Article de méthode

Cartographie des R-Loops et des hybrides ARN :ADN avec des méthodes d’immunoprécipitation basées sur S9.6

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DOI :

10.3791/62455

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24 août 2021

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1Department of Molecular and Cellular Biology and Genome Center, University of California

Dans cet article

Résumé

Les R-loops constituent une classe prévalente de structures d’ADN non-B induites par la transcription qui se produisent dans tous les génomes en fonction de la séquence d’ADN et de la préférence topologique. Ces dernières années, les R-loops ont été impliqués dans une variété de rôles adaptatifs et inadaptés et ont été liés à l’instabilité génomique dans le contexte des troubles humains. Par conséquent, la cartographie précise de ces structures dans les génomes est d’un grand intérêt pour de nombreux chercheurs. Le DRIP-seq (DNA :RNA Immunoprecipitation followed by high throughput sequencing) est décrit ici. Il s’agit d’une technique robuste et reproductible qui permet une cartographie précise et semi-quantitative des R-loops. Une itération récente de la méthode est également décrite dans laquelle la fragmentation est réalisée à l’aide de la sonication (sDRIP-seq), ce qui permet une cartographie spécifique au brin et à haute résolution des boucles R. sDRIP-seq résout ainsi certaines des limitations courantes de la méthode DRIP-seq en termes de résolution et de strandedness, ce qui en fait une méthode de choix pour le mappage de boucle R.

Résumé

Les R-loops constituent une classe prévalente de structures d’ADN non-B induites par la transcription qui se produisent dans tous les génomes en fonction de la séquence d’ADN et de la préférence topologique. Ces dernières années, les R-loops ont été impliqués dans une variété de rôles adaptatifs et inadaptés et ont été liés à l’instabilité génomique dans le contexte des troubles humains. Par conséquent, la cartographie précise de ces structures dans les génomes est d’un grand intérêt pour de nombreux chercheurs. Le DRIP-seq (DNA :RNA Immunoprecipitation followed by high throughput sequencing) est décrit ici. Il s’agit d’une technique robuste et reproductible qui permet une cartographie précise et semi-quantitative des R-loops. Une itération récente de la méthode est également décrite dans laquelle la fragmentation est réalisée à l’aide de la sonication (sDRIP-seq), ce qui permet une cartographie spécifique au brin et à haute résolution des boucles R. sDRIP-seq résout ainsi certaines des limitations courantes de la méthode DRIP-seq en termes de résolution et de strandedness, ce qui en fait une méthode de choix pour le mappage de boucle R.

Introduction

Les R-loops sont des structures d’acide nucléique à trois brins qui se forment principalement lors de la transcription lors de l’hybridation de la transcription de l’ARN naissant avec le brin d’ADN matrice. Cela aboutit à la formation d’un hybride ARN :ADN et provoque le déplacement du brin d’ADN non matrice dans un état en boucle simple brin. La reconstitution biochimique 1,2,3,4 et la modélisation mathématique5, en combinaison avec d’autres mesures biophysiques 6,7, ont établi que les R-loops sont plus susceptibles de se produire sur des régions qui présentent des caractéristiques favorables spécifiques. Par exemple, les régions qui présentent une asymétrie de brin dans la distribution des guanines (G) et des cytosines (C) de sorte que l’ARN est riche en G, une propriété appelée asymétrie GC positive, sont favorisées pour former des R-boucles lors de la transcription en raison de la stabilité thermodynamique plus élevée de l’hybride ADN :ARN par rapport à l’ADN duplex8. Les régions qui ont développé une asymétrie GC positive, telles que les premières parties de nombreux gènes eucaryotes 4,9,10,11, sont susceptibles de former des boucles R in vitro et in vivo 3,4,12. Le stress superhélicoïdal négatif de l’ADN favorise également grandement la formation de la structure13,14, car les R-loops absorbent efficacement ces contraintes topologiques et ramènent la fibre d’ADN environnante à un état de relaxation favorable 5,15.

Historiquement, les structures de la boucle R étaient considérées comme résultant d’intrications rares et spontanées de l’ARN avec l’ADN pendant la transcription. Cependant, le développement de l’immunoprécipitation ADN :ARN (DRIP) couplé au séquençage de l’ADN à haut débit (DRIP-seq) a permis la première cartographie à l’échelle du génome des R-loops et a révélé que ces structures sont beaucoup plus répandues que prévu dans les cellules humaines 4,16. Les R-loops se produisent sur des dizaines de milliers de points chauds géniques conservés, transcrits et dans les génomes de mammifères, avec une prédilection pour les îlots CpG asymétriques par GC chevauchant le premier intron des gènes et les régions terminales de nombreux gènes17. Dans l’ensemble, les R-loops occupent collectivement 3 à 5 % du génome dans les cellules humaines, ce qui correspond aux mesures effectuées dans d’autres organismes, notamment les levures, les plantes, les mouches et les souris 18,19,20,21,22.

L’analyse des points chauds formant des boucles R dans les cellules humaines a révélé que ces régions s’associent à des signatures chromatiniennes spécifiques23. Les R-loops, en général, se trouvent dans des régions où l’occupation des nucléosomes est plus faible et la densité d’ARN polymérase plus élevée. Au niveau des promoteurs, les R-loops s’associent à un recrutement accru de deux modifications d’histones déposées co-transcriptionnellement, H3K4me1 et H3K36me317. Au niveau des terminaisons géniques, les R-loops s’associent à des gènes étroitement agencés qui subissent une terminaison de transcription efficace17, conformément aux observations antérieures24. Il a également été démontré que les R-loops participent à l’initiation de la réplication de l’ADN aux origines de réplication des génomes des bactériophages, des plasmides, des mitochondries et des levures 25,26,27,28,29,30,31. De plus, 76 % des promoteurs humains de l’îlot CpG sujets aux boucles R fonctionnent comme des origines de réplication précoces et constitutives 32,33,34,35, renforçant encore les liens entre les boucles R et les origines de réplication. Collectivement, ces études suggèrent que les R-loops représentent un nouveau type de signal biologique qui peut déclencher des sorties biologiques spécifiques d’une manière dépendante du contexte23.

Très tôt, il a été démontré que des R-loops se formaient au niveau des séquences de changement de classe au cours du processus de recombinaison de changement de classe d’immunoglobuline 3,36,37. On pense que de telles boucles R programmées initient la recombinaison de commutation de classe par l’introduction de cassures d’ADN double brin38. Depuis lors, la formation nocive de R-loop, généralement considérée comme résultant d’une formation excessive de R-loop, a été liée à l’instabilité génomique et à des processus tels que l’hyper recombinaison, les collisions transcription-réplication, la réplication et le stress transcriptionnel (pour revue 39,40,41,42,43). Par conséquent, l’amélioration de la cartographie des structures de la boucle R représente un défi passionnant et essentiel pour mieux déchiffrer la distribution et la fonction de ces structures dans la santé et la maladie.

L’immunoprécipitation ADN :ARN (DRIP) repose sur une forte affinité de l’anticorps monoclonal S9.6 pour les hybrides ADN :ARN44. DRIP-seq permet un profilage robuste à l’échelle du génome de la formation de la boucle R 4,45. Bien qu’utile, cette technique souffre d’une résolution limitée en raison du fait que des enzymes de restriction sont utilisées pour obtenir une fragmentation douce de l’ADN. De plus, DRIP-seq ne fournit pas d’informations sur la directionnalité de la formation de la boucle R. Ici, nous rapportons une variante de DRIP-seq qui permet de cartographier des R-loops à haute résolution d’une manière spécifique au brin. Cette méthode repose sur la sonication pour fragmenter le génome avant l’immunoprécipitation et la méthode est donc appelée sDRIP-seq (sonication DNA :RNA immunoprecipitation coupled with high throughput sequencing) (Figure 1). L’utilisation de la sonication permet une résolution accrue et limite les biais de fragmentation enzymatique de restriction observés dans les approches DRIP-seq46. sDRIP-seq produit des cartes R-loop qui sont en fort accord avec les résultats du DRIP-seq et de la méthode DRIPc-seq haute résolution décrite précédemment, dans laquelle des banques de séquençage sont construites à partir des brins d’ARN des structures R-loopimmunoprécipitées 45.

Face à une pléthore de méthodes parmi lesquelles choisir, les utilisateurs peuvent se demander quelle approche basée sur le DRIP est préférable pour leurs besoins. Nous vous proposons les conseils suivants. Le DRIP-seq, malgré ses limites, est techniquement le plus simple et est la plus robuste (rendements les plus élevés) des trois méthodes discutées ici ; Il reste donc largement utile. De nombreux ensembles de données DRIP-seq ont été publiés, ce qui constitue un point de comparaison utile pour de nouveaux ensembles de données. Enfin, le pipeline d’analyse bioinformatique est plus simple car les données ne sont pas bloquées. Il est recommandé aux nouveaux utilisateurs de commencer à perfectionner leurs compétences en cartographie de la boucle R avec le DRIP suivi de la réaction en chaîne par polymérase quantitative (qPCR) et du DRIP-seq. Le sDRIP-seq représente un degré de difficulté technique légèrement plus élevé : les rendements sont légèrement réduits en raison de la sonication (voir ci-dessous) et le processus de bibliothèque de séquençage est légèrement plus complexe. Pourtant, le gain de l’échouage et d’une résolution plus élevée est inestimable. Il est à noter que le sDRIP-seq capturera à la fois des hybrides ARN :ADN à deux brins et des boucles R à trois brins. En raison des étapes de construction de la bibliothèque, DRIP-seq ne capturera pas les hybrides ARN :ADN à deux brins. DRIPc-seq est le plus exigeant techniquement et nécessite une plus grande quantité de matériaux de départ. En retour, il offre la résolution et le toronnage les plus élevés. Étant donné que les banques de séquençage sont construites à partir de la fraction ARN des R-loops ou des hybrides, DRIPc-seq peut souffrir d’une possible contamination de l’ARN, d’autant plus que S9.6 possède une affinité résiduelle pour l’ARNdb 19,47,48. Le sDRIP-seq permet une cartographie haute résolution spécifique aux brins sans se soucier de la contamination par l’ARN, car les banques de séquençage sont dérivées de brins d’ADN. Dans l’ensemble, ces trois méthodes restent utiles et présentent des degrés de complexité différents et des mises en garde légèrement différentes. Cependant, tous les trois produisent des ensembles de données hautement congruents48 et sont très sensibles au prétraitement de la RNase H, qui représente un contrôle essentiel pour garantir la spécificité du signal45,49. Il est à noter qu’étant donné la sélection de taille imposée aux banques de séquençage, les petits hybrides (estimés <75 pb), tels que ceux qui se forment transitoirement autour des sites d’amorçage de réplication de l’ADN des brins retardés (amorces d’Okazaki) seront exclus. De même, étant donné que toutes les méthodes DRIP impliquent une fragmentation de l’ADN, les R-loops instables qui nécessitent un super-enroulement négatif de l’ADN pour leur stabilité seront perdues5. Ainsi, les approches DRIP peuvent sous-estimer les charges de la boucle R, en particulier pour les boucles R courtes et instables qui peuvent être mieux capturées en utilisant des approches in vivo 45,48. Il est à noter que les R-loops peuvent également être profilés de manière indépendante de S9.6 à une couverture profonde, à haute résolution et d’une manière spécifique au brin sur des molécules d’ADN uniques après un traitement au bisulfite de sodium12. De plus, des stratégies utilisant une enzyme RNase H1 catalytiquement inactive ont été employées pour cartographier les R-loops natifs in vivo, mettant en évidence des R-loops courtes et instables qui se forment principalement au niveau des promoteurs en pause 50,51,52.

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Protocole

Le protocole suivant est optimisé pour la lignée cellulaire humaine Ntera-2 cultivée en culture, mais il a été adapté avec succès sans modification à une gamme d’autres lignées cellulaires humaines (HEK293, K562, HeLa, U2OS), de cellules primaires (fibroblastes, cellules B) ainsi que dans d’autres organismes avec de petites modifications (souris, mouches).

1. Récolte et lyse cellulaires

  1. Cultivez des cellules Ntera-2 à une confluence de 75 % à 85 %. Assurez-vous que le nombre optimal de cellules est de 5 à 6 millions de cellules avec un nombre de cellules viables à >90 % pour commencer toute procédure DRIP.
  2. Lavez les cellules une fois avec 1x PBS, ajoutez 1,5 mL de Trypsine-EDTA 1x, puis incubez pendant 2 min à 37 °C jusqu’à ce que les cellules se dissocient de la boîte.
  3. Ajouter 5 ml de milieu chaud et bien pipeter pour remettre les cellules en suspension dans une suspension unicellulaire. Transférez le contenu dans un nouveau tube de 15 ml et granulez doucement les cellules à 300 x g pendant 3 min.
  4. Lavez les cellules une fois avec 5 mL de 1x PBS et granulez doucement les cellules à 300 x g pendant 3 min.
  5. Remettre complètement les cellules en suspension dans 1,6 mL de tampon TE (10 mM Tris-Cl pH 7,5, 1 mM EDTA pH 8,0). Ajouter 5 μL de protéinase K (solution mère à 20 mg/mL) et 50 μL de SDS (solution mère à 20 %) et retourner doucement les tubes cinq fois jusqu’à ce que la solution devienne visqueuse. N’essayez pas de pipeter la solution, mélangez uniquement par inversion.
  6. Incuber les tubes pendant la nuit à 37 °C.

2. Extraction de l’ADN

  1. Versez le lysat d’ADN dans un tube de gel à verrouillage de phase haute densité pré-filé de 15 ml et ajoutez 1 volume (1,6 ml) d’alcool isoamylique phénol/chloroforme (25:24:1). Retournez doucement cinq fois et tournez à 1 500 x g pendant 5 min.
  2. Ajoutez 1/10 volume d’acétate de sodium 3 M (NaOAc) (pH 5,2) et 2,5 volumes d’éthanol à 100 % dans un nouveau tube de 15 ml. Versez la phase aqueuse supérieure du tube de gel à verrouillage de phase et retournez doucement jusqu’à ce que l’ADN soit complètement précipité (jusqu’à 10 min).
  3. Enroulez les fils d’ADN à l’aide d’une pointe de 1 000 μL à large alésage et transférez-les dans un tube propre de 2 mL en prenant soin de ne pas emporter le surnageant résiduel.
  4. Lavez l’ADN en ajoutant 1,5 ml d’éthanol à 80 % et retournez doucement le tube cinq fois. Incuber pendant 10 min.
  5. Répétez l’étape précédente deux fois. Ne pas centrifuger pendant les étapes de lavage. Retirez soigneusement autant d’éthanol que possible en pipetant après le dernier lavage tout en essayant de ne pas perturber l’ADN.
  6. Laissez l’ADN sécher complètement à l’air libre tout en inversant le tube. Cette étape peut prendre 30 min à 1 h selon la quantité d’ADN.
  7. Ajoutez 125 μL de tampon TE directement sur la pastille d’ADN pour fragmenter l’ADN par digestion enzymatique de restriction ou 100 μL de tampon TE pour cisailler l’ADN par sonication. Maintenez sur de la glace pendant 1 h et remettez doucement l’ADN en suspension en le pipetant plusieurs fois avec une pointe de 200 μL à large alésage. Laisser sur la glace pendant 1 h avant de commencer l’étape de fragmentation.

3. Fragmentation de l’ADN

REMARQUE : Pour le DRIP-seq à base d’enzymes de restriction, suivez l’étape 3.1. Pour le DRIP-seq basé sur la sonication, passez à l’étape 3.2.

  1. Fragmentation de l’enzyme de restriction (ER)
    1. Digérer l’ADN génomique remis en suspension (très visqueux) à l’aide d’un cocktail d’ER selon les instructions du fournisseur.
      1. Ajouter 0,1 mM de spermidine à la réaction finale. Utilisez un cocktail de 4 à 5 enzymes avec 30 U de chaque enzyme dans un volume total de 150 μL.
        REMARQUE : Le cocktail initial pour DRIP-seq (HindIII, SspI, EcoRI, BsrGI, XbaI)4 a été développé pour générer une longueur moyenne de fragment de 5 kilobases. Évitez toute interférence avec la méthylation des CpG et épargnez les régions riches en GC du génome. D’autres cocktails sont également possibles16). Ces cocktails conviennent à la fois aux génomes de l’homme et de la souris, mais peuvent être ajustés selon les besoins.
      2. Incuber le mélange réactionnel pendant la nuit à 37 °C.
        REMARQUE : Le mélange d’ADN après la digestion ne doit plus être visqueux. Toute viscosité résiduelle à cette étape est le signe d’une digestion incomplète.
      3. Si vous observez, ajoutez 10 U supplémentaires de chaque enzyme et incubez pendant 2 à 4 h supplémentaires à 37 °C.
        REMARQUE : Les utilisateurs peuvent ne pas digérer la totalité de la pastille s’ils ont récolté plus de cellules que recommandé ici.
    2. Pipetez doucement l’ADN digéré pendant la nuit (150 μL) dans un tube lumineux en gel à verrouillage de phase pré-filé de 2 ml. Ajouter 100 μL d’eau et un volume (250 μL) d’alcool isoamylique phénol/chloroforme (25:24:1). Retournez doucement cinq fois et tournez à 16 000 x g pendant 10 min.
    3. Ajoutez 1,5 μL de glycogène, 1/10 volume de 3 M NaOAc (pH 5,2) et 2,5 volumes d’éthanol à 100 % dans un nouveau tube de 1,5 mL. Pipetez l’ADN du tube de gel à verrouillage de phase et mélangez en inversant cinq fois. Incuber pendant 1 h à -20 °C.
    4. Essorage à 16 000 x g pendant 35 min à 4 °C. Lavez l’ADN avec 200 μL d’éthanol à 80 % et essorez-le à 16 000 x g pendant 10 min à 4 °C.
    5. Faites sécher la pastille à l’air libre et ajoutez 50 μL de tampon TE à la pastille. Laissez le tube sur de la glace pendant 30 minutes et remettez doucement l’ADN en suspension.
    6. Mesurer la concentration (OD260) de l’ADN fragmenté à l’aide d’un spectrophotomètre.
    7. Facultatif mais recommandé : Chargez 1 μg d’ADN digéré sur un gel d’agarose à 0,8 % accompagné d’un marqueur de taille pour vérifier que la digestion est complète. Faites fonctionner le gel pendant une heure à 100 V.
      REMARQUE : S’il est incomplet, une enzyme supplémentaire peut être ajoutée. Une digestion incomplète peut entraîner une perte de résolution après l’immunoprécipitation.
    8. Après cette étape, traitez 10 μg d’ADN digéré avec 4 μL de ribonucléase H (RNase H) pendant 1 à 2 h à 37 °C pour vous assurer que le signal récupéré lors de l’immunoprécipitation provient d’hybrides ADN :ARN. Ensuite, passez à l’immunoprécipitation S9.6 (étape 4).
      REMARQUE : Les ADN digérés peuvent être conservés congelés à -80 °C jusqu’à un mois sans perte de rendement significative.
  2. Sonication
    1. Sonicer la totalité ou une partie de l’ADN extrait dans un tube de microcentrifugation de 0,5 mL d’un volume total de 100 μL. Effectuez 15 à 20 cycles de 30 s ON / 30 s OFF sur un sonicateur (essorage après 5, 10 et 15 cycles pour assurer une sonication homogène).
    2. Mesurer la concentration (OD260) d’ADN soniqué sur un spectrophotomètre.
      REMARQUE : À cette étape, la viscosité de l’ADN devrait avoir disparu.
    3. Exécutez un gel d’agarose pour confirmer la distribution granulométrique de l’ADN soniqué (300-500 pb).
      REMARQUE : Une sursonisation de l’ADN peut entraîner une réduction significative du rendement résultant de la rupture et de la dissociation des structures de la boucle R.
    4. Après cette étape, traitez 10 μg d’ADN soniqué avec 4 μL de RNase H pendant 1 à 2 h à 37 °C pour vous assurer que le signal récupéré lors de l’immunoprécipitation est dérivé d’hybrides ADN :ARN. Ensuite, passez à l’immunoprécipitation S9.6 (étape 4).

4. Immunoprécipitation S9.6

REMARQUE : Les étapes d’immunoprécipitation sont similaires, que l’ADN ait été fragmenté par RE ou par sonication.

  1. Préparez trois tubes et aliquote 4,4 μg d’ADN fragmenté dans un volume final de 500 μL de tampon TE par tube. Conservez 50 μL (1/10 du volume) de chaque tube pour les utiliser plus tard comme ADN d’entrée.
  2. Ajouter 50 μL de tampon de liaison 10x (100 mM NaPO4 pH 7, 1,4 M NaCl, 0,5 % Triton X-100) et 10 μL d’anticorps S9.6 (1 mg/mL) aux 450 μL d’ADN dilué.
  3. Incuber toute la nuit à 4 °C sur un rotateur mini-tube à 7-10 tr/min.
  4. Pour chaque tube, laver 50 μL de boue de billes d’agarose de protéine A/G avec 700 μL de tampon de liaison 1x en inversant les tubes sur un mini-rotateur à 7-10 tr/min à température ambiante pendant 10 min. Faites tourner les perles à 1 100 x g pendant 1 min et jetez le surnageant. Répétez cette étape une fois.
  5. Ajouter l’ADN de l’étape 4.3 aux 50 μL de billes et incuber pendant 2 h à 4 °C tout en inversant à 7-10 tr/min sur un mini-rotateur.
  6. Faites tourner les perles pendant 1 min à 1 100 x g et jetez le surnageant.
  7. Lavez les billes avec 750 μL de 1x tampon de liaison en les inversant à 7-10 tr/min sur un mini-rotateur pendant 15 min. Tournez pendant 1 min à 1 100 x g et jetez le surnageant. Répétez cette étape une fois.
  8. Ajouter 250 μL du tampon d’élution (50 mM Tris-Cl pH 8, 10 mM EDTA pH 8, 0,5 % SDS) et 7 μL de protéinase K (20 mg/mL de stock) dans les billes et incuber en tournant à 55 °C (12 tr/min) pendant 45 min.
  9. Faites tourner les billes pendant 1 min à 1 100 x g. Transférez le surnageant dans un tube de gel à verrouillage de phase pré-filé de 2 mL et ajoutez un volume (250 μL) d’alcool isoamylique phénol/chloroforme (25:24:1). Retournez les tubes cinq fois et faites-les tourner pendant 10 min à 16 000 x g à température ambiante.
  10. Ajoutez 1,5 μL de glycogène, 1/10 volume de NaOAc 3M (pH 5,2) et 2,5 volumes d’éthanol à 100 % dans un nouveau tube de 1,5 mL. Pipetez l’ADN du tube de gel à verrouillage de phase et mélangez en inversant cinq fois. Incuber pendant 1 h à -20 °C.
  11. Essorage à 16 000 x g pendant 35 min à 4 °C. Lavez l’ADN avec 200 μL d’éthanol à 80 % et essorez-le à 16 000 x g pendant 10 min à 4 °C.
  12. Faites sécher les granulés à l’air libre et ajoutez 15 μL de 10 mM de Tris-Cl (pH 8) dans chaque tube. Laissez les tubes sur de la glace pendant 20 min et remettez doucement en suspension. Combinez le contenu des trois tubes en un seul tube (45 μL).
  13. Vérifiez l’efficacité du goutte-à-goutte par qPCR en utilisant 5 μL des 45 μL d’ADN remis en suspension (voir Résultats représentatifs). Diluez les 5 μL dans 10 μL d’eau et utilisez 2 μL par réaction.

5. Étape de pré-bibliothèque pour l’ADN soniqué uniquement

REMARQUE : La sonication conduit le brin d’ADNsb déplacé des boucles R à se rompre. Ainsi, les structures à boucle R à trois brins sont converties en hybrides ADN :ARN à deux brins lors de la sonication. Par conséquent, ces hybrides ADN :ARN doivent être reconvertis en ADN double brin avant la construction de la banque. Ici, une deuxième étape de synthèse de brin est utilisée. Une autre approche qui a été utilisée avec succès consiste à effectuer une ligature d’ADN simple brin suivie d’une synthèse de second brin53.

  1. Aux 40 μL d’ADN goutte à goutte de l’étape 4.12, ajoutez 20 μL de tampon 5x second brin (200 mM Tris pH 7, 22 mM MgCl2, 425 mM KCl), 10 mM de mélange dNTP (dATP, dCTP, dGTP et dTTT ou dUTP si l’utilisateur prévoit réaliser un séquençage DRIP spécifique au brin), 1 μL 16 mM NAD, et 32 μL d’eau. Bien mélanger et incuber 5 min sur glace.
  2. Ajouter 1 μL d’ADN polymérase I (10 unités), 0,3 μL de RNase H (1,6 unités) et 0,5 μL d’ADN ligase d’E. coli . Mélanger et incuber à 16 °C pendant 30 min.
  3. Nettoyez immédiatement la réaction à l’aide de billes paramagnétiques avec un rapport de 1,6x. Éluer l’ADN dans 40 μL de 10 mM de Tris-Cl (pH 8).

6. Étape de sonication préalable à la bibliothèque pour l’ADN RE uniquement

REMARQUE : Le goutte-à-goutte permet de récupérer des fragments d’ER qui ont souvent des kilobases de longueur et ne conviennent donc pas à la construction immédiate d’une bibliothèque.

  1. Pour réduire la taille du matériau pour la construction de la bibliothèque, sonicez l’ADN immunoprécipité dans un tube de microcentrifugation de 0,5 ml. Effectuez 12 cycles de 15 s ON / 60 s OFF sur un sonicateur (essorage après six cycles pour assurer une sonication homogène). Passez à l’étape 7.
    REMARQUE : Le matériau immunoprécipité porte toujours les boucles R à trois brins qui répondent à la sonication différemment de l’ADN double brin flanquant.
  2. Étape facultative : Pour égaliser les profils de goutte à goutte, traitez le matériau immunoprécipité avec 1 μL de RNase H dans 1 tampon RNase H pendant 1 h à 37 °C avant la sonication.

7. Construction de la bibliothèque

  1. Effectuez la réparation d’extrémité en ajoutant aux 40 μL de l’étape 4.12 (fragmentation de l’ER) ou de l’étape 5.3 (cisaillement de sonication) 5 μL de tampon de 10 module de réparation d’extrémité, 2,5 μL d’ATP de 10 mM et 2,5 μL d’enzyme de module de réparation d’extrémité (50 μL au total). Bien mélanger et incuber 30 min à température ambiante. Inclure 1 μg d’ADN d’entrée RE-digéré et soniqué (DRIP) ou soniqué (sDRIP) pour créer des banques de séquençage de contrôle correspondant à l’ADN d’entrée.
  2. Nettoyez la réaction à l’aide de billes paramagnétiques (rapport de 1,6x) et éluez dans 34 μL de 10 mM de Tris-Cl (pH 8).
  3. Effectuez le A-tailing en ajoutant 5 μL de tampon 2, 10 μL de 1 mM de dATP et 1 μL d’exo- de Klenow (50 μL au total). Mélangez bien et laissez incuber le mélange pendant 30 min à 37 °C.
  4. Nettoyez la réaction à l’aide de billes paramagnétiques (rapport de 1,6x) et éluez dans 12 μL de 10 mM de Tris-Cl (pH 8).
  5. Adaptateurs Ligate en ajoutant 15 μL de 2 tampons de ligature rapide, 1 μL d’adaptateurs 15 μM et 2 μL de ligase rapide (30 μL au total). Bien mélanger et incuber 20 min à température ambiante.
  6. Nettoyez la réaction à l’aide de billes paramagnétiques (rapport 1x) et éluez dans 20 μL de 10 mM de Tris-Cl (pH 8).
  7. Si un cisaillement par sonication a été effectué et que le dUTP a été utilisé à l’étape 5.1, ajouter 1,5 μL (1,5 U) de N-glycosylase uracile et incuber pendant 30 minutes à 37 °C pour obtenir un DRIP spécifique au brin.
  8. PCR amplifier 10 μL de la bibliothèque à partir de l’étape 6.6 ou 6.7. Ajouter 1 μL d’amorce PCR 1.0 P5 (voir le tableau des matériaux), 1 μL d’amorce PCR 2.0 P7 (voir le tableau des matériaux), 15 μL de mélange maître et 3 μL d’eau. Bien mélanger.
  9. Dans un thermocycleur, exécutez le programme comme indiqué dans le Tableau 1.
  10. Procédez à un nettoyage en deux étapes de la bibliothèque à l’aide de billes paramagnétiques. Utilisez d’abord un rapport de 0,65x pour éliminer les fragments de plus de 500 pb. Gardez le surnageant. Procéder à un ratio de 1x sur le surnageant pour éliminer les fragments en dessous de 200 pb. Éluer dans 12 μL de 10 mM de Tris-HCl (pH 8).

8. Contrôle de la qualité

  1. Pour vérifier les enrichissements en boucle R par qPCR sur deux loci négatifs et trois loci positifs à l’aide de la méthode Pfaffl, utilisez 1 μL de la bibliothèque de nettoyage de l’étape 6.10. Diluer 1 μL de la bibliothèque dans 10 μL d’eau et utiliser 2 μL par locus.
  2. Vérifiez la distribution de taille de la bibliothèque nettoyée à partir de l’étape 6.10 à l’aide d’un kit d’ADN haute sensibilité.

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Résultats

Le DRIP ainsi que le sDRIP peuvent être analysés par qPCR (Figure 2A) et/ou séquençage (Figure 2B). Après l’étape d’immunoprécipitation, la qualité de l’expérience doit d’abord être confirmée par qPCR sur des loci de contrôle positifs et négatifs, ainsi qu’avec des témoins traités par RNase H. Le tableau 2 fournit des amorces correspondant à des loci fréquemment utilisés dans plusieurs lignées cellulaires humaines. Les résultats de la qPCR doive...

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Discussion

Deux protocoles sont décrits ici pour cartographier les structures de la boucle R dans n’importe quel organisme utilisant l’anticorps S9.6. DRIP-seq représente la première technique de cartographie de la boucle R à l’échelle du génome développée. Il s’agit d’une technique facile, robuste et reproductible qui permet de cartographier la distribution des R-loops le long de n’importe quel génome. La deuxième technique, appelée sDRIP-seq, est également robuste et reproductible, mais permet d’...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs ne déclarent aucun conflit d’intérêts.

Remerciements

Les travaux du laboratoire de Chedin sont soutenus par une subvention des National Institutes of Health (R01 GM120607).

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Tube de 15 mL Gel à verrouillage de phase Maxtract haute densitéQiagen129065
Tube de 2 mL Gel à verrouillage de phase légerVWR10847-800
Perles d’agarose A/GThermoFisher Scientific20421
Perles Agencourt AMPure XPBeckman CoulterA63881
AmpErase Uracil N-glycosylaseThermoFisher ScientificN8080096
Adaptateurs d’indexIllumina Correspondau TrueSeq Index uniques
Fragment de Klenow (3' à 5' exo-)New England BioLabsM0212S
NEBNext Module de réparation d’extrémitéNew England BioLabsE6050
Amorces PCR pour l’amplification de la bibliothèqueapprêt 1.0 P5 (5' AATGATACGGCGACCACCGAGA
TCTACACTCTTTCCCTACACGA 3')
amorces PCR pour l’amplification de la bibliothèque AmorcePCR 2.0 P7 (5' CAAGCAGAAGACGGCATACG
AGAT 3')
Phénol/Chloroforme Alcool isoamylique 25:24:1Affymetrix75831-400ML
Phusion Flash High-Fidelity PCR master mixThermoFisher ScientificF548S
LigationNew England BioLabsM2200S
Ribonuclease HNew England BioLabsM0297S
S9.6 AnticorpsKerafastENH001Ces trois sources équivalentes
S9.6 AnticorpsMillipore/SigmaMABE1095
S9.6 AnticorpsAbcamab234957
Quick Kit

Références

  1. Reaban, M. E., Lebowitz, J., Griffin, J. A. Transcription induces the formation of a stable RNA.DNA hybrid in the immunoglobulin alpha switch region. The Journal of Biological Chemistry. 269 (34), 21850-21857 (1994).
  2. Daniels, G. A., Lieber, M. R. RNA:DNA complex formation upon transcription of immunoglobulin switch regions: implications for the mechanism and regulation of class switch recombination. Nucleic Acids Research. 23 (24), 5006-5011 (1995).
  3. Yu, K., Chedin, F., Hsieh, C. L., Wilson, T. E., Lieber, M. R. R-loops at immunoglobulin class switch regions in the chromosomes of stimulated B cells. Nature Immunology. 4 (5), 442-451 (2003).
  4. Ginno, P. A., Lott, P. L., Christensen, H. C., Korf, I., Chedin, F. R-loop formation is a distinctive characteristic of unmethylated human CpG island promoters. Molecular Cell. 45 (6), 814-825 (2012).
  5. Stolz, R., et al. Interplay between DNA sequence and negative superhelicity drives R-loop structures. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (13), 6260-6269 (2019).
  6. Duquette, M. L., Handa, P., Vincent, J. A., Taylor, A. F., Maizels, N. Intracellular transcription of G-rich DNAs induces formation of G-loops, novel structures containing G4 DNA. Genes & Development. 18 (13), 1618-1629 (2004).
  7. Carrasco-Salas, Y., et al. The extruded non-template strand determines the architecture of R-loops. Nucleic Acids Research. 47 (13), 6783-6795 (2019).
  8. Huppert, J. L. Thermodynamic prediction of RNA-DNA duplex-forming regions in the human genome. Molecular Biosystems. 4 (6), 686-691 (2008).
  9. Hartono, S. R., Korf, I. F., Chedin, F. GC skew is a conserved property of unmethylated CpG island promoters across vertebrates. Nucleic Acids Research. 43 (20), 9729-9741 (2015).
  10. Green, P., Ewing, B., Miller, W., Thomas, P. J., Green, E. D. Transcription-associated mutational asymmetry in mammalian evolution. Nature Genetics. 33 (4), 514-517 (2003).
  11. Polak, P., Arndt, P. F. Transcription induces strand-specific mutations at the 5' end of human genes. Genome Research. 18 (8), 1216-1223 (2008).
  12. Malig, M., Hartono, S. R., Giafaglione, J. M., Sanz, L. A., Chedin, F. Ultra-deep Coverage Single-molecule R-loop Footprinting Reveals Principles of R-loop Formation. Journal of Moleclar Biology. 432 (7), 2271-2288 (2020).
  13. Masse, E., Phoenix, P., Drolet, M. DNA topoisomerases regulate R-loop formation during transcription of the rrnB operon in Escherichia coli. The Journal of Biological Chemistry. 272 (19), 12816-12823 (1997).
  14. Drolet, M., et al. The problem of hypernegative supercoiling and R-loop formation in transcription. Frontiers in Bioscience: A Journal and Virtual Library. 8, 210-221 (2003).
  15. Chedin, F., Benham, C. J. Emerging roles for R-loop structures in the management of topological stress. The Journal of Biological Chemistry. 295 (14), 4684-4695 (2020).
  16. Ginno, P. A., Lim, Y. W., Lott, P. L., Korf, I., Chedin, F. GC skew at the 5' and 3' ends of human genes links R-loop formation to epigenetic regulation and transcription termination. Genome Research. 23 (10), 1590-1600 (2013).
  17. Sanz, L. A., et al. conserved R-Loop structures associate with specific epigenomic signatures in mammals. Molecular Cell. 63 (1), 167-178 (2016).
  18. El Hage, A., Webb, S., Kerr, A., Tollervey, D. Genome-wide distribution of RNA-DNA hybrids identifies RNase H targets in tRNA genes, retrotransposons and mitochondria. PLoS Genetics. 10 (10), 1004716(2014).
  19. Hartono, S. R., et al. The affinity of the S9.6 Antibody for Double-Stranded RNAs impacts the accurate mapping of R-loops in fission yeast. Journal of Molecular Biology. 430 (3), 272-284 (2018).
  20. Wahba, L., Costantino, L., Tan, F. J., Zimmer, A., Koshland, D. S1-DRIP-seq identifies high expression and polyA tracts as major contributors to R-loop formation. Genes & Development. 30 (11), 1327-1338 (2016).
  21. Alecki, C., et al. RNA-DNA strand exchange by the Drosophila Polycomb complex PRC2. Nature Communications. 11 (1), 1781(2020).
  22. Xu, W., et al. The R-loop is a common chromatin feature of the Arabidopsis genome. Nature Plants. 3 (9), 704-714 (2017).
  23. Chedin, F. Nascent connections: R-Loops and chromatin patterning. Trends in Genetics: TIG. 32 (12), 828-838 (2016).
  24. Skourti-Stathaki, K., Proudfoot, N. J., Gromak, N. Human senataxin resolves RNA/DNA hybrids formed at transcriptional pause sites to promote Xrn2-dependent termination. Molecular Cell. 42 (6), 794-805 (2011).
  25. Kreuzer, K. N., Brister, J. R. Initiation of bacteriophage T4 DNA replication and replication fork dynamics: a review in the Virology Journal series on bacteriophage T4 and its relatives. Virology Journal. 7, 358(2010).
  26. Carles-Kinch, K., Kreuzer, K. N. RNA-DNA hybrid formation at a bacteriophage T4 replication origin. Journal of Molecular Biology. 266 (5), 915-926 (1997).
  27. Masukata, H., Tomizawa, J. A mechanism of formation of a persistent hybrid between elongating RNA and template DNA. Cell. 62 (2), 331-338 (1990).
  28. Itoh, T., Tomizawa, J. Formation of an RNA primer for initiation of replication of ColE1 DNA by ribonuclease H. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 77 (5), 2450-2454 (1980).
  29. Stuckey, R., Garcia-Rodriguez, N., Aguilera, A., Wellinger, R. E. Role for RNA:DNA hybrids in origin-independent replication priming in a eukaryotic system. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (18), 5779-5784 (2015).
  30. Lee, D. Y., Clayton, D. A. Initiation of mitochondrial DNA replication by transcription and R-loop processing. The Journal of Biological Chemistry. 273 (46), 30614-30621 (1998).
  31. Xu, B., Clayton, D. A. A persistent RNA-DNA hybrid is formed during transcription at a phylogenetically conserved mitochondrial DNA sequence. Molecular and Cellular Biology. 15 (1), 580-589 (1995).
  32. Cadoret, J. C., et al. Genome-wide studies highlight indirect links between human replication origins and gene regulation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (41), 15837-15842 (2008).
  33. Sequeira-Mendes, J., et al. Transcription initiation activity sets replication origin efficiency in mammalian cells. PLoS Genetics. 5 (4), 1000446(2009).
  34. Picard, F., et al. The spatiotemporal program of DNA replication is associated with specific combinations of chromatin marks in human cells. PLoS Genetics. 10 (5), 1004282(2014).
  35. Mukhopadhyay, R., et al. Allele-specific genome-wide profiling in human primary erythroblasts reveal replication program organization. PLoS Genetics. 10 (5), 1004319(2014).
  36. Huang, F. T., Yu, K., Hsieh, C. L., Lieber, M. R. Downstream boundary of chromosomal R-loops at murine switch regions: implications for the mechanism of class switch recombination. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (13), 5030-5035 (2006).
  37. Huang, F. T., et al. Sequence dependence of chromosomal R-loops at the immunoglobulin heavy-chain Smu class switch region. Molecular and Cellular Biology. 27 (16), 5921-5932 (2007).
  38. Yu, K., Lieber, M. R. Current insights into the mechanism of mammalian immunoglobulin class switch recombination. Critical Reviews in Biochemistry and Molecular Biology. 54 (4), 333-351 (2019).
  39. Crossley, M. P., Bocek, M., Cimprich, K. A. R-Loops as cellular regulators and genomic threats. Molecular Cell. 73 (3), 398-411 (2019).
  40. Santos-Pereira, J. M., Aguilera, A. R loops: new modulators of genome dynamics and function. Nature Reviews. Genetics. 16 (10), 583-597 (2015).
  41. Garcia-Muse, T., Aguilera, A. R Loops: From physiological to pathological roles. Cell. 179 (3), 604-618 (2019).
  42. Skourti-Stathaki, K., Proudfoot, N. J. A double-edged sword: R loops as threats to genome integrity and powerful regulators of gene expression. Genes & Development. 28 (13), 1384-1396 (2014).
  43. Costantino, L., Koshland, D. The Yin and Yang of R-loop biology. Current Opinion in Cell Biology. 34, 39-45 (2015).
  44. Boguslawski, S. J., et al. Characterization of monoclonal antibody to DNA.RNA and its application to immunodetection of hybrids. Journal of Immunological Methods. 89 (1), 123-130 (1986).
  45. Sanz, L. A., Chedin, F. High-resolution, strand-specific R-loop mapping via S9.6-based DNA-RNA immunoprecipitation and high-throughput sequencing. Nature Protocols. 14 (6), 1734-1755 (2019).
  46. Halasz, L., et al. RNA-DNA hybrid (R-loop) immunoprecipitation mapping: an analytical workflow to evaluate inherent biases. Genome Research. 27 (6), 1063-1073 (2017).
  47. Phillips, D. D., et al. The sub-nanomolar binding of DNA-RNA hybrids by the single-chain Fv fragment of antibody S9.6. Journal of Molecular Recognition. 26 (8), 376-381 (2013).
  48. Chedin, F., Hartono, S. R., Sanz, L. A., Vanoosthuyse, V. Best practices for the visualization, mapping, and manipulation of R-loops. The EMBO Journal. 40 (4), 106394(2021).
  49. Smolka, J. A., Sanz, L. A., Hartono, S. R., Chedin, F. Recognition of RNAs by the S9.6 antibody creates pervasive artefacts when imaging RNA:DNA hybrids. Journal of Cell Biology. 220 (6), 202004079(2021).
  50. Chen, J. Y., Zhang, X., Fu, X. D., Chen, L. R-ChIP for genome-wide mapping of R-loops by using catalytically inactive RNASEH1. Nature Protocols. 14 (5), 1661-1685 (2019).
  51. Yan, Q., Sarma, K. MapR: A Method for Identifying native R-loops genome wide. Current Protocols in Molecular Biology. 130 (1), 113(2020).
  52. Wang, K., et al. Genomic profiling of native R loops with a DNA-RNA hybrid recognition sensor. Science Advances. 7 (8), (2021).
  53. Crossley, M. P., Bocek, M. J., Hamperl, S., Swigut, T., Cimprich, K. A. qDRIP: a method to quantitatively assess RNA-DNA hybrid formation genome-wide. Nucleic Acids Research. 48 (14), 84(2020).
  54. Svikovic, S., et al. R-loop formation during S phase is restricted by PrimPol-mediated repriming. The EMBO Journal. 38 (3), 99793(2019).
  55. Yang, X., et al. m(6)A promotes R-loop formation to facilitate transcription termination. Cell Research. 29 (12), 1035-1038 (2019).
  56. Vanoosthuyse, V. Strengths and weaknesses of the current strategies to map and characterize R-Loops. Non-coding RNA. 4 (2), 9(2018).

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