Article de méthode

Détection des anticorps neutralisants du SRAS-CoV-2 à l’aide de l’imagerie fluorescente à haut débit de l’infection à pseudovirus

DOI :

10.3791/62486

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5 juin 2021

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1Ottawa Hospital Research Institute, 2Department of Biochemistry, Microbiology and Immunology, University of Ottawa

Dans cet article

Résumé

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Le protocole décrit ici décrit décrit une méthode rapide et efficace pour mesurer les anticorps neutralisants contre la protéine de pointe du SRAS-CoV-2 en évaluant la capacité des échantillons de sérum de convalescent à inhiber l’infection par un virus de la stomatite vésiculeuse marqué par une protéine fluorescente verte améliorée pseudotypée avec une glycoprotéine de pointe.

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Alors que la pandémie de COVID-19 causée par le coronavirus 2 du syndrome respiratoire aigu sévère (SRAS-CoV-2) continue d’évoluer, il est devenu évident que la présence d’anticorps neutralisants contre le virus peut fournir une protection contre une infection future. Ainsi, alors que la création et la traduction de vaccins efficaces contre la COVID-19 se poursuivent à une vitesse sans précédent, le développement de méthodes rapides et efficaces pour mesurer les anticorps neutralisants contre le SRAS-CoV-2 deviendra de plus en plus important pour déterminer la protection à long terme contre l’infection des personnes précédemment infectées et immunisées. Cet article décrit un protocole à haut débit utilisant le virus de la stomatite vésiculeuse (VSV) pseudotypé avec la protéine de pointe sars-CoV-2 pour mesurer la présence d’anticorps neutralisants dans le sérum de convalescent de patients récemment guéris de la COVID-19. L’utilisation d’un virus pseudotypé répliquant élimine la nécessité d’une installation de niveau de confinement 3 requise pour la manipulation du SARS-CoV-2, ce qui rend ce protocole accessible à pratiquement n’importe quel laboratoire de niveau de confinement 2. L’utilisation d’un format de 96 puits permet d’exécuter de nombreux échantillons en même temps avec un court délai d’exécution de 24 h.

Introduction

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En décembre 2019, un nouveau coronavirus a été identifié, que nous connaissons maintenant sous le nom de SARS-CoV-2, l’agent causal de la maladie à coronavirus 2019 (COVID-19)1. Le SARS-CoV-2 est un bêtacoronavirus de la famille des Coronaviridae. Ces virus enveloppés comprennent un grand génome d’ARN à sens positif et sont responsables d’infections respiratoires et intestinales chez l’homme et l’animal2. En mai 2021, plus de 157 millions de cas de COVID-19 ont été signalés dans le monde et plus de 3,2 millions de décès3. Le développement d’un vaccin efficace est devenu l’objectif principal des chercheurs du monde entier avec au moins 77 vaccins précliniques à l’étude et 90 actuellement en cours d’essais cliniques4.

Les coronavirus codent quatre protéines structurelles, dont la protéine de pointe (S), la nucléocapside (N), la protéine d’enveloppe (E) et la protéine membranaire (M). L’entrée du SARS-CoV-2 nécessite une interaction du domaine de liaison au récepteur (RBD) de S avec le récepteur hôte, l’enzyme de conversion de l’angiotensine humaine 2 (hACE2), et la fusion membranaire ultérieure après clivage protéolytique par la sérine protéase cellulaire hôte, la sérine 2 (TMPRSS2) transmembranaire5,6,7,8,9,10 . L’immunodominance humorale de la protéine S du SARS-CoV a déjà été rapportée et a maintenant été démontrée également pour le SARS-CoV-211,12,13. En effet, des réponses d’anticorps neutralisants contre S ont été détectées dans le sérum de convalescence de patients atteints du SRAS-CoV 24 mois après l’infection14,soulignant leur rôle essentiel dans la réponse immunitaire à long terme. La protéine S a été identifiée comme une cible vaccinale prometteuse et est ainsi devenue un composant clé de la plupart des vaccins en cours de développement15,16.

Bien que la détection rapide des anticorps neutralisants soit un aspect critique de la mise au point d’un vaccin, elle peut également faire la lumière sur le taux d’infection et la surveillance séro-épidémiologique dans les zones touchées17. Un VSV compétent en réplication pseudotypé avec la glycoprotéine SARS-CoV-2 S, à la place de la glycoprotéine VSV de type sauvage, pour étudier l’infection par le SARS-CoV-2 dans des contextes de biosécurité de niveau 2 a été gentiment donné par Whelan et ses collègues18. Le pic d’expression vsV (VSV-S) sera utilisé pour déterminer la réponse des anticorps neutralisants contre la protéine de pointe du SARS-CoV-2. Comme le VSV-S utilisé ici exprime également la protéine fluorescente verte améliorée (eGFP), les foyers eGFP peuvent être détectés dans les 24 h pour quantifier l’infection, tandis que la formation de plaque peut prendre de 48 à 72 h. Résumé ici est un protocole simple et efficace pour déterminer la capacité du sérum de patient convalescent à neutraliser l’infection VSV-S-eGFP. Cette méthode peut également être facilement adaptée pour interroger d’autres thérapies potentielles qui visent à perturber l’interaction hôte-viral de la protéine SARS-CoV-2 S.

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Protocole

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1. Cellules de placage (Jour 1) pour la production et la quantification du pseudovirus sars-CoV-2

  1. Préparation à la culture tissulaire
    1. Réchauffez 1x solution saline tamponnée au phosphate (DPBS) de Dulbecco; Le milieu Eagle modifié (DMEM) de Dulbecco contenant 10 % de sérum fœtal bovin (FBS) et 1 % de pénicilline/streptomycine (facultatif); et 0,25 % d’acide tétraacétique trypsine-éthylènediamine (EDTA) à 37 °C au bain-marie pendant environ 15 min.
    2. Désinfectez une hotte de culture tissulaire avec de l’éthanol à 70 % et placez des boîtes de culture tissulaire, des pipettes Pasteur et des pipettes sérologiques dans la hotte de culture tissulaire au besoin. Retirer le PBS, le DMEM et la trypsine du bain-marie et désinfecter avec de l’éthanol à 70 % avant de le placer dans la hotte de culture tissulaire.
  2. Placage et maintien des cellules
    1. Cultiver des cellules Vero E6 dans du DMEM (contenant 10% de FBS) dans des flacons de culture tissulaire T75 ou des boîtes de culture tissulaire de 15 cm dans un incubateur à 37 °C avec 5% de CO2. Passer les cellules au besoin lorsque les cellules sont confluentes à 80-90%.
    2. Lavez les cellules en ajoutant 10 mL de 1x PBS à chaque plat et en berçant doucement 4 à 5 fois; aspirer le PBS. Ajouter 3 mL de trypsine-EDTA à chaque plat, bercer la plaque pour s’assurer que toute la surface est couverte. Incuber les cellules à 37 °C avec 5 % de CO2 pendant environ 5 min, ou jusqu’à ce que les cellules se se détachent.
    3. Ajouter 7 mL de DMEM (contenant 10% de FBS) pour désactiver la trypsine, et resuspendez les cellules en pipetant plusieurs fois. Faire tourner les cellules pour éliminer la trypsine à l’aide d’une centrifugeuse de paillasse à 500 × g pendant 5 min, aspirer le milieu sans perturber la pastille cellulaire et ressuspender les cellules dans 10 mL de DMEM (contenant 10% de FBS). Si des cellules sont nécessaires pour de futures expériences, placez 1 mL dans un nouveau plat contenant 15 mL de DMEM frais (contenant 10% de FBS).
    4. Comptez les cellules à l’aide d’un compteur cellulaire automatisé ou d’un hémocytomètre, ajoutez environ 1 ×10 7 cellules à chaque plaque de 15 cm et incubez à 37 °C avec 5 % de CO2 jusqu’à ce qu’elles soient confluentes à 100 % (1-2 jours).

2. Préparation du pseudovirus VSV-S-EGFP

  1. Infection
    1. Infecter les cellules à multiplicité d’infection (MOI) 0,01 avec le virus vsV-S-eGFP dans 12 mL de DMEM sans sérum pendant 1 h à 37 °C avec 5 % de CO2, en secouant parfois les plaques. Remplacez l’inoculum par du DMEM frais (contenant 2% de FBS et 20 mM de HEPES, pH 7,7) et passez à un incubateur réglé à 34 °C avec 5% de CO2.
      REMARQUE: Une température de 34 °C est requise pour la propagation du VSV-S-eGFP en culture cellulaire.
    2. Recueillir les surnageants cellulaires après l’observation d’un effet cytopathique étendu (EPC) et d’un décollement cellulaire, environ 48 heures après l’infection. Utilisez un microscope fluorescent pour visualiser l’expression étendue de l’eGFP par les cellules infectées à partir de 24 heures après l’infection.
  2. Collection
    1. Centrifuger les surnageants à l’aide d’une centrifugeuse de paillasse pendant 5 min à 1 000 × g à 4 °C pour éliminer les débris cellulaires. Aliquotez le surnageant pour éviter de multiples cycles de gel-dégel et conservez-le à -80 °C.

3. Titrage du pseudovirus VSV-S-eGFP

  1. Dilution en série pour déterminer le titre viral
    1. Plaques de cellules Vero E6 sur plaques à 6 puits à une densité d’ensemencement de 6 ×10 à 5 cellules par puits dans le DMEM (avec 10% fbS), et incuber toute la nuit à 37 °C avec 5% de CO2.
      REMARQUE: Les cellules Vero qui surexpriment TMPRSS2 et hACE2 peuvent également être utilisées.
    2. Mettre en place une série de dilution en série 10 fois du virus VSV-S-eGFP dans le DMEM sans sérum du rhume en plaçant 900 μL de milieu dans sept tubes de microcentrifugation. Étiquetez les tubes de 1 à 7. Ajouter 100 μL de la souche virale au premier tube et vortex brièvement. Transférer 100 μL de virus dilué du tube 1 au tube 2 et vortex brièvement; continuer jusqu’au tube 7.
    3. Aspirer le milieu de tous les puits de la plaque de 6 puits contenant des cellules Vero E6, et remplacer par 500 μL de dilutions10-2 à 10-7 . Incuber les plaques pendant 45 min à 37 °C avec 5% de CO2,en berçant doucement toutes les 15 min.
    4. Aspirer l’inoculum et le remplacer par une superposition contenant un mélange 1:1 de 2x DMEM et 6% de carboxyméthylcellulose (CMC), concentration finale de 3% de CMC, complété par 10% fbS; incuber à 34 °C avec 5 % de CO2 pendant 48 h.
      REMARQUE: Préchauffez le mélange superposé dans un bain-marie à 37 °C pendant 15 minutes pendant l’étape d’infection. Un mélange 1:1 d’agarose à 1 % avec 2x DMEM complété par 10% de FBS peut être utilisé à la place de CMC. Pour superposer avec de l’agarose, faire bouillir 1% d’agarose (en dH2O)et mélanger avec 2x DMEM froid. Assurez-vous que le mélange est à une température appropriée avant d’ajouter à la monocouche de la cellule (environ 37-40 ° C). Si l’agarose est utilisé pour la superposition, les cellules doivent être fixées par incubation dans 2 mL de méthanol:acide acétique 3:1 pendant au moins une heure avant la coloration.
  2. Coloration et calcul du titre viral
    1. Visualisez les plaques en les colorant avec du violet cristallin ou en visualisant directement l’eGFP sous un microscope fluorescent.
    2. Pour tacher les plaques, aspirer la superposition, laver une fois avec du PBS, puis ajouter 2 mL de violet cristallin à 0,1% (dans 80% de méthanol et dH2O) à chaque puits. Placer sur une bascule à plaque pendant environ 20 minutes à température ambiante avant de détachant. Retirez le cristal violet et lavez doucement chaque puits deux fois à l’aide de dH2O ou PBS.
      REMARQUE: Les étapes de lavage et de coloration doivent être effectuées doucement en pipetant lentement vers le côté de chaque puits pour s’assurer que la monocouche cellulaire reste intacte tout au long de la procédure.
    3. Laisser sécher les plaques pendant au moins 1 h avant de compter les plaques. S’assurer que le nombre de plaques est obtenu à partir de puits contenant de 20 à 200 plaques. Pour calculer le titre du virus en unités formant de la plaque (PFU) par mL, multipliez le facteur de dilution du puits compté par le volume d’infection et divisez ce nombre des plaques présentes dans le puits respectif.
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4. Cellules de placage (Jour 1) pour la mesure de la neutralisation du pseudovirus SARS-CoV-2 par des anticorps disponibles dans le commerce et du sérum de patient convalescent

  1. Préparation à la culture tissulaire
    1. Préparer le milieu et la cagoule de culture tissulaire comme décrit à la rubrique 1. De plus, préparer le nombre nécessaire de 96 plaques de puits pour accueillir un minimum de 2 répétitions par échantillon (c.-à-d. 1 plaque pour 6 échantillons); ajouter des répétitions supplémentaires si le volume d’échantillon le permet.
  2. Placage et maintien des cellules
    1. Cultiver et entretenir les cellules Vero E6 comme décrit à la rubrique 1. Préparer au moins 10 mL de suspension cellulaire par plaque de 96 puits à une concentration de 2 × 105 cellules par mL (plaque de 1,5 × 105 cellules par mL pour les essais effectués après 48 h, si nécessaire). Ajouter 100 μL de suspension cellulaire à chaque puits d’une plaque de 96 puits à l’aide d’une pipette multicanal, et incuber pendant 24 h à 37 °C avec 5 % de CO2.
      REMARQUE: Mélangez bien la suspension cellulaire et bercez doucement chaque plaque dans toutes les directions pour assurer une distribution uniforme des cellules.

5. Anticorps ou dilutions sériques et infections (Jour 2)

REMARQUE: Ce protocole peut être appliqué pour mesurer la neutralisation du VSV-S-eGFP par les anticorps disponibles dans le commerce et le sérum du patient, ainsi que le sérum prélevé sur les animaux pour les études précliniques de développement de vaccins. *Prenez note des étapes supplémentaires énumérées lors de la manipulation d’échantillons de sérum de patients ou d’animaux.

  1. Série de dilution en série
    1. Avant de diluer les échantillons de sérum, inactiver la chaleur de chaque échantillon dans un bain-marie à 56 °C pendant 30 min pour inactiver le complément. S’assurer que les précautions de sécurité nécessaires sont prises lors de la manipulation d’échantillons de patients; n’ouvrez les contenants d’échantillons que dans la hotte de culture tissulaire et assurez-vous que l’équipement de protection individuelle approprié de niveau de confinement 2 est porté.
    2. Installer la série de dilution dans une plaque vide de 96 puits (planche 1).
    3. Commencer toutes les dilutions dans la rangée A de la plaque de 96 puits dans 80 μL. *Pour les échantillons de patients, commencez la série de dilution à 1 sur 10 en plaçant 8 μL de sérum dans 72 μL de DMEM sans sérum (avec 1 % de pénicilline/streptomycine).
      REMARQUE: La concentration d’anticorps neutralisants utilisés dépendra de l’activité prédite par le fabricant. Pour l’anticorps neutralisant SARS-CoV-2 Spike utilisé ici (voir le tableau des matériaux),commencez par 5 μg/mL pour observer une neutralisation d’au moins 50 %.
    4. Ajouter 40 μL de DMEM sans sérum (avec 1 % de pénicilline/streptomycine) aux rangées B à G et 80 μL à la rangée H. N’ajoutez pas de virus à la ligne H, car il sert de contrôle cellulaire uniquement.
    5. À l’aide d’une pipette multicanal à 12 puits, mélanger et transférer 40 μL de sérum dilué ou d’anticorps de la rangée A à la rangée B. Mélanger et répéter jusqu’à la rangée F, jeter 40 μL de la rangée F. N’ajoutez pas de sérum à la ligne G car elle représente la ligne de contrôle du virus uniquement.
  2. Infection et superposition
    1. Préparer un volume approprié de VSV-S-eGFP dilué pour traiter chaque puits à MOI 0,05 (ou 2000 pfu). (Lorsque vous effectuez ce calcul, gardez à l’esprit que seulement 60 μL du volume total de 80 μL seront déplacés sur les cellules; par conséquent, assurez-vous de multiplier le volume du virus par 1,33 pour maintenir 2000 pfu).
      REMARQUE: Comme le VSV-S-eGFP est sensible à la température, assurez-vous que les stocks viraux restent sur la glace lorsqu’ils ne sont pas utilisés et évitez les cycles de gel-dégel multiples, car les titres diffèrent après une congélation répétée.
    2. Ajouter 40 μL de virus dilué à chaque puits dans les rangées A à G de la plaque 1 et mélanger en pipetant de haut en bas 4 à 5 fois. Incuber la plaque pendant 1 h à 37 °C avec 5% de CO2.
    3. Retirez la plaque contenant les cellules de l’incubateur (planche 2) et aspirez soigneusement le milieu de tous les puits. Transférer 60 μL de mélange anticorps/virus de la plaque 1 à la plaque 2, et incuber pendant 1 h à 37 °C avec 5 % de CO2,en berçant la plaque toutes les 20 minutes.
    4. Complétez chaque puits avec 140 μL de superposition contenant du CMC dans du DMEM pour une concentration finale de 3 % de CMC (avec 10 % de FBS et 1 % de pénicilline/streptomycine). Placer la plaque 2 dans un incubateur réglé à 34 °C avec 5 % de CO2 pendant environ 24 h avant l’imagerie.
      REMARQUE: Préchauffez le mélange superposé dans un bain-marie à 37 °C pendant 15 minutes pendant l’étape d’infection.

6. Imagerie et quantification (Jour 3)

  1. Plaques d’image utilisant un imageur fluorescent automatisé (utilisant un filtre à isothiocyanate de fluorescéine (FITC) ou un filtre alternatif avec une longueur d’onde d’excitation de 488 nm). Quantifier l’infection virale en créant un protocole qui identifie et compte automatiquement les foyers eGFP individuels. Si aucune fonction de comptage automatique n’est disponible, utilisez le logiciel ImageJ pour quantifier le nombre de foyers eGFP.

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Résultats

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Ce protocole décrit une méthode rapide et efficace pour détecter les anticorps neutralisants contre la protéine SARS-CoV-2 S via l’inhibition de l’infection par le pseudovirus VSV-S-eGFP (quantifiable par la perte de foyers eGFP détectés). Une représentation schématique du protocole est représentée à la figure 1. Il est recommandé d’utiliser un anticorps disponible dans le commerce comme témoin positif chaque fois que le test est effectué pour assurer la cohérence du test. Ici, nous démontro...

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Discussion

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La méthode décrite ici peut être adaptée pour s’adapter à divers environnements et ressources de laboratoire, selon les besoins. Il est important de se tromper que la principale limite de ce protocole est la nécessité d’un espace de confinement de niveau 2 et d’une hotte de culture tissulaire. L’application d’un virus à ARN répliquant pseudotypé avec le pic SARS-CoV-2, tel que VSV-S-eGFP, est une alternative redoutable au virus SARS-CoV-2, qui nécessite une zone de travail de niveau de confinement 3, mais peut rester une...

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Déclarations de divulgation

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Les auteurs n’ont pas d’intérêts financiers concurrents liés à cette publication.

Remerciements

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Nous tenons à remercier le laboratoire Whelan d’avoir généreusement fourni le virus VSV-S-eGFP utilisé dans ce protocole (décrit dans Case et al. 2020). Nous remercions également les Drs Bill Cameron et Juthaporn Cowan (et leur équipe) d’avoir prélevé les échantillons de sang des patients (ID du protocole REB 20200371-01H). Les auteurs divulguent avoir reçu le soutien financier suivant pour la recherche, la paternité et/ou la publication de cet article : Ce travail a été financé par le généreux soutien de la Fondation de l’Hôpital d’Ottawa et une subvention des Instituts de recherche en santé du Canada (no 448323) et une subvention rapide de la Fondation Thistledown pour la science covid-19 au C.S.I. T.R.J. est financée par une bourse d’études supérieures de l’Ontario et une bourse Mitacs de grappe. JP est financé par une bourse Mitacs de cluster. T.A. est financé par une bourse d’interdiction des IRSC. Nous tenons également à remercier toutes les personnes qui ont participé et donné leurs échantillons de sang pour cette étude.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
0,25 % trypsine-EDTA (Gibco)Fisher scientificLS25200114
ArrayScan VTI HCSThermo Fisher ScientificImageur fluorescent automatisé
carboxyméthylcelluloseSigmaC5678
Eagle medium modifié de Dulbecco (Gibco)Fisher scientific10-013-CV
Eagle modifié de Dulbecco's medium (Poudre) (Gibco)Thermo Fisher Scientific12-800-017
Dulbecco' s Saline tamponnée au phosphate (DPBS)Fisher scientific21-031-CV
HEPESFisher scientificBP-310-500
Contrôle des isotypes IgG (souris)Thermo Fisher Scientific31903
Pénicilline/streptomycineThermo Fisher Scientific15070063
SARS-CoV-2 (2019-nCoV) Anticorps neutralisant de pointe, Mab de sourisSinoBiologique40592-MM57
Vero E6 cellulesATCC  ; CRL-1586

Références

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Mots-clés

Pseudovirus Neutralization AssayHigh Throughput ImagingVero E6 CellsSpike Protein PseudovirusConvalescent SerumPlaque AssayCrystal Violet StainingAntibody Quantification

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