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Co-culture de neurones microgliaux et corticaux différenciés de cellules souches pluripotentes induites par l’homme

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DOI :

10.3791/62480

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21 septembre 2021

 ,  ,  , 
1Center for Genomic Medicine, Massachusetts General Hospital, 2Chemical Biology Program, Broad Institute of MIT & Harvard, 3Department of Psychiatry, Harvard Medical School, 4Schizophrenia and Bipolar Disorder Program, McLean Hospital, 5Program in Neuroscience, Harvard University, 6Program in Chemical Biology, Harvard University, 7Harvard Stem Cell Institute

Dans cet article

Résumé

Ce protocole décrit une méthodologie permettant de différencier les microglies des iPSC humaines et de les maintenir en co-culture avec des neurones corticaux dérivés d’iPSC afin d’étudier les fondements mécanistes des interactions neuro-immunitaires à l’aide de neurones humains et de microglies.

Résumé

La capacité de générer des cellules microgliales à partir de cellules souches pluripotentes induites humaines (CSPi) fournit de nouveaux outils et de nouvelles voies pour étudier le rôle de la microglie dans la santé et la maladie. De plus, la microglie dérivée d’iPSC peut être maintenue en co-culture avec des neurones corticaux dérivés d’iPSC, ce qui permet d’étudier les interactions microglie-neurone dont on suppose qu’elles sont dérégulées dans un certain nombre de troubles neuropsychiatriques. Les iPSC humaines ont été différenciées pour générer des microglies à l’aide d’une version adaptée d’un protocole développé par le groupe Fossati, et les microglies dérivées d’iPSC ont été validées par analyse de marqueurs et PCR en temps réel. Les microglies humaines générées à l’aide de ce protocole étaient positives pour les marqueurs CD11C, IBA1, P2RY12 et TMEM119, et exprimaient les gènes apparentés aux microglies AIF1, CX3CR1, ITGAM, ITGAX, P2RY12 et TMEM119. Des neurones corticaux humains dérivés d’iPSC qui avaient été différenciés pendant 30 jours ont été plaqués avec une microglie et maintenus en co-culture jusqu’au 60e jour, lorsque des expériences ont été entreprises. La densité des épines dendritiques dans les neurones corticaux en co-culture avec la microglie a été quantifiée dans des conditions de référence et en présence de cytokines pro-inflammatoires. Afin d’examiner comment les microglies modulent la fonction neuronale, des expériences d’imagerie calcique des neurones corticaux ont été entreprises à l’aide de l’indicateur calcique Fluo-4 AM. L’activité calcique en direct des neurones corticaux a été obtenue à l’aide d’un microscope confocal, et l’intensité de la fluorescence a été quantifiée à l’aide d’ImageJ. Ce rapport décrit comment la co-culture de microglies et de neurones corticaux dérivés d’iPSC humains fournit de nouvelles approches pour interroger les effets de la microglie sur les neurones corticaux.

Introduction

Dans le cerveau humain, les microglies sont les cellules immunitaires innées primaires1. Le développement du cerveau est régulé par la microglie par deux voies : la libération de facteurs diffusibles et la phagocytose1. Les facteurs diffusibles dérivés de la microglie aident à soutenir la myélinisation, la neurogenèse, la formation synaptique, la maturation, la mort cellulaire et la survie cellulaire1. Les microglies phagocytent également divers éléments dans les synapses cérébrales, les axones et les cellules vivantes et mortes 2,3,4,5,6,7,8. Les récepteurs de la microglie reconnaissent des marqueurs tels que la calréticuline, l’ATP et l’acide sialique et régulent la phagocytose cellulaire 9,10. Dans l’hippocampe, la microglie maintient l’homéostasie de la neurogenèse grâce à son rôle phagocytaire11.

Il a été démontré que la phagocytose synaptique dans le noyau géniculé dorsolatéral (dLGN) du cerveau des rongeurs est régulée par la microglie1. Chez les rongeurs, il a été démontré qu’il y a deux périodes au cours du développement où une phagocytose synaptique microgliale intense est observée. La première période se produit lors de la formation initiale des synapses et la seconde période se produit lorsque les connexions sont affinées et élaguées12. D’autres facteurs impliqués dans l’élagage synaptique sont les protéines inflammatoires et le complexe majeur d’histocompatibilité de classe I (CMH1, H2-Kb et Db)13,14. Il a été suggéré que C1q (composant du complément 1q) sur la microglie colocalise avec le CMH1, ce qui déclenche l’élagage synaptique15. De plus, des études sur des souris montrent que l’interleukine-33 (IL-33) sécrétée par les astrocytes régule l’homéostasie des synapses dans le thalamus et la moelle épinière grâce à ses effets sur la microglie, bien que cela n’ait pas encore été étudié chez l’homme. La microglie sécrète une variété de cytokines qui aident à maintenir la santé neuronale, telles que le facteur de nécrose tumorale α (TNFα), l’IL-1β, l’IL-6, l’IL-10 et l’interféron-γ (IFN-γ) et ces cytokines peuvent moduler la formation de l’épine dendritique et des synapses 16,17,18. Il existe des lacunes importantes dans nos connaissances sur les interactions neurones-microglies au cours du développement du cerveau humain. La plupart de nos connaissances proviennent d’études à partir de modèles de rongeurs, alors qu’il y a un manque d’informations sur les aspects temporels et mécanistes de l’élagage synaptique dans le cortex humain. La microglie soutient la survie neuronale dans le néo-cortex, et d’autres types de cellules y contribuent également1. Il n’est pas clair comment les microglies contribuent à cette préservation et quelle est l’interaction entre la microglie et les autres types de cellules. Les microglies libèrent plusieurs cytokines qui affectent le développement neuronal et synaptique, mais la base mécaniste de leurs effets de ces cytokines dans les neurones est largement inconnue19,20. Afin de développer une compréhension plus complète de la fonction de la microglie dans le cerveau humain, il est essentiel d’explorer ses interactions avec différents types de cellules présentes dans le cerveau humain. Ce rapport décrit une méthode de co-culture de neurones humains dérivés d’iPSC et de microglies générées à partir du même individu. L’établissement de cette méthodologie permettra d’effectuer des investigations bien définies pour interroger la nature des interactions microglie-neuronales et de développer des modèles cellulaires in vitro robustes pour étudier le dysfonctionnement neuro-immunitaire dans le contexte de différents troubles neurodéveloppementaux et neuropsychiatriques.

Le rôle de la microglie dans la schizophrénie
L’élagage synaptique est un processus neurodéveloppemental majeur qui se déroule dans le cerveau de l’adolescent21,22. De multiples sources de données suggèrent que l’élagage synaptique pendant cette période critique est anormal dans la schizophrénie (SCZ)23,24,25,26. La SCZ est un trouble psychiatrique chronique et débilitant caractérisé par des hallucinations, des délires, des processus de pensée désordonnés et des déficits cognitifs23,24. Les microglies, les macrophages résidents dans le cerveau, jouent un rôle central dans l’élagage synaptique25,26. Des études post-mortem et de tomographie par émission de positrons (TEP) montrent des preuves d’une activité microgliale dysfonctionnelle dans les SCZ25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32. Les cerveaux SCZ post-mortem montrent des différences bien reproduites mais subtiles dans le cerveau - les neurones pyramidaux de la couche corticale III montrent une diminution de la densité des épines dendritiques et moins de synapses 33,34,35. L’élagage synaptique est un processus par lequel les connexions synaptiques excitatrices superflues sont éliminées par la microglie pendant l’adolescence, lorsque les patients atteints de SCZ ont généralement leur première crise psychotique22,36. Des études post-mortem montrent une association entre la SCZ et l’activation microgliale, avec une densité accrue de microglie dans le cerveau des SCZ, ainsi qu’une expression accrue des gènes pro-inflammatoires27. De plus, des études TEP de cerveaux humains utilisant des radioligands pour l’activation microgliale montrent une augmentation des niveaux de microglie activée dans le cortex 25,26,27,28. Des études récentes d’association pangénomique (GWAS) montrent que l’association génétique la plus forte pour la SCZ réside dans le locus du complexe majeur d’histocompatibilité (CMH), et cette association résulte des allèles des gènes du composant du complément 4 (C4) qui sont impliqués dans la médiation de l’élagage synaptique postnatal chez les rongeurs37. Cette association a fourni un soutien supplémentaire à l’hypothèse selon laquelle l’élagage aberrant par la microglie peut entraîner la diminution de la densité des épines dendritiques observée dans les cerveaux post-mortem SCZ. Jusqu’à présent, les études sur l’implication microgliale dans l’élagage synaptique dans la SCZ se sont limitées à des études indirectes avec imagerie TEP ou à des inférences tirées d’investigations de cerveaux post-mortem.

Génération de microglie humaine en laboratoire
Les microglies primaires de souris en culture ont été fréquemment utilisées dans l’étude de la microglie, bien qu’il existe plusieurs indications que la microglie de rongeur peut ne pas être représentative de l’anatomie microgliale humaine et de l’expression des gènes (Tableau 1)38. Plusieurs études ont également différencié la microglie directement des monocytes sanguins par transdifférenciation 39,40,41,42. Les cellules microgliales dérivées de monocytes sanguins présentent des différences majeures par rapport à la microglie humaine dans le profil d’expression des gènes et des protéines, les réponses pro-inflammatoires, et elles semblent être plus semblables à celles des macrophages dans leur biologie43. Les progrès méthodologiques récents permettent maintenant de générer des microglies à partir d’iPSC humaines, ce qui offre des possibilités d’étudier des microglies vivantes qui ressemblent plus précisément à la biologie des microglies trouvées dans le cerveau humain (tableau 2). Il a été démontré que ces cellules microgliales dérivées d’iPSC récapitulent le phénotype, les profils d’expression génique et les propriétés fonctionnelles de la microglie humaine primaire 44,45,46,47,48. Cet article propose une méthode de co-culture de neurones humains dérivés d’iPSC et de microglies générées à partir du même individu afin de développer des modèles in vitro personnalisés d’interactions neurones-microglies. Pour ce modèle de co-culture in vitro, un protocole de différenciation microgliale du groupe Fossati a été adapté (Tableau 3) et combiné avec une version adaptée d’un protocole de génération neuronale corticale du groupe Livesey (Tableau 4)49,50.

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Protocole

Les iPSC humaines utilisées dans cette étude ont été reprogrammées à partir de fibroblastes obtenus grâce au consentement éclairé de sujets témoins sains, avec l’approbation du comité d’examen institutionnel (IRB). La reprogrammation et la caractérisation des iPSC utilisées dans cette étude (ML15, ML27, ML40, ML56, ML141, ML 250, ML292) ont été décrites dans une étude antérieure51.

1. Maintenance des iPSC

  1. Préparer une dilution de 1:50 de la matrice de membrane basale à facteur de croissance réduit sans LDEV dans du DMEM/F12 sans rouge de phénol et pré-enduire une plaque à 6 puits avec 1 mL de solution diluée pendant au moins 2 h à 37 °C avant de décongeler les stocks cellulaires.
  2. Décongeler les stocks d’iPSC cryoconservés dans un bain d’eau à 37 °C pendant 2 min. Ajoutez les cellules dans un tube à centrifuger de 15 mL contenant 5 mL de DMEM/F12. Faites tourner les cellules à 300 x g pendant 5 min.
  3. Retirer la solution d’enrobage de la plaque matricielle de la membrane basale à facteur de croissance réduit sans LDEV et ajouter 1 mL de milieu de cellules souches (SCM) avec un inhibiteur de roche de 10 μM (Y-27632).
  4. Remettre en suspension la pastille de cellule dans le SCM avec 10 μM d’Y-27632 et l’ajouter à la plaque pré-enduite pour un volume final de 2 mL de SCM plus Y-27632. Maintenir les cultures de cellules iPSC dans ce milieu pendant 24 h dans un incubateur à 37 °C.
  5. Remplacer le milieu par 2 mL de SCM frais sans Y-27632 24 h après la décongélation.
  6. Une fois que les iPSC ont atteint une confluence de 80 à 90 %, passez-les dans des flacons de 75 mL recouverts d’une matrice de membrane basale à facteur de croissance réduit sans LDEV.
    1. Passage des cellules en rinçant d’abord les cellules avec HBSS et les retirer après les avoir laissées reposer pendant 30 s. Ajouter 1 mL de réactif de dissociation cellulaire non enzymatique et incuber pendant 4 min à 37 °C. Préparez la plaque avec du SCM contenant 10 μM Y-27632.
    2. Aspirer le réactif de dissociation cellulaire non enzymatique et ajouter 1 mL de SCM + 10 μM d’Y-27632 dans chaque puits. Raclez doucement le puits à l’aide d’un lève-cellule et obtenez les cellules à l’aide d’une pipette de 1000 μL.
    3. Déposer les cellules dans une fiole de 75 mm à membrane basale à facteur de croissance réduit sans LDEV revêtue d’une matrice dans un volume total de 8 mL de SCM + Y-27632.

2. Différenciation de la microglie

REMARQUE : La figure 1A illustre un schéma décrivant le protocole de différenciation de la microglie. Le support a été chauffé à température ambiante avant utilisation.

  1. Jour 0 : Effectuer un changement complet de milieu avec le milieu SCM complété par 80 ng/mL de BMP-4. Effectuez des changements quotidiens de milieu avec ce même milieu pendant les jours 1 à 3, sans aucun lavage entre les changements de milieu.
  2. Jour 4 : Préparez le milieu des jours 4 et 5 : Milieu hématopoïétique (HM), complété par 25 ng/mL de FGF, 100 ng/mL de SCF et 80 ng/mL de VEGF. Retirez le milieu et remplacez-le par un milieu Day 4-5 contenant 5 μM Y-27632.
    REMARQUE : Les cellules commencent à flotter à ce stade - environ la moitié des cellules sont flottantes et l’autre moitié sont adhérentes.
  3. Jour 6 : Préparer Milieu des jours 6 à 13 : HM complété par 50 ng/mL de SCF, 50 ng/mL d’IL-3, 5 ng/mL de TPO, 50 ng/mL de m-CSF et 50 ng/mL de Flt3-L. Prélever le surnageant, l’ajouter à un tube conique de 15 mL et l’infiltrer pendant 8 minutes à 300 x g. Remettre la pastille en suspension dans une fiole avec 8 mL de milieu Jour 6-13 complété par 5 μM de Y-27632.
  4. Jour 10 : Ajouter 8 ml de milieu des jours 6 à 13 sur le milieu existant.
  5. Jour 14 : Préparer le jour 14+ moyen : HM complété par 50 ng/mL de m-CSF, 50 ng/mL de Flt3-L, 50 ng/mL DE GM-CSF. Prélever le surnageant, l’ajouter dans un tube conique de 50 mL et l’essorer pendant 8 min à 300 x g. Remettre la pastille en suspension dans 8 mL de milieu Day 14+ contenant 5 μM d’Y-27632 et poursuivre la culture dans ce milieu.
  6. Jour 18 : Ajouter 8 ml de Day14+ medium.
  7. Jour 22 : Ajouter 8 ml de milieu frais Day14+ sans retirer le milieu existant.
  8. Jour 25 : Déplacer les cellules à l’étape 2.9 ou continuer à les maintenir dans le milieu du jour 14+ jusqu’au jour 50 de différenciation.
  9. Après le jour 25, prélever le surnageant dans un tube conique de 50 mL et l’infiltrer pendant 8 minutes à 300 x g.
    1. Préparez le milieu adhérent : RPMI complété par 1 % de 200 mM de L-alanyl-L-glutamine dipeptide dans une solution de NaCl à 0,85 %, 25 ng/mL GM-SCF et 100 ng/mL d’IL-34.
    2. Remettre la pastille en suspension dans le milieu adhérent contenant 5 μM Y-27632.
    3. Cellules sur plaque d’une densité de 50 000 cellules parcm2 sur plaques à 24 puits pour différentes expériences : plaques à membrane basale à membrane basale sans LDEV pour la monoculture microgliale, plaques d’imagerie en poly-L-ornithine de 10 μg/mL et plaques d’imagerie en verre laminé de 10 μg/mL pour les expériences d’imagerie.
    4. Diluez la poly-L-ornithine et la laminine dans du DPBS et ajoutez 250 μL/puits pour une plaque d’imagerie à 24 puits.
      REMARQUE : Les cellules en culture sont maintenant adhérentes dans la nature (Figure 1C).
  10. Maintenir les cellules en culture pendant au moins 14 jours, avec des changements de milieu toutes les deux semaines. Après le 14e jour après l’observance, les cellules ont atteint leur maturité et peuvent être utilisées pour des expériences.

3. Différenciation des neurones corticaux

REMARQUE : Un schéma décrivant le protocole de différenciation des neurones corticaux est illustré à la figure 1G.

  1. Jour 0 :
    1. Une fois que les iPSC sont confluentes sur des plaques recouvertes d’une membrane basale à facteur de croissance réduit sans LDV, passez de la SCM à un mélange 50/50 de milieu N2/B27 complété par 10 μM de SB431542, 1 μM de dorsomorphine, 100 nM LDN193189.
      REMARQUE : Le milieu N2 se compose d’un milieu de base complété par un supplément de 1 % de N-2, 1 % de 200 mM de L-alanyl-L-glutamine dipeptide dans une solution de NaCl à 0,85 %, 1 % de pen/streptocoque. Le milieu B27 se compose de DMEM/F12 complété par un supplément de B-27 à 2 %, un dipeptide de L-alanyl-L-glutamine à 200 mM dans une solution de NaCl à 0,85 %, un stylo à 1 % par streptocoque.
    2. Changez de milieu avec les suppléments ci-dessus ajoutés quotidiennement pendant 7 jours.
  2. Jour 7 :
    1. Pré-revêtement des plaques dans une matrice de membrane basale à facteur de croissance réduit sans LDEV pendant au moins 2 h.
    2. Cellules de passage 1:1 sur des plaques pré-revêtues. Rincez les cellules avec 1 mL/puits de HBSS et retirez-les après les avoir laissés reposer pendant 30 s. Ajouter 1 mL/puits de milieu de décollement cellulaire (p. ex., Accutase) et incuber pendant 4 à 5 minutes à 37 °C. Pendant l’incubation, préparez des tubes coniques de 15 mL avec 5 mL de DMEM.
    3. Pipetez doucement l’agent de dissociation enzymatique pour prélever les cellules de la plaque avec une pipette P1000. Prélever l’agent de dissociation enzymatique et le mélange cellulaire dans le tube conique de 15 mL contenant 5 mL de DMEM.
    4. Centrifuger les tubes pendant 5 min à 300 x g. Remettre la pastille en suspension dans 1 mL de milieu N2/B27 contenant 10 μM d’Y-27632. Continuez les tétées quotidiennes avec le milieu N2/B27 sans aucun supplément.
  3. Jour 12 : Cellules de passage 1:1 selon les méthodes décrites à la section 3.2.2. Poursuivre les tétées quotidiennes avec le milieu N2/B27.
  4. Jour 15/16 : Cellules de passage 1:2 selon les méthodes décrites au point 3.2.2. Poursuivre les tétées quotidiennes avec le milieu N2/B27.
  5. Jour 18/19 : Cellules de passage 1:3 selon les méthodes décrites en 3.2.2. Continuez les tétées quotidiennes avec le milieu N2/B27 jusqu’au 25e jour.
  6. Jour 25 : Nourrir les cellules avec un milieu N2/B27 complété par 10 μM de DAPT.
  7. Jour 28 : Nourrir les cellules avec un milieu N2/B27 frais et non traité.
  8. Jour 30 : Passage des cellules à l’aide des méthodes décrites en 3.2 sur les plaques de culture de microglie et maintien dans le milieu BrainPhys complété par un supplément de 1 % de B-27.

4. Co-cultures microglie/neurone

  1. Plaque Day 30 neurones corticaux au-dessus de cultures microgliales à une densité de 50 000 cellules parcm2. Compléter le milieu avec de la laminine 1 μg/mL pour améliorer l’adhérence cellulaire.
  2. Maintenir les cultures dans un mélange de 50 % de milieu adhérent et de 50 % de milieu Brainohys complété par un supplément de 1 % de B-27. Effectuez un changement mi-moyen toutes les deux semaines jusqu’à l’expérimentation.
  3. Effectuez des expériences après que les neurones aient atteint le 60e jour.

5. Traitement à l’interféron γ

  1. Préparer un milieu frais complété par 100 ng/mL d’IFN-γ. Ajoutez le milieu et laissez incuber pendant 24 h. Retirez le support et passez à l’expérimentation.

6. Immunocytochimie

  1. Fixer les cellules dans la boîte de culture avec 100 μL de paraformaldéhyde à 4 % à température ambiante pendant 20 min.
  2. Rincer les cellules dans 1 mL de PBS trois fois pendant 5 minutes chacune.
  3. Ajouter 1 mL de PBST (PBS + 0,1 % de Triton X) pendant 10 min.
  4. Ajouter un tampon bloquant : 1 mL de PBS plus 5 % de sérum de chèvre pendant 1 h.
  5. Ajouter l’anticorps primaire dilué dans 100 μL de PBS + 1 % de sérum de chèvre - toute la nuit à 4 °C. Optimisez tous les anticorps primaires en conséquence.
  6. Rincer les cellules dans 1 mL de PBS trois fois pendant 5 minutes chacune.
  7. Ajouter l’anticorps secondaire, dilué dans 100 μL de PBS plus 1 % de sérum de chèvre - pendant 1 h à température ambiante.

7. Analyse de la colonne vertébrale

  1. Obtenez des images sur un microscope confocal à un grossissement de 60x.
  2. Utilisez la fonction ImageJ NeuronJ52 pour analyser les images.
  3. Obtenez des mesures de la longueur des neurites, de la longueur de la colonne vertébrale et du nombre de la colonne vertébrale via NeuronJ.

8. Imagerie calcique

  1. Préparez du milieu frais avec un colorant Fluo-4AM 3 μM. Incuber des co-cultures dans ce milieu pendant 30 min à 37 °C. Ensuite, rincez les cellules avec du PBS, ajoutez une solution d’imagerie de cellules vivantes aux cellules et procédez à l’imagerie.
  2. À l’aide d’un microscope confocal équipé pour l’imagerie de cellules vivantes, obtenez des images en accéléré à 40x pendant 2 min. L’activité peut être enregistrée au départ, avec une exposition à 15 mM de glutamate, ou dans le cadre de la dépolarisation avec 5 mM de chlorure de potassium.
  3. À l’aide d’ImageJ, mesurez l’intensité de la fluorescence au fil du temps pour des corps cellulaires individuels. À l’aide de l’outil de sélection, sélectionnez la région d’intérêt (ROI) individuelle entourant chaque corps de cellule. Ouvrez le Gestionnaire de retour sur investissement et appuyez sur Ajouter pour sélectionner. Continuez à ajouter de nouvelles sélections au gestionnaire de retour sur investissement.
  4. Utilisez l’outil Définir les mesures pour mesurer la zone grise moyenne. Lorsque le nombre de corps de cellule souhaité a été ajouté au gestionnaire de retour sur investissement, sélectionnez-les tous, puis utilisez l’outil Multi-Mesure . Cela fournira une lecture de la zone grise moyenne pour chacun au cours du fichier vidéo. Les données exportées donneront l’intensité moyenne de fluorescence pour la région d’intérêt pour chaque image.
  5. Déterminez le rapport d’intensité de fluorescence, F/F0, où F est l’intensité de fluorescence à un moment donné et F0 est l’intensité de fluorescence initiale. F/F0 peut être représenté graphiquement au fil du temps pour examiner l’activité spontanée dans les neurones ou examiné à l’intensité fluorescente maximale dans le cadre de la stimulation.

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Résultats

Validation du protocole
Les microglies dérivées d’iPSC ont été générées à partir de sept lignées d’iPSC sur trois cycles de différenciation différents. Les lignées témoins ML27, ML56, ML292 et ML364 et les lignées ML40, ML141 et ML250 de schizophrénie ont été utilisées. La caractérisation de ces lignées iPSC a été décrite précédemment51. Ces microglies dérivées d’iPSC ont été validées à l’aide de l’ICC et de la qPCR. Les microglies générées à partir du protocole adapté présenta...

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Discussion

Le développement de méthodes de différenciation le long de différentes trajectoires pour les cellules souches pluripotentes a ouvert de nombreuses voies pour l’étude de la fonction cérébrale et des processus pathologiques 53,54,55. Les études initiales s’étaient concentrées sur le développement de types de cellules neuronales spécifiques supposés être importants dans des troubles cérébraux spéci...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

Ce travail a été soutenu par un prix de recherche biocomportementale de l’Institut national de la santé mentale pour les nouveaux scientifiques innovants (BRAINS) R01MH113858 (à R.K.), un prix de développement des scientifiques cliniques de l’Institut national de la santé mentale K08MH086846 (à R.K.), le prix de développement des scientifiques cliniques de la Doris Duke Charitable Foundation (à R.K.), la Fondation bipolaire Ryan Licht Sang (à R.K.), la Fondation de la famille Jeanne Marie Lee-Osterhaus et le NARSAD Young Investigator Award de la Brain & Behavior Research Foundation (à A.K.), de la Fondation Phyllis & Jerome Lyle Rappaport (à R.K.), du Harvard Stem Cell Institute (à R.K.) et par Steve Willis et Elissa Freud (à R.K.). Nous tenons à remercier le Dr Bruce M. Cohen et la Dre Donna McPhie de la Harvard Medical School et de l’Hôpital McLean de nous avoir fourni les fibroblastes utilisés dans l’étude.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
AccutaseSigma-AldrichA6964
B-27 supplémentGibco17504044
b-FGFPeprotech100-18B
BMP-4Peprotech120-05ET
BrainphysStemCell Technologies5790
CD11C anticorpsBiolegend337207Dilution 1:200
Plaques de culture cellulaire à fond plat CostarCorning07-200-83
Anticorps Ctip2Abcamab18465
Anticorps monoclonal CUTL1AbnovaH00001523-M01
DMEM/F-12, sans rouge de phénolGibco21041025
dorsomorphineSigma-AldrichP5499
DPBS, sans calcium, sans magnésiumGibco14190144
Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM)Sigma-AldrichD6421
EasYFlask Flacons de culture cellulaireNunc156499
Fisherbrand Cell LiftersFisher Scientific08-100-240
Flt3-LigandPeprotech300-19
Fluo4-AMLife TechnologiesF-14201
Geltrex LDEV Free RGF BME 1 MLThermoFisher ScientificA1413201
GlutamaxThermoFisher Scientific35050061
GM-CSFPeprotech300-03
Chèvre Anti Poulet - IgG H& L (Alexa Fluor 488)Abcamab150169Dilution 1:1000
Chèvre Anti souris - IgG H& L (Alexa Fluor 568)InvitrogenA-11004Dilution 1:1000
Chèvre Anti Rat- IgG H& L (Alexa Fluor 405)Abcamab175670Dilution 1:1000
Chèvre Anti-Cochon d’Inde IgG H& L (Alexa Fluor 405)Abcamab175678Dilution 1:1000
Sérum de chèvreSigma-AldrichG9023
HBSSInvitrogen14170120
IBA1Abcamab5076Dilution 1:500
IL-34Peprotech200-34
INF-yPeprotech300-02
KiCqStart SYBR Green AmorcesSigma-AldrichKSPQ12012
LamininSigma-AldrichL2020
LDN193189Sigma-AldrichSML0599
Live Cell Imaging SolutionInvitrogenA14291DJ
MAP2 anticorpsSynaptic Systems188 004
M-CSFPeprotech300-25
Supplément N-2Gibco17502001
Neurobasal mediumLife Technologies21103049
NutriStem hPSC XF MediumBiological Industries01-0005
Anticorps P2RY12Biolegend848002
Paraformaldéhyde 16 %Fisher Scientific50-980-488
Pénicilline-streptomycineGibco15140122
Poly-L-OrthinineSigma-AldrichP3655
Anticorps SATB2Abcamab51502
SB431542Sigma-AldrichS4317
SCFStemcell Technologies78062
SensoPlate 24 puits Plaque à fond de verreGreiner-Bio662892
StemPro-34 SFM (1X)Anticorps Gibco10639011
TMEM119Abcamab185333Dilution 1:1000
TPOPeprotech300-18
Triton-XSigma-Aldrich9002-93-1
VEGFPeprotech100-20
VerseneThermoFisher Scientific15040066
Chlorhydrate d’y-27632 (inhibiteur de ROCK)Tocris1254
anticorps

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