticorps  ;	Abcam	ab46794	Anticorps primaire (coloration VIC positive)
CD31 (PECAM-1) (89C2)	Signalisation cellulaire	3528	Anticorps primaire (coloration VEC positive)
CD31+ Dynabeads	Invitrogen	11155D	Confirmation VEC avec CD31+ Dynabeads CDH5
Signalisation cellulaire	2500	Anticorps primaire (coloration VEC positive)
Passoire cellulaire avec 0,70 &mu ; m pores	Corning	431751	Isolation VIC
Collagène 1, protéine de queue de rat	Gibco	A1048301	Fabrication de plaques recouvertes de collagène
Collagénase II	Worthington Biochemical Corporation	LS004176	Digestion tissulaire. Préparation des tissus, isolement VIC/VEC
Conflikt Spray désinfectant prêt à l’emploi	Decon	4101
Désinfection Countess II Compteur de cellules automatisé	Invitrogen	A27977	Compteur de cellules automatisé
Countess II lamelles de lames réutilisables	Invitrogen	2026h	Compteur de cellules automatisé requis couvercle de lames
	Fisher	125485E	Montage d’échantillons de soupape
Flacons cryogéniques	Olympus Plastics	24-202	Congélation d’échantillons de cellules/tissus
Désinfection de l’eau de Javel avec CLOROMAX - Formule concentrée  ;	Clorox	N/A	Désinfection
DMEM	Gibco	10569044	Milieu de croissance. Expansion VIC
EBM - Milieu de cellules endothéliales, milieu basal, sans rouge de phénol 500	Lonza Walkersville	CC3129	Milieu de croissance. Expansion VEC
EGM-2 Endothélial Cell Medium-2 - 1 kit SingleQuot Kit	Lonza Walkersville	CC4176	Supplément de milieu de croissance. Expansion VEC
EVOS FL Microscope	Life Technologies	Numéro de modèle : AME3300	Imagerie fluorescente
EVOS XL Microscope	Life Technologies	AMEX1000	Visualisation des cellules pendant l’expansion de la lignée cellulaire
	D Systems	S11550	VIC
expansion Ciseaux fins	Fine Science Tools	14088-10	Préparation des tissus, isolement VIC/VEC
Fisherbrand Cell Scrapers	Fisher	08-100-241	Expansion VIC
Fungizone	Gibco	15290-026	Antifongique : Préparation des tissus, isolement VIC/VEC
Gentamicin	Gibco	15710-064	Antibiotique : Préparation des tissus, isolation VIC/VEC
Lames de verre	Globe Scientific Inc	1358L	Montage d’échantillons de soupape
Chèvre anti-souris 488	Invitrogen	A11001	Anticorps secondaire fluorescent
de chèvre anti-souris 594	Invitrogen	A11005	Anticorps secondaire fluorescent
de chèvre anti-lapin 488	Invitrogen	A11008	Fluorescent Anticorps secondaire
Chèvre anti-Lapin 594	Invitrogen	A11012	Anticorps secondaire fluorescent
Invitrogen Countess II FL Lame réutilisable	Invitrogen	A25750	Compteur de cellules automatisé requis Lame
Invitrogen NucBlue Fixed Cell ReadyProbes Reagent (DAPI)	Invitrogen	R37606	Contre-coloration fluorescente
du noyau LM-HyCryo-STEM - 2X Milieu de cryoconservation pour cellules souches	HyClone Laboratories, Inc.	SR30002	Stockage de cellules congelées
Support de montage Fisher	Chemical Permount	SP15-100	Montage d’échantillons de soupape
Conteneur de congélation Mr. Frosty	Nalgene	51000001	Conteneur pour congélation contrôlée d’échantillons
Mycoplasma-ExS Spray	PromoCell	PK-CC91-5051	Désinfection
Pénicilline-Streptomycine	Gibco	15140163	Antibiotique. Expansion VIC
Plasmocin	Invivogen	ANTMPT	Anti-mycoplasme. Isolement et expansion VIC/VEC
Anticorps SM22a	Abcam	ab14106	Anticorps primaire (coloration positive VIC)
Ciseaux à motif standard	Outils de science fine	14001-14	Préparation des tissus, isolement VIC/VEC
Coton-tige stérile	Puritan	25806 10WC	Isolement VEC
Swingsette cassette de tissu humain	Simport Scientific	M515-2	Récipient d’enrobage de tissus
Taylor Forceps (17cm)	Fine Science Tools	11016-17	Préparation des tissus, isolement VIC/VEC
Solution Trypan Blue, 0,4	Gibco	15250061	solution de comptage cellulaire
TrypLE Express	Enzyme Gibco	12604021	Splitting VIC/VECs
Kit Von Kossa	Polysciences	246331	Coloration des coupes de paraffine des tissus pour la calcification
Anticorps contre le facteur de von Willebrand	Abcam	ab68545	Anticorps primaire (coloration VEC positive)
Xylènes	Fisher Chemical	X3S-4	Échantillons de tissus déparaffinisants
&alpha ;Anticorps SMA	Abcam	ab7817	Anticorps primaire (coloration VIC positive)

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