Considérations relatives à la collecte, au traitement et au stockage pour la recherche sur les biomarqueurs urinaires

Summary

Ce protocole vise à fournir des considérations pour la collecte, le traitement et le stockage des échantillons d’urine pour les études de biomarqueurs d’infection du tractus urinaire.

Abstract

Il existe plusieurs protéines urinaires qui semblent prometteuses en tant que nouveaux marqueurs des infections des voies urinaires. L’identification d’un nouveau biomarqueur qui a une plus grande précision prédictive par rapport aux méthodes de diagnostic actuelles a le potentiel d’améliorer considérablement la capacité de prise en charge des patients atteints d’infections des voies urinaires. Cependant, la collecte, le traitement et le stockage des échantillons peuvent tous potentiellement avoir un impact sur les résultats de la recherche sur les biomarqueurs. Il est nécessaire de comprendre les effets de chacune de ces étapes sur les études de biomarqueurs pour éclairer les recherches futures de haute qualité dans ce domaine, ainsi que pour examiner de manière critique d’autres études dans ce domaine. Ici, l’étude passe en revue la littérature concernant les effets de chaque étape du traitement des échantillons d’urine et rapporte les effets de diverses affections sur les protéines urinaires. Le protocole se concentrera sur les techniques de collecte, le temps et la température de stockage, les techniques de traitement, l’utilisation de réactifs et la congélation à long terme sur la stabilité des biomarqueurs. Il se concentrera sur les protéines, mais abordera brièvement d’autres matériaux qui pourraient être utilisés dans la recherche sur les biomarqueurs. Ce faisant, ce protocole fournira un guide aux futurs chercheurs pour les aider à concevoir des études de biomarqueurs urinaires.

Introduction

Les infections des voies urinaires (IVU) sont l’une des infections bactériennes les plus courantes chez les enfants et les adultes¹. Si le diagnostic d’infection urinaire dans certaines populations peut être simple, il peut être plus complexe dans d’autres, comme celles ayant une vessie neuropathique². La capacité de diagnostiquer avec précision les infections urinaires contribuera à améliorer les efforts de gestion des antibiotiques en diminuant l’utilisation d’antibiotiques inutiles et pourrait aider au diagnostic plus précoce des infections urinaires, diminuant ainsi le risque de morbidité. Compte tenu de la prévalence des infections urinaires, il existe un intérêt significatif à améliorer la prise en charge de cette infection courante.

Il existe un nombre croissant de nouveaux biomarqueurs dans la littérature qui sont prometteurs dans leur capacité à diagnostiquer les infections urinaires^{3, 4, 5, 6, 7}. Cependant, plusieurs facteurs associés au traitement des échantillons d’urine peuvent altérer les résultats. Ces facteurs vont des méthodes de collecte, de la température et de la durée de l’entreposage à court et à long terme, des techniques de traitement, de l’utilisation de réactifs et des cycles de gel-dégel⁸. Il est nécessaire de comprendre comment les changements dans chacun de ces éléments peuvent affecter les lectures de biomarqueurs pour interpréter de manière critique la recherche dans la littérature et pour concevoir des études de haute qualité axées sur les biomarqueurs de l’urine.

Ici, une revue narrative de la littérature est fournie sur les effets de chaque facteur, y compris les techniques de collecte, la température et la durée de stockage à court et à long terme, l’utilisation de réactifs et l’effet des cycles de gel-dégel, sur les protéines qui peuvent avoir une utilité comme biomarqueurs de l’urine et fournit des recommandations pour un traitement optimal basé sur cette revue de la littérature. Ce protocole se concentrera sur les biomarqueurs protéiques mesurés à l’aide de Western blots ou ELISA.

Protocol

Ce protocole suit les lignes directrices du comité d’éthique de la recherche sur l’être humain de l’établissement. S’assurer que l’approbation est obtenue du comité d’examen de l’établissement (CEI) avant la collecte et l’utilisation d’échantillons biologiques à des fins de recherche.

1. Collecte

1. Prélever un échantillon d’urine dans un gobelet stérile. Décidez du type d’échantillon d’urine, ainsi que des critères d’inclusion et d’exclusion spécifiques, en fonction de la conception de l’étude. Pour les études d’infection urinaire, utilisez la méthode de capture propre ou le cathétérisme pour éviter la contamination périnéale.
2. Pour obtenir un échantillon d’urine propre, demandez aux participants d’essuyer la région périurétrale avec une lingette, d’en évacuer une petite quantité dans les toilettes, puis d’uriner dans le gobelet de l’échantillon.
3. Demandez aux femmes d’utiliser leurs doigts pour écarter les lèvres et aux hommes de rétracter leur prépuce (le cas échéant) avant d’uriner pour éviter la contamination.
4. Notez l’heure de la collecte.
5. Recueillez les données cliniques pertinentes de chaque participant, comme l’exige la conception de l’étude et la question de recherche.
6. Envisagez d’effectuer une analyse d’urine ou une bandelette réactive sur chaque échantillon avant le traitement et l’entreposage si ces données ne sont pas disponibles de manière fiable à partir du dossier de santé électronique.

2. Traitement et stockage des échantillons

1. Traitez les échantillons immédiatement. Si cela n’est pas possible, conservez l’échantillon à 4 °C pendant 24 h maximum.
2. Si les échantillons ne peuvent pas être conservés à 4 °C ou doivent être conservés à 4 °C pendant plus de 24 h, ajoutez 0,2 M d’acide borique ou 10 mM de NaN₃ aux échantillons. Assurez-vous que ces réactifs sont compatibles avec les applications en aval prévues.
3. Enregistrer la durée des échantillons à 4 °C.
4. Centrifuger les échantillons à 1000-1500 x g pendant 10-20 min. La centrifugation n’a pas besoin d’être à 4 °C.
5. Recueillir le surnageant et l’aliquote dans des tubes de microcentrifugation séparés.
6. Étiquetez les tubes avec plusieurs identificateurs clairs (tels que la date et l’identification de l’échantillon (ID)). Envisagez d’utiliser des codes-barres générés par ordinateur spécialement conçus pour le stockage d’échantillons biologiques à -80 °C. S’il n’est pas disponible, assurez-vous que le stylo utilisé pour étiqueter les échantillons est résistant à l’eau.
7. Étiquetez chaque boîte de congélation de manière à ce que chaque emplacement ait un code spécifique. Pour cela, numérotez chaque colonne avec une lettre différente et chaque ligne avec un numéro. Cela permettra de créer des cartes ou d’autres guides pour localiser facilement les échantillons.
8. Congelez immédiatement les échantillons à -80 °C. Enregistrez l’heure de congélation.
9. Décongeler les échantillons dans un bain-marie à 37 °C le jour de la mesure afin de minimiser l’entreposage inutile à température ambiante ou à 4 °C.
10. Consigner les durées et le nombre de cycles de gel-dégel supplémentaires pour chaque aliquote.

3. Analyse

1. Lorsque vous utilisez des tests ELISA disponibles dans le commerce, suivez les instructions du fabricant.
2. Exécutez les exemples en double.
3. Déterminer la concentration prévue de la protéine d’intérêt pour s’assurer que les concentrations de protéines dans les échantillons se situent dans la plage de la trousse. Si la teneur attendue en protéines dépasse la norme supérieure, diluer les échantillons.
4. Une fois les données obtenues à partir du lecteur de plaques (ELISA) ou du Western Blot, déterminez la concentration de chaque biomarqueur dans l’échantillon manuellement (non recommandé) ou à l’aide d’un logiciel.
5. Analysez les résultats. L’analyse des données dépend de la conception de l’étude.
6. Envisagez d’ajuster les valeurs des biomarqueurs pour tenir compte de la concentration dans l’urine.
   REMARQUE : Traditionnellement, les chercheurs de biomarqueurs ont utilisé la créatinine urinaire comme méthode de normalisation, en particulier chez les participants ayant une fonction rénale normale, pour tenir compte de la concentration dans l’urine. Cependant, d’autres rapportent que la normalisation ne fait pas de différence dans les résultats⁴. Pour surmonter cet obstacle, certains chercheurs rapportent des résultats normalisés et non normalisés.
7. Recommander de rapporter les plages de temps entre la collecte et la congélation, ainsi que la durée à 4 °C avant le traitement dans les manuscrits publiés pour permettre l’interprétation des résultats dans le contexte du traitement des échantillons (figure 1)

4. Effet de diverses conditions de stockage sur la lipocaline associée à la gélatinase des neutrophiles (NGAL).

1. Piquez l’urine fraîche avec 2 ng/mL de NGAL recombinant.
2. Aliquote l’urine et soumettez-la à différentes conditions de traitement et de stockage.
   1. Centrifugez l’urine à 1000-1500 x g pendant 10-20 min. La centrifugation n’a pas besoin d’être à 4 °C. Conserver dans différentes conditions (20 °C, 4 °C, -20 °C) pendant 24 h, 48 h ou 72 h.
   2. Stocker l’aliquote de l’échantillon à -80 °C à des fins de comparaison.
3. Après avoir maintenu les échantillons dans les différentes conditions mentionnées à l’étape 4.2.1, mesurer les concentrations de NGAL dans les échantillons à l’aide d’une trousse ELISA disponible dans le commerce qui comprend les commandes conformément aux instructions du fabricant.

Results

La centrifugation a eu un faible impact sur les niveaux de NGAL. Les échantillons centrifugés conservés à -80 °C présentaient des concentrations de NGAL inférieures à celles des échantillons non centrifugés (2,17 ng/mL ± 0,32 ng/mL, 2,77 ng/mL ± 0,21 ng/mL). Les cycles de gel ont également eu un impact sur les niveaux de NGAL après le troisième cycle de gel-dégel. (Figure 2). Parmi les conditions étudiées (centrifugation, cycles de gel-dégel et température de stockage), la température de sto...

Discussion

L’importance de produire des résultats cohérents et reproductibles ne se limite pas au succès des études individuelles, mais permettra également une meilleure comparaison des résultats au sein de la littérature⁹. La variation entre les études dans les étapes clés de la procédure peut introduire un biais irréversible qui peut affecter les signaux des biomarqueurs et leur interprétation, ce qui peut être responsable de divergences entre plusieurs études

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Acide borique	Sigma-Aldrich	B6768	À prendre en compte pour les échantillons qui ne peuvent pas être traités rapidement et congelés
Boîtes de congélation	Fisher Scientific	03-395-464
Tubes à microcentrifuger	Thomas scientific	1149X93
NGAL ELISA Kit	R& D Systems	DLCN20	Utilisé pour créer des résultats représentatifs
Pipette et pointes	En fonction de la taille de la pipette et du volume de fluide.
Azoture de sodium	Sigma-Aldrich	S2002	À prendre en compte pour les échantillons qui ne peuvent pas être rapidement traités et congelés
Gobelets de collecte d’urine	Thermo Scientific	3122B03ORG	Gobelets stériles non nécessaires sauf si nécessaire pour d’autres études