Un test d’activité enzymatique à haut débit pour sonder l’interaction de petites molécules avec la dNTPase SAMHD1

Résumé

SAMHD1 est une désoxynucléoside triphosphate triphosphohydrolase qui joue un rôle essentiel dans la santé et les maladies humaines. Nous présentons ici un test d’activité SAMHD1 couplé à des enzymes polyvalent, déployé dans un format de microplaque à 384 puits, qui permet d’évaluer de petites molécules et des analogues nucléotidiques en tant que substrats, activateurs et inhibiteurs de SAMHD1.

Résumé

La protéine 1 contenant le motif alpha stérile et le domaine MH (SAMHD1) est un régulateur essentiel des pools intracellulaires de désoxynucléoside triphosphate (dNTP), car cette enzyme peut hydrolyser les dNTP en leurs nucléosides et triphosphates inorganiques correspondants. En raison de son rôle critique dans le métabolisme des nucléotides, de son association à plusieurs pathologies et de son rôle dans la résistance aux traitements, d’intenses recherches sont actuellement menées pour mieux comprendre à la fois la régulation et la fonction cellulaire de cette enzyme. Pour cette raison, le développement de méthodes simples et peu coûteuses à haut débit pour sonder l’interaction de petites molécules avec SAMHD1, telles que des régulateurs allostériques, des substrats ou des inhibiteurs, est vital. Pour cela, le test vert de malachite couplé à des enzymes est un test colorimétrique simple et robuste qui peut être déployé dans un format de plaque de 384 micropuits permettant la mesure indirecte de l’activité de SAMHD1. Comme SAMHD1 libère le groupe triphosphate des substrats nucléotidiques, nous pouvons coupler une activité pyrophosphatase à cette réaction, produisant ainsi du phosphate inorganique, qui peut être quantifié par le réactif vert de malachite par la formation d’un complexe vert de malachite phosphomolybdate. Ici, nous montrons l’application de cette méthodologie pour caractériser les inhibiteurs connus de SAMHD1 et pour décrypter les mécanismes impliqués dans la catalyse de SAMHD1 des substrats non canoniques et la régulation par les activateurs allostériques, illustrés par les médicaments anticancéreux à base de nucléosides. Ainsi, le test vert de malachite couplé à des enzymes est un outil puissant pour étudier SAMHD1, et pourrait également être utilisé dans l’étude de plusieurs enzymes qui libèrent des espèces de phosphate.

Introduction

Le motif alpha stérile et la protéine 1 contenant le domaine de l’histidine-aspartate (SAMHD1) sont un régulateur central de l’homéostasie des nucléotides dans les cellules de mammifères¹ avec de nombreux rôles dans la santé humaine et la maladie². Cette enzyme est capable d’hydrolyser les désoxynucléosides triphosphates (dNTP) en leurs molécules apparentées de désoxynucléoside et de triphosphate inorganique ^3,4, cette activité étant régulée de manière allostérique par l’abondance des (d)NTP (voir référence⁵). Chaque monomère SAMHD1 contient deux sites allostériques (AS1 et AS2) et un site catalytique, et la formation de l’enzyme active nécessite l’assemblage ordonné d’un homotétramère lors de la liaison (d)NTP. La dimérisation des monomères SAMHD1 est d’abord déclenchée par la liaison d’un triphosphate de guanine (GTP ou dGTP) à l’AS1, et la tétramérisation ultérieure est réalisée lorsqu’une molécule supplémentaire de dNTP se lie à l’AS2, permettant l’accès du substrat au site catalytique et l’hydrolyse ultérieure.

Les substrats de SAMHD1 comprennent les quatre dNTP canoniques ^3,4 ainsi que certains nucléotides modifiés en base et en sucre, y compris les métabolites triphosphatés de plusieurs médicaments à base de nucléosides utilisés dans le traitement des infections virales et du cancer, dont plusieurs peuvent également servir d’activateurs allostériques 6,7,8,9,10,11 . En conséquence, SAMHD1 module l’efficacité de bon nombre de ces composés dans les modèles de maladies 7,8,9,10,11,12,13,14,15, et en outre, dans le cas de l’analogue de la désoxycytidine, la cytarabine (ara-C), qui est restée un traitement standard pour la leucémie myéloïde aiguë (LAM) pendant des décennies, dicte Efficacité du traitement dans cette maladie ^7,8,16. SAMHD1 est donc un biomarqueur potentiel et une cible thérapeutique pour améliorer l’efficacité des thérapies à base de nucléosides¹⁷, et par conséquent, nous avons cherché avec d’autres à identifier des stratégies pour inactiver SAMHD1 dans les cellules. Nous avons proposé l’utilisation de la protéine virale X (Vpx) comme inhibiteur biologique pour cibler la dégradation de SAMHD1 à l’intérieur des cellules cancéreuses⁷, cependant, cette approche présente un certain nombre de limites (discutées dans la référence¹²), et nous avons également récemment rapporté une approche indirecte pour supprimer l’activité de SAMHD1 via l’inhibition de la ribonucléotide réductase que nous avons démontrée dans divers modèles de LAM¹⁸. Un certain nombre d’études ont cherché à identifier de petites molécules capables d’inhiber directement la SAMHD1, et à ce jour, plusieurs molécules de ce type ont été rapportées, cependant, ne documentant l’inhibition in vitro que ^{6,9,19,20,21,22}. En conséquence, l’absence de petites molécules qui inhibent puissamment l’activité de SAMHD1 dans les cellules, associée aux mécanismes complexes de la catalyse SAMHD1 des thérapies à base de nucléosides, souligne la nécessité d’une étude plus approfondie. Ainsi, des méthodes robustes et idéalement à haut débit pour sonder l’interaction de petites molécules avec SAMHD1 sont idéales afin d’identifier les substrats, les régulateurs allostériques et les inhibiteurs, de cette enzyme cliniquement pertinente.

Plusieurs méthodologies sont disponibles qui mesurent directement l’activité dNTPase de SAMHD1, telles que la chromatographie sur couche mince (CCM)^9,20,23 et la chromatographie liquide à haute performance (HPLC)^9,21, mais elles ne se prêtent pas facilement aux configurations à haut débit. Une exception est l’essai rapporté par Mauney et al., qui exploite la capacité de SAMHD1 à hydrolyser le phosphate bis (4-nitrophényl) (b4NPP) en p-nitrophénol et en phosphate de p-nitrophényle lorsque Mn²⁺ est utilisé comme cation activateur, ce qui entraîne un changement colorimétrique qui peut être facilement mesuré dans une plaque de micropuits²¹. Ce test a été utilisé avec succès pour l’identification et la caractérisation des inhibiteurs de SAMHD1, mais il convient de noter que l’hydrolyse se produit en l’absence d’activateurs de (d)NTP et en présence d’un cation activateur non physiologique probable, les deux étant des mises en garde importantes à prendre en compte. Cela rend également ce test moins applicable à l’étude et à l’identification des régulateurs allostériques de SAMHD1.

Dans ce contexte, une approche enzymatique combinée au réactif vert de malachite, telle que détaillée dans ce rapport, peut être une méthode polyvalente pour mesurer indirectement l’activité dNTPase de SAMHD1 et, en outre, interroger l’impact de diverses petites molécules sur celle-ci. Le test au vert de malachite est une technique colorimétrique robuste et fiable pour la détection du phosphate inorganique libre (Pi), basée sur la formation d’un complexe d’acide molybdophosphorique qui conduit à un changement colorimétrique mesuré à 620 nm²⁴. L’hydrolyse de SAMHD1 libérant le groupe triphosphate des substrats nucléotidiques, il est donc nécessaire de coupler cette réaction avec une activité (pyro)phosphatase, qui va générer du phosphate inorganique libre, avant l’ajout du réactif vert malachite. Le test vert de malachite est sensible et rentable et a été largement utilisé pour l’identification et la caractérisation d’inhibiteurs et de substrats pour les enzymes qui libèrent des groupes phosphate inorganiques soit dans leurs réactions, soit en présence d’une enzyme de couplage. Il a été largement appliqué dans la caractérisation des activités ATPase des hélicases 25,26,27, ou dans l’étude de l’activité enzymatique de CD73, qui médie la dégradation de l’AMP en adénosine et en phosphate inorganique ²⁸. De plus, lorsqu’il est couplé, il a été utilisé dans la découverte d’antibiotiques ciblant l’UDP-2,3-diacylglucosamine pyrophosphatase LpxH, une enzyme essentielle dans la plupart des agents pathogènes à Gram négatif²⁹. En ce qui concerne la recherche sur le cancer, l’approche enzymatique a été largement déployée contre les hydrolases NUDIX, une famille d’enzymes métabolisant les nucléotides, à la fois dans la caractérisation des substrats 30,31,32 et dans l’identification et le développement de médicaments et de sondes chimiques 33,34,35,36.

En ce qui concerne la dNTPase SAMHD1, cette approche a été utilisée dans plusieurs rapports. En utilisant l’exopolyphosphatase Ppx1 de Saccharomyces cerevisiae comme enzyme de couplage, ce test a été utilisé pour tester plusieurs analogues nucléotidiques en tant que substrats, activateurs ou inhibiteurs de SAMHD1, et a abouti à l’identification du métabolite triphosphate du médicament anti-leucémique clofarabine en tant qu’activateur et substrat⁶. De plus, avec la pyrophosphatase inorganique d’Escherichia coli comme enzyme de couplage, il a été utilisé dans le criblage d’une bibliothèque de composés cliniquement approuvés contre SAMHD1 pour identifier les inhibiteurs²⁰. Dans nos recherches, nous avons utilisé cette approche pour montrer que l’ara-CTP, le métabolite actif de l’ara-C, est un substrat de SAMHD1 mais pas un activateur allostérique⁷ et nous avons ensuite utilisé ce test pour montrer que plusieurs petites molécules qui pourraient sensibiliser les modèles de LAM à l’ara-C d’une manière dépendante de SAMHD1, n’inhibaient pas directement SAMHD1¹⁸. Dans ce rapport, nous détaillerons cette méthode polyvalente et démontrerons son applicabilité, dans une configuration à haut débit, pour l’identification d’inhibiteurs, d’activateurs et de substrats de SAMHD1.

Protocole

Un aperçu schématique des méthodes ci-dessous est illustré à la figure 1 et une liste détaillée des matériaux et des réactifs est disponible dans le tableau des matériaux.

1. Préparation des tampons d’essai.

1. Préparation des tampons de stock.
   REMARQUE : Comme le test est sensible à la détection des phosphates, qui peuvent être courants, rincez la verrerie trois fois avec de l’eau ultra-pure ou doublement distillée pour éviter la contamination. Tous les tampons peuvent être stockés à température ambiante (RT).
   1. Préparer 1 L de solution mère de tampon de réaction (RB) SAMHD1 (25 mM de Tris-Acétate pH 8, 40 mM de NaCl, 1 mM de MgCl₂) en dissolvant 4,5 g de Tris Acétate, 2,3 g de NaCl et 0,2 g de MgCl₂ dans environ 800 mL d’eau avant d’ajuster au pH 8 et au volume final.
   2. Préparer 5 mL de solution mère de TCEP 0,1 M en diluant 1 mL de TCEP 0,5 M dans 4 mL d’eau.
   3. Préparer 50 mL de solution mère 11 % Tween-20 en diluant 5 mL de 100 % Tween-20 dans 44,5 mL d’eau.
      REMARQUE : L’interpolation 20 est sensible à la lumière.
   4. Préparer 50 mL de solution d’arrêt EDTA 0,5 M en dissolvant 9,3 g EDTA dans environ 40 mL d’eau avant d’ajuster au pH 8 et au volume final.
   5. Préparer la solution mère de vert de malachite (MG) (3,2 mM de vert de malachite dans H₂SO₄) en ajoutant lentement 60 mL d’acide sulfurique concentré à 300 mL d’eau dans une bouteille en verre brun. Refroidir la solution à RT et dissoudre 0,44 g de vert de malachite.
      PRUDENCE: La réaction de l’acide sulfurique avec l’eau est exothermique et la bouteille peut donc chauffer, provoquant une accumulation de pression ; Assurez-vous que cette pression est relâchée fréquemment.
      REMARQUE : La solution orange résultante est sensible à la lumière (d’où la bouteille brune) et stable pendant au moins 1 an à RT. Un précipité peut se former avec le temps, assurez-vous que seul le surnageant est utilisé.
   6. Préparer 50 mL de solution mère de molybdate d’ammonium à 7 % en dissolvant 3,75 g de molybdate d’ammonium dans 50 mL d’eau.
      REMARQUE : Des précipités peuvent se former avec le temps, assurez-vous que seul le surnageant est utilisé.
2. Préparation de tampons d’essai complets
   REMARQUE : Cela doit être fait le jour de l’expérience
   1. Préparer le SAMHD1 RB complet (25 mM d’acétate de tris pH 8, 40 mM de NaCl, 1 mM de MgCl₂, 0,3 mM de TCEP, 0,005 % de Tween-20). Utiliser des stocks TCEP à 11 % Tween-20 et 0,1 M préparés précédemment pour ajouter ces composants à une concentration finale de 0,005 % pour Tween-20 et de 0,3 mM pour TCEP au stock RB SAMHD1.
   2. Préparer la solution d’arrêt de l’EDTA (25 mM de tris-acétate pH 8, 40 mM de NaCl, 1 mM de MgCl₂, 0,3 mM de TCEP, 0,005 % de Tween-20, 7,9 mM d’EDTA). Pour compléter SAMHD1 RB, utiliser une solution mère d’EDTA à 0,5 M pour ajouter de l’EDTA à une concentration finale de 7,9 mM.
   3. Préparer la solution de travail MG (2,5 mM de vert de malachite, 1,4 % de molybdate d’ammonium, 0,18 % de Tween-20) en mélangeant 10 parties de solution mère de MG avec 2,5 parties de molybdate d’ammonium à 7 % et 0,2 partie de Tween-20 à 11 %.

2. Essai d’inhibition de SAMHD1 et détermination du composé IC₅₀

NOTA : Les conditions finales de l’analyse sont indiquées dans le tableau 1.

1. Préparation des composés dans une plaque d’essai
   REMARQUE : Les composés de faible poids moléculaire sont généralement dissous dans 100% de DMSO et d’analogues nucléotidiques dans l’eau. La concentration du stock varie de 10 à 100 mM et est influencée par la puissance et la solubilité des composés, ainsi que par la tolérance au DMSO du dosage. Vérifiez que la concentration finale de DMSO dans la réaction ne dépasse pas 1 % pour vous assurer que les activités enzymatiques ne sont pas affectées par ce solvant. Il est recommandé de tester la tolérance de l’essai au solvant avant l’expérience.
   1. Préparer des composés d’essai dilués en série à 100 fois la concentration finale dans le solvant pertinent (p. ex., 100 % de DMSO pour les petites molécules ou de l’eau pour les analogues nucléotidiques) dans une plaque transparente en polypropylène à fond rond à 96 puits à l’aide d’une pipette multicanal ou d’un équipement automatisé de manipulation des liquides.
      REMARQUE : En fonction de la stabilité du composé, les plaques de dilution peuvent être préparées à l’avance, scellées et stockées à -20 °C. Laissez les plaques s’équilibrer à RT avant de continuer le protocole.
   2. À l’aide de SAMHD1 RB complet, diluer les composés à 25 fois la concentration finale (pour maintenir la concentration finale de solvant en dessous de 1 %) et transférer 5 μL dans les puits appropriés d’une plaque d’essai transparente à fond plat de 384 puits. Répétez la procédure avec des échantillons témoins contenant uniquement des solvants.
2. Préparation des composants de la réaction
   REMARQUE : Cela doit être fait le jour de l’analyse. Les aliquotes humaines recombinantes de SAMHD1 et d’E. coli pyrophosphatase (PPase) sont stockées à long terme à -80 °C diluées à 9,1 mg/mL et 23,0 mg/mL, respectivement, dans un tampon de stockage (20 mM HEPES pH 7,5, 300 mM NaCl, 10 % de glycérol, 2 mM de TCEP). Une fois décongelées, les aliquotes sont stockées à court terme à -20 °C.
   1. Préparer le mélange maître enzymatique (SAMHD1/PPase) en diluant la protéine humaine SAMHD1 recombinante et la PPase recombinante dans SAMHD1 RB complet jusqu’à 4 fois la concentration finale souhaitée, soit 1,4 μM de SAMHD1 et 50 U/mL de PPase.
   2. Préparer l’activateur/substrat dGTP en diluant le stock de dGTP (généralement 10 ou 100 mM dans l’eau) dans du SAMHD1 RB complet jusqu’à 2 fois la concentration finale, soit 50 μM dGTP.
3. Effectuer le test
   REMARQUE : Tous les composants du test doivent être équilibrés par rapport à RT. Les ajouts de liquide peuvent être effectués à l’aide d’une pipette multicanal ou d’un distributeur de liquide réactif en vrac.
   1. Sur une plaque d’essai à 384 puits contenant des dilutions de composés et des témoins de solvant uniquement, distribuer 5 μL de mélange maître SAMHD1/PPase. Pour éviter les puits de contrôle enzymatique, distribuer 5 μL de SAMHD1 RB complet. Pré-incuber l’enzyme et les composés pendant 10 min à RT.
   2. Dans tous les puits, distribuer 10 μL de solution 2x dGTP pour démarrer la réaction.
   3. Incuber la réaction pendant 20 min à RT.
   4. Arrêtez la réaction en distribuant 20 μL de solution d’arrêt EDTA dans tous les puits.
      REMARQUE : L’expérience peut être mise en pause ici si vous le souhaitez.
   5. Ajouter 10 μL de solution de travail MG à tous les puits.
      PRUDENCE: La solution de travail MG contient de l’acide sulfurique.
   6. Assurer le mélange du contenu du puits à l’aide d’un agitateur à plaque orbital à micropuits et la centrifugation à 1 000 x g pendant 1 min.
   7. Incuber la plaque pendant 20 min à RT.
   8. Lire l’absorption à une longueur d’onde de 630 nm dans un lecteur de plaques à micropuits.
4. Visualisation et analyse des données
   1. Calculer la moyenne et l’écart-type des puits témoins positifs et négatifs (positif, réaction complète avec solvant ; négatif, dGTP seul avec solvant). Calculer le facteur Z³⁷ comme indicateur de la qualité de l’analyse.
   2. Normalisez chaque valeur d’absorbance aux valeurs moyennes des témoins positifs et négatifs, en définissant le témoin positif comme une activité SAMHD1 à 100 % et le témoin négatif comme une activité SAMHD1 à 0 %.
   3. Tracer l’activité de SAMHD1 (%) en fonction de la concentration du composé et ajuster une courbe dose-réponse à pente variable à quatre paramètres, permettant de déterminer le composé IC₅₀.

3. Activateur SAMHD1 et écran de substrat

NOTA : Les conditions finales de l’analyse sont indiquées dans le tableau 2. Les aliquotes recombinantes de SAMHD1 et de PPase sont stockées à long terme à -80 °C diluées à 9,1 mg/mL et 23,0 mg/mL, respectivement, dans un tampon de stockage (20 mM HEPES pH 7,5, 300 mM NaCl, 10 % de glycérol, 2 mM TCEP) à -80 °C. Une fois décongelées, les aliquotes sont stockées à court terme à -20 °C.

1. Préparation d’analogues nucléotidiques dans une plaque d’essai
   1. Diluer les stocks d’analogues nucléotidiques (généralement 10 ou 100 mM dans l’eau) à 4 fois la concentration finale dans le SAMHD1 RB complet, dans notre cas un analogue nucléotidique de 800 μM, et transférer 5 μL dans les puits appropriés d’une plaque d’essai de 384 puits.
2. Préparation des composants de la réaction
   REMARQUE : Cela doit être fait le jour de l’analyse
   1. Préparer le mélange maître enzymatique (SAMHD1/PPase) en diluant la protéine humaine recombinante SAMHD1 et la PPase E . coli recombinante dans SAMHD1 RB complet à 2 fois la concentration finale souhaitée, soit 0,7 μM de SAMHD1 et 25 U/mL de PPase.
   2. Préparer la solution de PPase seule en diluant la PPase d’E. coli recombinante dans la SAMHD1 RB complète jusqu’à 2 fois la concentration finale souhaitée, soit 25 U/mL de PPase.
   3. Préparer les activateurs GTP (AS1) et dGTPαS (AS1 et AS2) (généralement 10 ou 100 mM dans l’eau) dans du SAMHD1 RB complet jusqu’à 4 fois la concentration finale, soit 50 μM GTP ou dGTPαS.
3. Effectuer le test
   REMARQUE : Tous les composants du test doivent être équilibrés par rapport à RT. Les ajouts de liquide peuvent être effectués à l’aide d’une pipette multicanal ou d’un distributeur de liquide réactif en vrac.
   1. Sur une plaque d’essai à 384 puits contenant des analogues nucléotidiques, distribuer 5 μL de l’activateur (GTP ou dGTPαS) ou compléter le SAMHD1 RB dans les puits appropriés.
   2. Commencer la réaction en distribuant 10 μL de mélange maître SAMHD1/PPase, de PPase seule ou de SAMHD1 RB complet dans les puits appropriés.
   3. Incuber la réaction pendant 20 min à RT.
   4. Arrêtez la réaction en distribuant 20 μL de solution d’arrêt EDTA dans tous les puits.
      REMARQUE : L’expérience peut être mise en pause ici si vous le souhaitez.
   5. Ajouter 10 μL de solution de travail MG à tous les puits.
      PRUDENCE: La solution de travail MG contient de l’acide sulfurique.
   6. Assurer le mélange du contenu du puits à l’aide d’un agitateur à plaque orbital à micropuits et la centrifugation à 1 000 x g pendant 1 min.
   7. Incuber la plaque pendant 20 min à RT.
   8. Lire l’absorption à une longueur d’onde de 630 nm dans un lecteur de plaques à micropuits.
4. Visualisation et analyse des données
   1. Calculer les valeurs moyennes d’absorbance pour les puits de réaction PPase uniquement (signal de contrôle négatif ou signal de fond).
      REMARQUE : En tant que contrôle positif d’un activateur allostérique SAMHD1 et d’un substrat, le dGTP peut être inclus dans la plaque. Dans ce cas, vous pouvez utiliser cette condition pour calculer le facteur Z comme indicateur de la qualité du dosage.
   2. Soustrayez la valeur de fond des puits correspondants dans les réactions SAMHD1/PPase.
   3. Tracez les valeurs d’absorbance corrigées pour chaque analogue nucléotidique avec les conditions tampon, GTP et dGTPαS.

Résultats

Le protocole décrit dans la figure 1 décrit le flux de travail de base pour l’utilisation du test vert de malachite couplé à des enzymes pour sonder l’interaction de petites molécules avec la dNTPase SAMHD1 et peut être adapté de plusieurs façons pour interroger différentes questions biochimiques. Dans les résultats représentatifs discutés dans les paragraphes ci-dessous, nous illustrons des exemples d’utilisation de ce test pour déterminer les propriétés inhibitrices de petites molécules vis-à-vis de SAMHD1 et pour tester si différents analogues nucléotidiques sont des substrats et/ou des activateurs de cette enzyme.

Les résultats présentés à la figure 2 illustrent plusieurs principes fondamentaux de ce test. Le réactif vert de malachite permet la détection colorimétrique du phosphate inorganique par la formation d’un complexe vert de malachite phosphomolybdate, et par conséquent, cette approche peut être appliquée à l’étude des réactions enzymatiques dont le produit est le phosphate. Pour démontrer la sensibilité de cette méthode pour la détection du phosphate inorganique libre, la figure 2A montre les valeurs d’absorbance obtenues avec des concentrations croissantes de Na₃PO₄ après une incubation de 20 min avec le réactif vert de malachite. Alors que le signal atteint la saturation à 0,25 mM Na₃PO₄, la plage de détection linéaire du phosphate est visible de 0,004 à 0,03 mM (Figure 2A, panneau de droite), en accord avec d’autres études qui ont rapporté une plage linéaire de phosphate allant jusqu’à 10-20 μM en utilisant le test vert de malachite³⁸.

SAMHD1 est une dNTPase qui libère du triphosphate inorganique lors de l’hydrolyse d’une molécule de dNTP, et donc afin de générer du phosphate inorganique libre pour la détection par le vert de malachite, une enzyme de couplage est nécessaire. La pyrophosphatase inorganique (PPase) d’E. coli s’est avérée utile à cette fin, à la fois en ce qui concerne SAMHD1 ^7,20, mais aussi d’autres enzymes métabolisant les nucléotides 30,33,35. De plus, SAMHD1 est une dNTPase active lorsqu’elle est homotétramère, ce qui nécessite une activation allostérique par les (d)NTP, en particulier un triphosphate de guanine (GTP ou dGTP) à AS1 et tout dNTP à AS2. Par la suite, le site catalytique devient accessible pour la liaison au substrat et la réaction enzymatique a lieu. Comme le dGTP répond aux exigences de liaison à AS1 et AS2 et qu’il s’agit d’un substrat, l’utilisation de ce nucléotide dans le test d’inhibition simplifie considérablement le flux de travail. La figure 2B illustre l’exigence des différents composants du test pour obtenir une activité SAMHD1 mesurable, indiquée par une augmentation de l’absorbance à 630 nm. Ni SAMHD1 ni PPase seules ne sont capables de générer du phosphate inorganique en présence de dGTP, ce qui est cohérent avec les activités documentées de ces enzymes. Cependant, dans l’état où tous les composants du test sont présents (SAMHD1, PPase et l’activateur/substrat dGTP), nous observons une augmentation du signal. Le facteur Z³⁷ de l’exemple présenté ici (sans enzymes + dGTP comme contrôle négatif et SAMHD1/PPase + dGTP comme contrôle positif) était de 0,74, ce qui indique un test robuste.

L’une des applications potentielles du test d’activité SAMHD1 couplé à des enzymes est l’identification d’inhibiteurs par criblage à haut débit (HTS). Ainsi, dans ce rapport, nous validons la détection de l’inhibition de SAMHD1 dans ce test en utilisant un ensemble diversifié de composés déjà décrits dans la littérature. Seamon et al. ont évalué l’inhibition dose-dépendante des nucléosides canoniques vis-à-vis de SAMHD1 à l’aide d’un test similaire à celui présenté ici, et ont constaté que la désoxyguanosine (dGuo) était le seul nucléoside canonique capable d’inhiber significativement SAMHD1, avec une valeur IC₅₀ de 488 μM²⁰. Un HTS de médicaments approuvés par la FDA réalisé avec le test direct b4NPP a révélé plusieurs résultats qui ont inhibé l’activité de SAMHD1 à des concentrations micromolaires, à partir de laquelle la lomofungine était la molécule qui a le plus puissamment inhibé l’activité de la dNTPase SAMHD1 in vitro, présentant une CI₅₀ de 20,1 μM lorsqu’elle a été déterminée en présence de dGTP comme substrat²¹. De plus, les quatre analogues α β-imido-dNTP ont également été identifiés comme inhibiteurs compétitifs de SAMHD1 à l’aide du capteur MDCC-PBP et de SAMHD1 couplé à l’activité de Ppx, ce qui a montré que les constantes inhibitrices des analogues de dNMPNPP se situaient dans la gamme micromolaire basse / nanomolaire haute ^6,22. Ainsi, pour démontrer que le test d’activité enzymatique SAMHD1 peut être utilisé pour identifier les inhibiteurs de SAMHD1, la dGuo, la lomofungine et la 2'-désoxythymidine-5'-[(α,β)-imido]triphosphate (dTMPNPP), ont été utilisées pour valider la technique. La figure 3A illustre les courbes dose-réponse obtenues pour ces composés, montrant que l’augmentation des concentrations inhibe efficacement l’activité de SAMHD1. Les valeurs moyennes de CI₅₀ obtenues pour ces molécules à partir de trois expériences indépendantes (± écart-type) étaient les suivantes : dGuo = 361,9 ± 72,8 μM, lomofungine 6,78 ± 3,9 μM et dTMPNPP = 2,10 ± 0,9 μM. À titre d’exemple de résultat négatif, l’impact de l’hydroxyurée (HU) sur l’activité de SAMHD1 a également été déterminé. L’HU est un inhibiteur de la ribonucléotide réductase et, bien qu’elle limite l’activité de l’ara-CTPase de SAMHD1 dans divers modèles de LMA, les effets de l’HU sur SAMHD1 se sont avérés indirects et reposent sur la perturbation de la régulation allostérique de SAMHD1¹⁸. La courbe dose-réponse de l’HU est illustrée à la figure 3B, et aucun changement dans l’activité de SAMHD1 n’a été observé avec l’augmentation des doses d’HU, ce qui démontre que l’HU n’inhibe pas l’activité de SAMHD1 in vitro.

Une autre utilisation du test d’activité SAMHD1 couplé à des enzymes est de se demander si les nucléotides et leurs analogues sont des substrats et/ou des activateurs allostériques de cette enzyme, ce qui est illustré à la figure 4. Dans cette expérience, les nucléotides canoniques, ainsi que les métabolites actifs de plusieurs analogues nucléosidiques anticancéreux, tels que la cytarabine (ara-CTP), la clofarabine (Cl-F-ara-ATP) et la gemcitabine (dF-dCTP), ont été testés comme substrats et activateurs de SAMHD1. En raison de la régulation allostérique complexe de SAMHD1, la réaction est réalisée en présence de GTP en tant qu’activateur de l’AS1 ou de l’analogue non hydrolysable du dGTP 2'-désoxyguanosine-5'-(α-thio)-triphosphate (dGTPαS), qui peut occuper AS1 et AS2. L’activité de SAMHD1 en présence de l’analogue nucléotidique testé et du GTP indique que le nucléotide est capable de se lier au site allostérique secondaire et au site catalytique (c’est-à-dire l’activateur AS2 et le substrat), tandis que l’activité de SAMHD1 avec l’analogue nucléotidique et dGTPαS indique que le nucléotide ne peut occuper que le site catalytique (c’est-à-dire qu’il ne peut occuper qu’un substrat). Si le nucléotide est capable de se lier à la fois aux sites allostériques AS1 et AS2 et au site catalytique, SAMHD1 sera actif en présence du nucléotide seul, comme le montre le cas du dGTP. Les résultats montrent que tous les dNTP canoniques sont capables de se lier au site AS2 et au site catalytique. Dans le cas des analogues nucléotidiques, la clofarabine triphosphate est un activateur de l’AS2 et un substrat, tandis que la cytarabine triphosphate ne peut occuper que le site catalytique. D’autre part, aucune activité n’a été observée avec la gemcitabine triphosphate, ce qui suggère que dans les conditions testées, la gemcitabine triphosphate n’est pas capable d’agir comme effecteur allostérique ni comme substrat. Bien que ce résultat soit cohérent avec les prédictions précédentes⁹, des études ultérieures de cristallisation et de cinétique¹⁰ ont révélé que la gemcitabine triphosphate est capable de se lier à la poche catalytique de SAMHD1, et qu’il s’agit bien d’un substrat de l’enzyme. Cependant, dans cette dernière étude¹⁰, les auteurs montrent que le taux d’hydrolyse est considérablement inférieur à celui d’autres substrats rapportés, tels que la cytarabine triphosphate, ce qui explique pourquoi nous n’avons pas pu l’observer avec ce dispositif de criblage.

Dans l’ensemble, ces résultats représentatifs valident l’utilisation du test d’activité SAMHD1 couplé à des enzymes en tant que technique robuste pour l’identification et la caractérisation des inhibiteurs de SAMHD1, des régulateurs allostériques et des substrats. Cependant, comme toutes les approches expérimentales, cette méthode a ses inconvénients, et donc des tests orthogonaux (par exemple, en utilisant une technologie de test différente) doivent être utilisés pour valider davantage les résultats.

Figure 1 : Vue d’ensemble schématique du protocole décrit dans cet article. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 2 : Dosage de l’activité SAMHD1 couplée à des enzymes. (A) Courbe standard Na₃PO₄ dans le dosage vert de malachite. La dilution en série Na₃PO₄ (2 fois) a été préparée de 1 mM à 0,004 mM en trois exemplaires et incubée avec un réactif vert de malachite pendant 20 min. Les valeurs brutes d’absorbance sur l’ensemble de la gamme des concentrations testées sont indiquées dans le panneau de gauche et la plage linéaire dans le panneau de droite. Représentatif de deux expériences indépendantes présentées. (B) Validation de l’essai d’activité enzymatique. SAMHD1 (0,35 μM) et/ou PPase (12,5 U/mL) en présence ou en absence dGTP activateur/substrat (25 μM) ont été incubés pendant 20 min dans le test d’activité enzymatique. Les quadruplés d’un représentant de deux expériences indépendantes montrées avec des valeurs d’absorbance brutes tracées, des barres et des barres d’erreur indiquent la moyenne et l’écart-type. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 3 : Évaluation des composés pour l’inhibition de SAMHD1 dans le test d’activité enzymatique. Dose-réponse de la lomofungine (0,78-100 μM), de la 2'-désoxythymidine-5'-[(α,β)-imido]triphosphate (dTMPNPP, 0,01-100 μM) et de la désoxyguanosine (dGuo, 10-1 500 μM) (A) ou de l’hydroxyurée (HU) (0,78-100 μM) (B) dans le test d’activité SAMHD1 couplé à des enzymes avec dGTP (25 μM) comme activateur/substrat. Pourcentage d’activité par rapport aux témoins réactionnels à partir de répétitions individuelles tracées (DMSO + SAMHD1/PPase + dGTP = 100 % d’activité, DMSO + dGTP = 0 % d’activité) avec un représentant de trois expériences présentées. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 4 : Évaluation des analogues nucléotidiques en tant qu’activateurs allostériques et substrats de SAMHD1 dans le test d’activité enzymatique. Les nucléotides canoniques et certains métabolites triphosphatés des médicaments anticancéreux cytarabine (ara-CTP), clofarabine (Cl-F-ara-ATP) et gemcitabine (dF-dCTP) ont été testés à 200 μM dans le test d’activité SAMHD1 couplé à l’enzyme en présence ou en absence de GTP ou dGTPαS analogue dGTP non hydrolysable (12,5 μM). Les valeurs d’absorbance normalisées des répétitions expérimentales individuelles tracées, de la moyenne et de l’écart-type sont indiquées. Représentatif de deux expériences indépendantes présentées, adaptées de notre étude précédente⁷. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Pas	Réactif	Volume distribué (μL)	Volume de réaction final (μL)	Concentration dispensée	Dilution de pli en réaction	Concentration finale en réaction
1	Inhibiteur	5	20	0,4 mM	4	0,1 mM
2	Mélange SAMHD1+PPase	5		1,4 μM SAMHD1, 50 U/mL PPase	4	0,35 μM SAMHD1, 12,5 U/mL Ppase
3	dGTP	10		50 μM	2	25 μM
4	Incubation pendant 20 minutes
5	La solution EDTA	20	40	7,9 millimètres	2	3,95 millimètres
6	Réactif MG	10	50	2,5 mM Vert malachite, 64,4 mM Molybdate d’ammonium, 0,18 % Tween-20	5	0,5 mM vert malachite, 12,9 mM Molybdate d’ammonium, 0,036 % Tween-20
7	Incubation pendant 20 minutes
8	Lire @ 630 nm

Tableau 1 : Résumé des conditions finales du test enzymatique pour le criblage des inhibiteurs.

Pas	Réactif	Volume distribué (μL)	Volume de réaction final (μL)	Concentration dispensée	Dilution de pli en réaction	Concentration finale en réaction
1	Régulateur allostérique	5	20	800 μM	4	200 μM
2	GTP ou dGTPαS	5		50 μM	4	12,5 μM
3	SAMHD1 et/ou PPase	10		0,7 μM SAMHD1, 25 U/mL PPase	2	0,35 μM SAMHD1, 12,5 U/mL PPase
4	Incubation pendant 20 minutes
5	La solution EDTA	20	40	7,9 millimètres	2	3,95 millimètres
6	Réactif MG	10	50	2,5 mM Vert malachite, 64,4 mM Molybdate d’ammonium, 0,18 % Tween-20	5	0,5 mM vert malachite, 12,9 mM Molybdate d’ammonium, 0,036 % Tween-20
7	Incubation pendant 20 minutes
8	Lire @ 630 nm

Tableau 2 : Résumé des conditions finales de l’essai enzymatique couplé pour le criblage des régulateurs allostériques

Discussion

Le test d’activité enzymatique détaillé ici est un test colorimétrique à haut débit permettant la mesure indirecte de l’hydrolyse du dNTP par SAMHD1. Cette méthode exploite la capacité de la PPase inorganique d’E. coli, qui, lorsqu’elle est incluse en excès dans le mélange réactionnel, convertit chaque triphosphate inorganique généré par SAMHD1 en trois phosphates libres individuels qui peuvent être quantifiés à l’aide du réactif vert de malachite simple et économique. Nous fournissons ce test dans un format de plaque de 384 micropuits, ce qui est idéal pour le criblage de banques de composés, et démontrons l’applicabilité et la polyvalence de cette technique dans l’identification et la caractérisation des inhibiteurs, des activateurs et des substrats de SAMHD1.

Comme pour tous les essais de criblage biochimique in vitro , il y a un certain nombre d’étapes critiques et de considérations importantes, et beaucoup d’entre elles sont discutées en profondeur dans le Manuel d’orientation des tests³⁹ disponible gratuitement. L’intégrité des enzymes recombinantes purifiées, à la fois SAMHD1 et l’enzyme couplée PPase inorganique, est extrêmement importante et doit être confirmée avant d’établir le test. Par conséquent, chaque nouvelle purification de ces enzymes devrait être soumise à un certain niveau de test par lot, car les variabilités d’un lot à l’autre pourraient introduire des incohérences dans les résultats. Idéalement, l’utilisation d’un test direct orthogonal, tel que la CLHP, qui permet de détecter à la fois le substrat et le produit de réaction, devrait être utilisée pour vérifier l’activité triphosphohydrolase dNTP du SAMHD1 recombinant purifié utilisé.

En ce qui concerne les limites de ce test, le principe est qu’il mesure l’activité dNTPase de SAMHD1 de manière indirecte, en exploitant l’activité de la PPase inorganique, ce qui a un certain nombre d’implications. Il est important de confirmer que la PPase possède peu ou pas d’activité vis-à-vis des nucléotides utilisés dans le test, et de même, que les petites molécules inhibitrices identifiées n’ont aucune activité vis-à-vis de la PPase. Ainsi, en ce qui concerne le dépistage, un contre-criblage contre la PPase peut être une considération importante. La présence de PPase dans la réaction rend également essentiel l’utilisation d’un test orthogonal pour confirmer les résultats. En ce qui concerne les dosages d’activité directe, un certain nombre d’entre eux ont été rapportés à ce jour, notamment TLC ^9,20,23 et HPLC ^9,21, qui détectent avec précision l’épuisement du substrat et la formation de produit. De plus, le test b4NPP²¹, qui est également à haut débit, pourrait être utilisé pour tester des inhibiteurs potentiels ; Cependant, il n’est pas idéal pour tester des substrats ou des activateurs allostériques. Les tests biophysiques, tels que la fluorimétrie différentielle à balayage (DSF), que nous avons déjà rapportés avec SAMHD1¹⁸, peuvent également être particulièrement puissants pour identifier et caractériser les ligands. Une autre limitation du test, en particulier comme indiqué dans la configuration ici pour l’identification des substrats et des activateurs, est l’utilisation de l’analogue dGTP non hydrolysable dGTPαS comme activateur AS1 et AS2. Bien que cela permette l’activation de SAMHD1 sans activité observable dans le test, dGTPαS est un inhibiteur compétitif de SAMHD1, et donc l’utilisation de concentrations élevées inactivera l’enzyme. Au fur et à mesure que notre compréhension de SAMHD1 progresse, de futures études pourraient utiliser des molécules qui occupent exclusivement chaque site de SAMHD1, annulant ainsi ce problème potentiel.

Comme nous l’avons montré ici, cette méthode est polyvalente et peut être utilisée pour répondre à un certain nombre de questions biochimiques. Nous avons décrit deux variantes de ce test, l’une pour l’identification des régulateurs allostériques et des substrats de SAMHD1, et l’autre pour la caractérisation des inhibiteurs, mais d’autres adaptations peuvent être apportées. En ce qui concerne les inhibiteurs potentiels, ce test, étant basé sur des plaques de micropuits, le rend bien adapté aux études du mécanisme d’action en aval^39,40. De même, pour une caractérisation plus poussée des substrats et des régulateurs allostériques, cette technique peut être utilisée pour déterminer les paramètres cinétiques de la catalyse, comme nous l’avons fait pour le métabolite actif de la cytarabine et de la clofarabine⁷. Cependant, un inconvénient est que le test enzymatique rapporté ici est un test d’évaluation, et donc, bien que bien adapté au criblage, un test continu serait mieux adapté à certaines études mécanistiques. Arnold et al. ont rapporté un test continu couplé à des enzymes qui utilise le biocapteur MDCC-PBP⁶, qui repose sur l’utilisation de la protéine de liaison au phosphate périplasmique (PBP) marquée avec le fluorophore de maléimide de coumarine (MDCC) qui peut se lier à un groupe phosphate libre. Le MDCC-PBP est très sensible et permet de quantifier de très faibles concentrations de phosphate, le temps de réponse du capteur étant de l’ordre de la milliseconde à la seconde.

SAMHD1 joue un certain nombre de fonctions importantes dans la santé humaine et les maladies² , dont beaucoup pourraient être liées à son rôle central dans le maintien des niveaux intracellulaires de dNTP¹. Ainsi, l’identification d’une sonde chimique de haute qualité vers l’activité dNTPase de SAMHD1 serait un outil puissant pour définir ces liens, et le test enzymatique rapporté ici pourrait être facilement utilisé pour identifier de telles sondes. De plus, comme les médicaments à base de nucléosides, dont beaucoup sont modulés par SAMHD1, constituent un groupe diversifié et important de⁴¹ thérapeutiques ; Les sondes chimiques pourraient être développées en médicaments pour cibler SAMHD1 en milieu clinique, dans le but d’améliorer l’efficacité de ces thérapies. Il est également essentiel de comprendre toute l’étendue de l’interaction de ces composés à base de nucléosides avec SAMHD1, une question qui peut également être résolue à l’aide de ce test couplé aux enzymes. Dans l’ensemble, le test d’activité SAMHD1 couplé aux enzymes, tel que rapporté ici, est un test à faible coût, polyvalent et à haut débit qui peut être utilisé pour approfondir notre compréhension de cette enzyme importante.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
2'-désoxyadénosine-5'-triphosphate (dATP)	Jena bioscience	NU-1001	Composé testé dans le dosage de l’activateur/substrat SAMHD1
2'-désoxycytidine-5'-triphosphate (dCTP)	Jena bioscience	NU-1002	Composé testé dans le dosage de l’activateur/substrat SAMHD1
2'-Déoxyguanosine-5'-(&alpha ;-thio)-triphosphate (dGTP&alpha ; S)	Jena bioscience	NU-424	Analogue dGTP non hydrolysable pour l’activateur/substrat de SAMHD1 2
'-désoxyguanosine-5'-triphosphate (dGTP)	GE Healthcare	27-1870-04	Activateur allostérique SAMHD1 et substrat utilisés dans le dosage d’inhibition et le dosage de l’activateur/substrat
2'-Deoxythymidine-5'-[(&alpha ;,&beta ;)-imido]triphosphate (dTMPNPP)	Jena bioscience	NU-907-1	Composé testé dans le test d’inhibition SAMHD1
2'-désoxythymidine-5'-triphosphate (dTTP)	Jena bioscience	NU-1004	Composé testé dans le test d’activateur/substrat SAMHD1
2'Deoxyguanosine mohohydrate (dGuo)	Sigma-Aldrich	D0901	Composé testé dans le test d’inhibition SAMHD1
384 bien clair à fond plat  ; microplaque	Thermo Fisher Scientific	262160	Plaque d’essai
96 polypropylène transparent à fond en U  ; microplaque	Thermo Fisher Scientific	267245	Plaque de dilution composée
Heptamolybdate d’ammonium tétrahydraté	Sigma-Aldrich	A1343	Réactif nécessaire pour le réactif de travail vert de malachite
ara-Cytidine-5'-triphosphate (ara-CTP)	Jena bioscience	NU-1170	Composé testé dans le dosage de l’activateur/substrat SAMHD1
Clofarabine-5'-triphosphate (Cl-F-ara-ATP)	Jena bioscience	NU-874	Composé testé dans le dosage de l’activateur/substrat SAMHD1
Diméthyl sulfoxyde (DMSO)	VWR	23486.297	Solvant
Acide éthylènediaminetétraacétique sel disodique dihydraté (EDTA)	Sigma-Aldrich	E5134	EDTA stop composant de la solution
Gemcitabine-5'-triphosphate (dF-dCTP)	Jena bioscience	NU-1607	Composé testé dans le cadre d’un test d’activateur/substrat SAMHD1
GraphPad Prism	Logiciel GraphPad	Prism 8	Analyse et visualisation de données
Hydrate de sel de sodium de guanosine 5&prime ;-triphosphate (GTP) Sigma-Aldrich		G8877	Activateur allostérique pour le dosage de l’activateur/substrat SAMHD1
E. coli inorganique pyrophosphatase étiqueté à son numéro  ; (PPase)	Générée en interne à l’aide de Protein Science Facility,		protéine PPase recombinante du Karolinska Institutet, hydrolyse le triphosphate inorganique et le pyrophosphate en orthophosphate afin qu’ils puissent former un complexe avec le SAMHD1 humain marqué au vert malachite
His-marqué SAMHD1	Générée en interne à l’aide de Protein Science Facility,		protéine SAMHD1 recombinante du Karolinska Institutet, hydrolise les dNTP dans son nucléoside correspondant et le triphosphate
inorganiqueComposé d’hydroxyurée	Sigma-Aldrich	H8627	testé dans le test d’inhibition SAMHD1
Lomofungin	National Cancer Institute (NCI)/Division du traitement et du diagnostic du cancer (DCTD)/Programme de thérapeutique développementale (DTP)	NSC106995	Composé testé dans le test d’inhibition SAMHD1
Chlorure de magnésium hexahydraté (MgCl2)	Sigma-Aldrich	M2670	composant
Vert de malachite Chlorhydrate de carbinol	Sigma-Aldrich	213020	Composant de stock vert de malachite
Lecteur de microplaques	Hidex	Hidex Senselecteur de microplaques	Acquisition de données, lecture par absorption à une longueur d’onde de 630 nm
Chlorure de sodium (NaCl)	Sigma-Aldrich	31434	Composant du tampon de réaction SAMHD1
Hydroxyde de sodium (NaOH)	Sigma-Aldrich	567530	Composant du tampon de réaction SAMHD1
Phosphate de sodium (Na3PO4)	Sigma-Aldrich	342483	Requis pour la courbe standard du phosphate
Acide sulfurique 95-97 %	Sigma-Aldrich	84720	Composant de stock vert de malachite
Sel de tris-acétate	Sigma-Aldrich	T1258	Composant de tampon de réaction SAMHD1
Chlorhydrate de tris(2-carboxyéthyl)phosphine (TCEP)	Sigma-Aldrich	C4706	Composant tampon de réaction SAMHD1
Tween-20	Sigma-Aldrich	P1379	SAMHD1 et composant de réactif de travail vert de malachite