Fabrication simple de colonnes capillaires ultra-haute performance en interne avec l’approche FlashPack

Résumé

Nous présentons ici un protocole pour la procédure d’emballage optimisée des colonnes capillaires FlashPack. L’application d’un protocole optimisé à une configuration commune de bombe sous pression de 100 bars permet un emballage et une fabrication 10 fois plus rapides de longues colonnes capillaires ultra-haute performance.

Résumé

La chromatographie liquide capillaire à ultra-haute performance (UHPLC) est actuellement une méthode de choix pour l’étape de séparation des échantillons dans la protéomique à base de LC-MS. Cependant, les colonnes capillaires sont beaucoup moins robustes par rapport à leurs contre-types de débit plus élevés. En raison de la facilité de contamination et de blocage, ils doivent souvent être remplacés. Cela en fait une partie nettement coûteuse du coût total de l’analyse LC-MS. L’emballage interne des colonnes capillaires UHPLC permet d’économiser beaucoup d’argent et de personnaliser. Cependant, la procédure d’emballage standard dans la bombe sous pression de 100 bars ne fonctionne bien que pour les colonnes HPLC, mais est trop lente pour les sorbants UHPLC. Nous fournissons ici une description d’un protocole FlashPack optimisé appliqué à la même configuration de bombe sous pression de 100 bars. La méthode est basée sur l’emballage à partir de boue à concentration de sorbant ultra-élevée et est développée pour la fabrication en interne de colonnes capillaires UHPLC de longueur illimitée dans un délai raisonnable.

Introduction

La protéomique moderne est basée sur la spectrométrie de masse couplée à la chromatographie liquide avec la chromatographie nano-flux ultra-haute performance (diamètre interne de la colonne (ID) de 50 à 150 μm) offrant la meilleure vitesse d’analyse et la meilleure sensibilité¹. Bien que de nombreuses colonnes capillaires UHPLC commerciales soient disponibles, leur prix représente une part importante du coût des consommables, en particulier lorsque plusieurs projets divers sont exécutés en laboratoire et que la contamination des colonnes spécifiques au projet est un problème fréquent. En outre, l’emballage des colonnes en interne permet l’utilisation de sorbants personnalisés spécifiques à l’expérience (tels que, par exemple, le sorbant polyCAT-A²) et de caractéristiques de colonne non disponibles à l’achat en tant que colonne prête à l’emploi.

Pour faire face à cela, de nombreux laboratoires emballent des colonnes capillaires en interne. Cependant, la procédure d’emballage courante avec une bombe à pression de 100 bars (cellule d’injection de pression)³ est mal adaptée à l’emballage de colonne UHPLC en raison de la contre-pression élevée des sorbants UHPLC inférieurs à 2 μm, ce qui entraîne une réduction spectaculaire du taux d’emballage par rapport aux sorbants HPLC de plus grande taille. Alors que les colonnes UHPLC courtes peuvent encore être emballées très lentement, la fabrication de longues colonnes UHPLC est physiquement impossible⁴.

L’emballage standard de la colonne capillaire se fait à des pressions relativement basses, jusqu’à 100 bars, et avec une très faible concentration de boue absorbante. Par conséquent, deux directions possibles pour accélérer le processus sont disponibles. Il est possible d’augmenter la pression d’emballage⁵. Cependant, cela nécessite un équipement spécial et, pratiquement, l’installation d’une nouvelle méthode en laboratoire. Une autre façon est d’augmenter la concentration de boue sorbante⁶. L’emballage à haute concentration de boue sorbante est décrit en combinaison avec une pression d’emballage ultra-élevée dans une publication précédente⁷. Cependant, à une pression de 100 bars, qui est utilisée dans la plupart des bombes d’emballage existantes, une concentration plus élevée de sorbant entraîne soit un ralentissement du taux d’emballage, soit un arrêt pur et simple de l’emballage. Il a été récemment démontré que l’effet était dû à un regroupement de sorbants à l’entrée de la colonne, et une simple astuce de déstabilisation de la coupole sorbante en martelant l’entrée de la colonne avec une barre magnétique à l’intérieur d’un flacon de sorbant a été suggérée⁴. La méthode résultante, nommée FlashPack, utilise la même configuration d’emballage de bombe sous pression de 100 bars. Dans le même temps, des modifications mineures mais critiques dans la procédure d’emballage permettent l’emballage à partir d’une concentration de boue sorbante très élevée et la production de très longues colonnes UHPLC (50 à 70 cm et plus) en moins d’une heure, tandis qu’une colonne courte peut être produite en quelques minutes avec une qualité de séparation égale aux colonnes commerciales des mêmes paramètres⁴. L’approche FlashPack a déjà été utilisée avec succès dans de multiples projets de protéomique pour la préparation des colonnes capillaires en phase inverse (RP)^{8,9,10,11,12 , 13,14} et en interaction hydrophile (HILIC)^2.

Nous décrivons ici en détail les modifications nécessaires à l’adaptation de l’approche FlashPack à la procédure standard d’emballage de bombes sous pression de 100 bars.

Protocole

Le protocole d’emballage comprend cinq étapes(Figure 1): 1) Préparation de la station d’emballage, 2) préparation capillaire, 3) préparation de la boue absorbante, 4) emballage capillaire dans la bombe sous pression et 5) emballage de colonne dans le système HPLC, jusqu’à la taille et l’installation de connexion UHPLC. L’optimisation de FlashPack nécessite des ajustements dans les sections 3 et 4 par rapport au protocole commun.

1. Assemblage de la station d’emballage

1. Préparez un réservoir de gaz rempli d’azote, d’hélium ou d’argon équipé d’un régulateur de gaz à un étage dont la pression de sortie > 50 bars. La pression maximale est limitée par la compatibilité de la bombe sous pression.
2. Connectez le régulateur à la vanne d’aération de la bombe sous pression.
3. Si la bombe sous pression n’est pas équipée d’un agitateur magnétique intégré, placez la bombe sur un agitateur magnétique.
4. Connectez un tube en plastique ID étroit (par exemple, 0,13 mm) à la sortie d’évent de la bombe sous pression et placez-le dans un récipient avec de l’eau.

2. Préparation capillaire

1. Préparer un capillaire fritté avec une fritte de verre intégrée formée de Kasil et de formamide¹⁵ ou un capillaire émetteur tiré préparé par un arracheur laser¹⁶. Le capillaire est fait 10-15 cm plus long que la longueur de colonne prévue.
   REMARQUE : Voir le tableau 1 pour la discussion des problèmes possibles associés aux différentes tailles capillaires et types de frites. Le tableau 2 contient un exemple de programme d’attraction laser P2000 pour la fabrication de capillaires à émetteur tiré.
2. Protégez une extrémité d’émetteur tirée avec une pointe de pipette à chargement de gel coupé.
   1. Coupez la pointe de manière à ce qu’elle s’adapte bien autour du capillaire OD de 360 μm (elle peut être déplacée le long du capillaire, mais nécessite un certain effort pour le faire).
   2. Faites glisser la pointe de la pipette coupée sur le capillaire à partir de la direction de l’extrémité avant capillaire et déplacez-la jusqu’à l’extrémité de l’émetteur.
   3. Faites glisser vers l’arrière l’embout de protection lorsque la colonne pulvérise. Faites glisser la pointe vers l’avant pour que l’émetteur se termine à l’intérieur de la pointe lorsque la colonne ne pulvérise pas (même lorsque la colonne est sous le flux, mais ne pulvérise toujours pas).

3. Préparation de boue sorbante

1. Préparer un flacon de sorbant : Placer environ 50 mg de sorbant sec dans un tube de centrifugeuse de 1,5 mL. Ici, Reprosil Pur C18 est utilisé comme exemple.
2. Ajouter 1 mL de méthanol dans le tube absorbant.
3. Pour le mélanger complètement, vortex le tube pendant 10 s à l’aide d’un mélangeur vortex.
4. Sonicate dans un bain de sonication pendant 10 s.
5. Laissez le sorbant bien trempé pendant 20-30 min. Ensuite, vortexez-le et soniquez-le une fois de plus.
6. Préparez un flacon de sorbant fonctionnel. Utilisez un flacon à fond conique qui s’insère dans la bombe.
   REMARQUE: Il peut s’agir d’un autre tube de centrifugeuse de 1,5 mL ou de tout autre flacon en fonction de la conception de la bombe sous pression particulière. Pour cette expérience, un tube de bouchon à vis de fond conique coupé à la hauteur de la bombe sous pression est utilisé.
7. Resuspendez le sorbant dans le flacon de sorbant de stock et transférez 500 μL dans le flacon de sorbant de travail avec une barre magnétique de 2 x 3 mm de taille.
8. Ajouter le méthanol jusqu’à ~1 mL au flacon de travail.
9. Laissez le flacon de travail reposer sur la table pendant 10 minutes pour que le sorbant se dépose par gravité.
10. Si, après décantation, la couche de sorbant est inférieure à 4 mm, ajoutez plus de boue de sorbant de stock et attendez que le sorbant se dépose pendant encore 10 minutes.
    REMARQUE: Le flacon de travail préparé est destiné à la préparation de plusieurs colonnes sur des mois. Si le flacon absorbant de travail reste sans agitation pendant plus de 2 h, il doit être tourbillonné pendant 10 s, sonique pendant 10 s et réglé par gravité. Régulièrement, le sorbant est réinsisté le matin avant l’emballage. Ensuite, il est bon d’emballer toute la journée s’il n’y a pas de longues pauses entre l’emballage séquentiel de la colonne. Si le sorbant dans le flacon de travail se dessèche, ajoutez du méthanol et exécutez la procédure de préparation complète du sorbant comme pour le flacon de sorbant de base (étapes 3.2-3.5).

4. Emballage capillaire dans une bombe sous pression

ATTENTION : Portez toujours des lunettes de protection lorsque vous travaillez avec la bombe à pression. Ne portez pas de gants. Ceux-ci réduisent considérablement le sens du toucher requis pour une manipulation correcte des capillaires de petit diamètre et conduisent à des erreurs.

1. Placez le flacon absorbant dans la bombe sous pression et fixez bien tous les écrous.
2. Démarrez la rotation à 60-100 tr/min.
3. Insérez le capillaire émetteur fritté ou tiré dans la bombe: poussez-le tout en bas du flacon, puis soulevez-le de 2 à 3 mm et fixez l’écrou.
   REMARQUE: Appliquez une force minimale requise pour fixer le capillaire afin d’éviter les dommages capillaires et ferruleux. Le meilleur est le serrage à la main. Si une clé hexagonale est utilisée, appliquez un minimum d’effort suffisant pour le serrage.
4. Vérifiez si le capillaire est correctement fixé - il doit être impossible de déplacer le capillaire en le tirant à la main.
5. Ouvrez très lentement la soupape de la bombe sous pression tout en gardant l’extrémité ouverte du capillaire pointée loin de votre visage.
6. Regardez les premières étapes du processus d’emballage.
   REMARQUE: Immédiatement après la pressurisation, le sorbant remplit le capillaire et il devient non transparent sur toute la longueur. Dès que le sorbant commence à s’emballer à l’intérieur de l’extrémité distale, la contre-pression augmente, le débit ralentit et la boue de sorbant uniforme à l’intérieur du capillaire se reforme en plusieurs paquets de sorbant séparés par des espaces sans sorbant. Le sorbant déjà emballé est visible comme une région densément colorée en croissance continue.
7. Gardez les régions remplies de sorbant à au moins 70% de la longueur capillaire avec de petits espaces libres de sorbant pendant toute la durée du processus d’emballage.
8. Il y a plusieurs problèmes courants à surveiller pendant le processus d’emballage, qui nécessitent un ajustement de la configuration en vol pour maintenir une livraison efficace du sorbant dans le capillaire.
   REMARQUE: Plus de détails sur l’ajustement de l’efficacité de livraison du sorbant sont décrits dans le tableau 3.
   1. Problème 1: Lorsque le nouveau sorbant cesse d’entrer dans le capillaire alors que le sorbant déjà à l’intérieur continue de bouger, suivez les étapes ci-dessous.
      REMARQUE: Il s’agit du problème le plus fréquent. Dans la plupart des cas, l’entrée capillaire est bloquée par des amas de sorbants auto-agrégeants. Appliquez les étapes suivantes une par une jusqu’à ce que le flux de sorbant soit rétabli, puis ignorez le reste des étapes liées au problème.
      1. Augmentez la vitesse de rotation à 500 tr/min et réduisez-la immédiatement à 60-100 tr/min. Habituellement, il restaure le flux de sorbant. Vérifiez que la vitesse de rotation est d’au moins 60 tr/min pour le reste du processus d’emballage.
      2. Si cela ne vous aide pas, évasez brièvement la bombe d’emballage et pressurisez-la immédiatement.
      3. Si cela n’aide pas ou si le blocage se reproduit, repositionnez le capillaire à l’intérieur de la couche de sorbant. L’absence du sorbant peut être due au fait que l’extrémité ouverte capillaire est soit trop haute au-dessus de la barre magnétique, de sorte que l’extrémité de la colonne ne la touche pas, soit au fait que le capillaire adhère au fond du flacon. Tout d’abord, évaz complètement la bombe, desserrez l’écrou, poussez le capillaire vers le bas, puis tirez-le de 2 mm en arrière. Fixez l’écrou.
      4. Si le blocage persiste, évaz le système, retirez le flacon absorbant et le vortex et soniquez-le une fois de plus. Vérifiez que l’extrémité frontale capillaire n’est pas endommagée au microscope et coupez ~ 5 mm de l’extrémité avant si nécessaire.
   2. Problème 2: Lorsque le sorbant ne remplit qu’une petite partie du capillaire avec de longues régions vides, suivez les étapes ci-dessous.
      1. Vérifiez la vitesse de rotation. Si la rotation est trop lente, la rupture de la coupole n’est pas assez efficace. Augmentez la vitesse de rotation à ~150 tr/min.
      2. Si la rotation est trop rapide, le sorbant est remis en service dans le plus grand volume du flacon et la concentration locale de sorbant autour de l’entrée de la colonne est faible. Ralentissez la vitesse de rotation jusqu’à 60-100 tr / min.
      3. Vérifiez le niveau de sorbant. Le même problème avec peu de sorbant à l’intérieur du capillaire est observé lorsqu’il n’y a pas assez de sorbant dans le flacon. Lorsque le sorbant est épuisé, remplissez le flacon avec le nouveau sorbant pour maintenir la couche de sorbant d’au moins 4 mm de haut après la décantation induite par la gravité.
9. Continuez à emballer la colonne jusqu’à ce que la longueur de colonne cible plus 5-7 cm soit atteinte.
10. Arrêtez la rotation et dépressurisez très lentement la bombe.
    1. Ouvrez un peu la valve de la bombe et attendez que la bulle éclate à l’intérieur de la bouteille d’eau pour s’apaiser. Ensuite, ouvrez la vanne un peu plus large et attendez à nouveau que la bulle éclate pour ralentir.
    2. Relâchez la pression par incréments jusqu’à ce qu’aucun gaz ne sorte de la vanne.
       REMARQUE: N’ouvrez pas la valve tout à la fois - cela entraînera un bouillonnement à l’intérieur du capillaire et le sorbant retournera dans le flacon. Si cela se produit, pressurisez la bombe en arrière et attendez que la colonne soit à nouveau emballée.
11. Lorsque le gaz cesse de sortir de la vanne d’aération, retirez le capillaire emballé de la bombe sous pression.
    REMARQUE: Ne laissez pas la colonne sécher. S’il n’est pas immédiatement connecté au système HPLC pour un emballage ultérieur, stockez le capillaire emballé en le submergeant dans son ensemble dans une solution EtOH à 10%. Un récipient de stockage d’aliments en polypropylène étanche aux liquides peut être utilisé pour le stockage capillaire. Les colonnes HPLC déconnectées sont stockées de la même manière.
12. Si aucun autre emballage n’est prévu, retirez le flacon de sorbant de la bombe et fermez-le hermétiquement. Conservez-le pour un emballage ultérieur de la colonne.

5. Emballage dans la colonne HPLC

1. Connectez le capillaire emballé au système HPLC via une connexion HPLC.
2. Démarrer le débit à 95% de solvant B (80 ou 100% acétonitrile, 0,1% d’acide formique (AF)) en ciblant une pression de 250-300 bars. Pour les capillaires emballés de 40 cm, utilisez le débit de 200-300 nL / min.
   REMARQUE: Le débit d’emballage est de 200 nL / min pour une colonne de 40 à 50 cm avec un ID de 100 μm emballé avec un sorbant de 2 μm. D’autres tailles de colonne sont répertoriées dans le tableau 4. Les débits pour les autres longueurs de colonne et les autres indices sont estimés à partir de la proportionnalité directe entre la contre-pression et la longueur et la section transversale de la colonne. Le débit exact est ajusté à la longueur réelle emballée, qui est par défaut plus longue que la longueur de colonne ciblée. Notez également que la pression de 300 bars cible la limite de pression physique de la connexion HPLC. Pour les raccords à pression plus élevée, des débits plus élevés jusqu’à la limite de pression de raccordement doivent être utilisés pour un emballage plus rapide.
3. Surveillez le sorbant lâche à l’intérieur du capillaire qui s’emballe et s’ajoute à la longueur totale emballée.
4. Sans arrêter l’écoulement, trempez le corps de la colonne deux fois dans le bain de sonication.
   REMARQUE: Ne pas immerger les extrémités de colonne et les connexions capillaires - seulement une partie du corps de la colonne. L’étape de sonication permet d’améliorer la reproductibilité des colonnes, en particulier pour les colonnes extrêmement longues >50 cm de long (données non publiées); cependant, il ajoute une chance aléatoire de casser la fritte sorbante auto-assemblée à l’intérieur de l’extrémité émettrice du capillaire émetteur tiré et de bloquer complètement la colonne. Bien que la sonication puisse être universellement appliquée à toutes les colonnes frites de verre, nous suggérons de soniquer les colonnes émettrices tirées uniquement pour la longueur > colonne de 50 cm.
5. Lorsque le lit absorbant cesse de rétrécir, plongez le corps de la colonne dans le bain de sonication deux fois plus sans arrêter le flux.
6. Exécutez la colonne pendant 10 minutes supplémentaires à 300 barres.
7. Arrêtez le débit, attendez que la pression descende en dessous de trois bars et déconnectez la colonne.
8. Inspectez visuellement la colonne pour l’absence de trous et de décolorations. S’il y en a, la sonication sous l’écoulement peut être répétée. Pour les expériences critiques, envisagez de créer une nouvelle colonne.
9. Coupez la colonne à la longueur souhaitée.
   REMARQUE: Une coupe correctement effectuée est une condition préalable à l’efficacité de la colonne. Faites une encoche dans le revêtement en polyimide avec le scribe, fissurez partiellement le capillaire et séparez deux morceaux.
10. Polir l’extrémité avant de la colonne sur une plaquette en céramique ou avec un film de rodage.
11. Reconnectez la colonne au système LC à l’aide d’une connexion UHPLC.
12. Démarrez le débit de travail à 2% B en fonction de l’ID de colonne selon le tableau 4. Attendez que la pression s’équilibre et vérifiez la contre-pression de la colonne.
    REMARQUE: Le débit de travail est ajusté en fonction des paramètres de la colonne. Par exemple, une colonne ID de 100 μm de 30 cm de long est exécutée à 500 nL/min.
13. Assurez-vous que la contre-pression est à moins de 5% de la valeur attendue (voir tableau 5), Cela confirme que la colonne est correctement emballée et prête à l’emploi.
    REMARQUE: La contre-pression de colonne est la pression totale dans le canal de gradient du système HPLC avec la colonne connectée moins la contre-pression des capillaires avant la colonne. Dans le même temps, les valeurs du tableau 5 sont arbitraires (elles donnent une échelle arbitraire de ce à quoi s’attendre). La similitude intra-laboratoire de la contre-pression d’une colonne à l’autre est un indicateur plus important que tout fonctionne correctement. La contre-pression absolue réelle dépend de nombreux paramètres, tels que la taille et les caractéristiques du sorbant, l’ID capillaire, le fabricant et le lot, la forme de l’extrémité de l’émetteur tiré ou la densité et la longueur de la fritte de verre, les caractéristiques du solvant et la température ambiante dans la pièce, etc. Si la contre-pression est trop élevée, voir le tableau 1 pour les problèmes possibles.

Résultats

L’approche FlashPack est basée sur la configuration d’emballage standard et suit le même pipeline d’emballage. L’emballage se fait dans des capillaires émetteurs frittés ou tirés standard. L’optimisation principale réside dans la concentration de boue de sorbant : la méthode standard est incompatible avec une suspension de sorbant hautement concentrée utilisée dans FlashPack. Le résultat est une méthode de production rapide pour les longues colonnes UHPLC, par exemple, une colonne emballée pour 50 cm de longueur avec 1,9 μm de sorbant en moins de 1 h(Figure 2).

Pour démontrer l’application de l’approche FlashPack, une colonne capillaire ID de 30 cm 100 μm a été préparée (Tableau 6). L’emballage du sorbant ReprosilPur C18 de 1,9 μm a été effectué à 60 bars dans un capillaire d’émetteur tiré ID de 50 cm de long et 100 μm, préparé par un arracheur laser P2000. Le capillaire a été emballé à ~ 40 cm en 40 minutes avec un peu plus de sorbant lâche laissé à l’intérieur du capillaire. Le capillaire emballé a été connecté à un système HPLC et fonctionnait à 300 nL / min avec du solvant B (80% d’acétonitrile, 0,1% DE FA). Après deux tours de sonication de 5 s, la longueur finale emballée était de 43 cm. La colonne a été déconnectée, coupée à 30 cm et connectée au système HPLC à l’aide d’une connexion UHPLC. Nous utilisons régulièrement une ferrule d’écrou en PEEK sans manchon de 360 μm et une union en acier inoxydable de 360 μm. Cette combinaison peut contenir au moins jusqu’à 700 barres si elle est fortement serrée. La colonne fabriquée a une contre-pression de 520 bars à 2% de solvant B à 500 nL / min, ce qui est conforme à la plage de valeurs attendue (Tableau 5).

Pour démontrer l’efficacité de la colonne, nous avons utilisé la colonne fabriquée de 30 cm pour séparer 50 fmol d’un digeste tryptique de la protéine C du cytochrome C dans un gradient de 15 min de 2% à 50% B. Les chromatogrammes ioniques extraits ont montré que les pics étaient très symétriques avec une queue minimale. Le FWHM moyen était d’environ 3 s (Figure 3).

Tableau 1 : Dépannage de la contre-pression de travail élevée de la colonne. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.

Tableau 2 : Programme d’attraction laser P2000/F. Programme d’attraction laser P2000/F pour la préparation de capillaires émetteurs tirés à partir de 360 μm OD 100 μm ID capillaires enduits de polyimide de silice fondue sans revêtement interne à des températures ambiantes de 23 à 25 °C. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.

Tableau 3 : Problèmes d’emballage spécifiques à FlashPack et points de contrôle à contrôler pendant le processus d’emballage. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.

Tableau 4 : Exemples de débits d’emballage et de travail pour différents D’ENTREI et longueurs de colonne. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.

Tableau 5 : Contre-pression attendue pour une colonne remplie desorbants sphériques de 2 μ m et fonctionnant au débit de travail (selon l’ID de colonne) dans le système de solvant RP à RT. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.

Tableau 6 : Emballage exemplaire de colonne UHPLC de 30 cm. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.

Figure 1: Schéma d’emballage de la colonne capillaire. Les étapes 1 à 3 sont préparatoires, suivies de l’emballage de bombes sous pression et terminées par l’emballage HPLC. Les étapes 3 et 4 sont modifiées pour le protocole FlashPack ultra-efficace. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 2: Taux d’emballage pour un ID capillaire fritté de 100 μm avec ReprosilPur C18 AQ 1,9 μm à 100 bars dans du méthanol. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 3: Chromatogrammes ioniques extraits de peptides tryptiques du cytochrome C. Chromatogrammes ioniques extraits de peptides tryptiques du cytochrome C après séparation de 50 fmol dans une colonne capillaire d’émetteur tirée de 100 mm ID de 30 cm de long emballée avec ReprosilPur C18 AQ 1,9 μm dans un gradient de tampon B (80% acétonitrile, 0,1% FA) et dans le tampon A (2% acétonitrile, 0,1% FA) de 2% à 40% B en 15 min à 500 nL / min à RT. La détection a été effectuée à l’aide d’un spectromètre de masse. Les intensités absolues et les plages m/z extraites pour chaque peptide sont indiquées à droite des spectres. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Discussion

L’emballage interne des colonnes capillaires est très populaire dans les grands laboratoires travaillant sur plusieurs projets indépendants. Cependant, une méthode d’emballage courante à partir d’une suspension de sorbant à faible concentration a des limites majeures dans la vitesse et est incapable de produire de longues colonnes UHPLC.

FlashPack est une modification de la procédure d’emballage standard qui rend possible l’emballage à partir d’une concentration de sorbant très élevée. La base théorique de la méthode réside dans la déstabilisation continue de la coupole sorbante à l’entrée de la colonne pendant toute la durée d’emballage. Ce dernier est techniquement obtenu par l’entrée de la colonne étant continuellement frappée avec une barre magnétique. La méthode de déstabilisation de la coupole est intentionnellement développée pour que la configuration d’emballage soit complètement similaire au processus d’emballage commun, mais l’astuce de FlashPack réside dans les détails de la préparation de la boue absorbante, du positionnement capillaire et de l’utilisation de la barre magnétique pendant le processus d’emballage.

La boue sorbante est préparée sous forme de couche absorbante de sédiments dans un grand volume de solvant. Il est intéressant de noter que l’emballage à base de bombe sous pression ne nécessite pas les mêmes conditions d’emballage pour une colonne à l’autre. Dans FlashPack, nous ne connaissons jamais la concentration exacte de boue sorbante autour de l’entrée de la colonne. Il est impossible de mesurer et de contrôler exactement, car il change également pendant le processus d’emballage. Cependant, les colonnes finales sont encore très reproductibles⁴ quelle que soit la façon dont l’emballage a été réalisé.

La base de l’emballage rapide réside dans la déstabilisation efficace de la coupole sorbante. Pour cette raison, il est important de contrôler l’entrée du sorbant dans le capillaire et de maintenir les conditions optimales de déstabilisation de la coupole pendant toute la durée d’emballage. Il existe plusieurs problèmes possibles qui pourraient empêcher une administration efficace du sorbant. Quelques exemples de ceux-ci sont la résuspension de la couche sorbante par rotation rapide de la barre magnétique, la déstabilisation inefficace de la coupole due soit à un mauvais positionnement relatif de la barre magnétique, soit à une rotation trop lente de la barre magnétique. Les questions elles-mêmes et la façon dont elles doivent être abordées sont discutées en détail dans la section du protocole.

Une fois la colonne emballée, le paramètre de colonne principal à vérifier est la contre-pression de la colonne. Les valeurs de pression indiquées dans le tableau 5 fournissent un point de référence pour ce qui est attendu pour l’un des sorbants populaires de taille inférieure à 2 μm de taille de bille-ReproSil PUR C18 AQ (1,9 μm). Dans le même temps, une contre-pression supplémentaire peut être ajoutée par la fritte ou un émetteur trop étroitement tiré et il faut surveiller constamment cela. Si l’emballage est effectué dans un émetteur tiré, nous suggérons toujours de mesurer la contre-pression de colonne attendue pour le sorbant particulier utilisé en emballant d’abord les capillaires frittés, puis de voir si la fritte auto-assemblée en ajoute trop. Pour tout problème de haute pression, utilisez les directives fournies dans le tableau 1 pour identifier le problème.

D’après notre expérience, une colonne emballée sans décolorations, espaces et avec la contre-pression appropriée fonctionne dans 100% des cas et donne une qualité de séparation proche de ce que l’on peut attendre de la longueur de la colonne et des caractéristiques de sorbant. Une colonne avec des décolorations n’est pas garantie de fonctionner correctement, mais peut tout de même donner des résultats satisfaisants.

La plupart du temps, s’il y a des problèmes avec la qualité de séparation, ils ne proviennent pas de la colonne elle-même, mais plutôt d’autres parties du système de séparation, à savoir les pompes, les solvants ou les connexions. Les connexions post-colonne sont particulièrement potentiellement dangereuses. Une mauvaise connexion avec un volume mort entre l’émetteur et la colonne frittée entraîne un élargissement et un résidu de pic majeurs en raison de débits très faibles en chromatographie capillaire.

Un autre problème important spécifique à l’approche FlashPack est qu’elle utilise beaucoup de sorbants coûteux dans un flacon de boue sorbant fonctionnel. N’oubliez pas que la boue sorbante de FlashPack est destinée à un usage multiple. Prenez soin du sorbant. Évitez l’agitation inutile de barres magnétiques pour réduire le broyage du sorbant - n’oubliez pas d’arrêter la rotation dès que l’emballage est terminé. Et ne laissez pas le flacon de sorbant ouvert dans la bombe sous pression pour éviter le séchage du sorbant. Bien que le sorbant puisse toujours être utilisé après cela, il faut du temps pour refaire la boue de sorbant.

La méthode fonctionne aussi bien pour les capillaires frittés que pour les capillaires à émetteur tiré. Le principe FlashPack augmente le taux d’emballage des pièces d’origine capillaire de 20 à 250 μm (les plus petits et les plus grands n’ont pas été testés). Il est également applicable à tous les sorbants, à la fois poreux et superficiellement poreux, que nous avons pu tester (reflétant que la formation de coupole sorbante à forte concentration de boue sorbante ne se limite pas spécifiquement aux sorbants RP). En outre, les paramètres du solvant affectent clairement l’emballage en fonction de leurs caractéristiques physiques et chimiques. Par exemple, moins d’acétone visqueuse donne un taux d’emballage encore plus élevé que le méthanol à la même pression d’emballage. Cependant, il est également moins polaire que le méthanol et réduit les particules absorbantes qui adhèrent les unes aux autres. L’effet en lui-même empêche la formation de coupole sorbante au début de l’emballage lorsque le débit est encore élevé. Cependant, la réduction de l’interaction des particules absorbantes conduit également à une formation de fritte auto-assemblée moins fiable et à un blocage plus fréquent des extrémités tirées pendant l’emballage. Ainsi, alors que l’acétone est meilleure pour l’emballage des capillaires frittés, elle convient moins aux capillaires à émetteur tiré, le méthanol en tant que solvant de boue étant plus lent mais adapté aux deux types de terminaison. L’emballage à partir d’hexane ou de dichlorométhane (DCM) sont des cas extrêmes de passage de l’acétone à partir de méthanol: ils sont encore moins polaires, ils empêchent donc complètement la formation de coupoles absorbantes, mais ils ne sont pas du tout adaptés à l’emballage à émetteur tiré. En outre, il a été noté que la polarité DCM extrêmement faible conduit à des particules sorbantes collant à la paroi capillaire interne et faisant une couche épaisse sur elle. L’épaisseur de la couche augmente progressivement et des blocs locaux aléatoires se forment, ce qui entraîne la colonne emballée en plusieurs parties séparées par des régions sans sorbant. Un tel effet a été observé pour le sorbant C18 Peptide Aeris.

Un autre problème observé était que le sorbant YMC Triart C18 n’était pas correctement en suspension dans le méthanol, mais formait une sorte de flocons. Cependant, cela ne l’empêche pas d’être emballé avec le FlashPack et de donner une efficacité de séparation très décente (données non publiées). Ainsi, bien qu’il ne soit pas optimal dans certains cas, le méthanol était le solvant le plus universel pour fonctionner pour tous les sorbants et colonnes testés. Il est nécessaire de mentionner que nous n’avons pas encore analysé comment différents solvants de boue affectent l’efficacité de la séparation des colonnes. Dans le même temps, l’efficacité des colonnes emballées à partir de méthanol est déjà complètement égale à celle des colonnes commerciales pour les mêmes sorbants⁴.

FlashPack n’est pas la seule approche existante pour améliorer le taux d’emballage des colonnes UHPLC. L’emballage rapide à partir d’une concentration élevée de boue sorbante est également possible avec l’utilisation d’un emballage à ultra-haute pression⁷. L’avantage de FlashPack est qu’il est beaucoup plus simple car il ne nécessite pas de pompes ultra-haute pression spéciales et de bombes sous pression pour la livraison de sorbant et les connexions capillaires. Dans le même temps, il a été démontré que les colonnes emballées à des pressions extrêmes peuvent avoir une efficacité de séparation supérieure à celle des colonnes emballées à basse pression¹⁷. Et bien que FlashPack produise des colonnes identiques à celles commerciales utilisées dans la comparaison⁴, pour lesquelles nous ne connaissons pas la méthode d’emballage, il n’a pas encore été testé comment les colonnes FlashPack résistent aux colonnes emballées à ultra-haute pression.

En résumé, la méthode FlashPack décrite peut être facilement adaptée au protocole d’emballage existant en laboratoire avec quelques ajustements apportés au protocole, tandis que la configuration reste complètement la même. Il accélère l’emballage de la colonne capillaire HPLC à quelques minutes et permet la production de longues colonnes capillaires UHP, ce qui est clairement impossible avec la procédure d’emballage standard. L’économie globale en temps et en argent pour le laboratoire par application de l’approche FlashPack peut être comptée en dizaines de milliers d’euros par an. De plus, la possibilité de produire localement des colonnes capillaires UHP ouvre des possibilités de personnalisation expérimentale impossible avec les produits commerciaux disponibles.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Acétonitrile avec 0,1 % (v/v) d’acide formique	Merck	1.59002
tube à centrifuger 1,5 mL	Eppendorf
Ceramic Scoring Wafer	Restek	20116	toute plaquette en céramique convient au polissage
Scribe à lame diamantée	NewObjective	Rainure à lame diamantée	recommandée pour la coupe capillaire
capillaire en silice fondue 100 mm ID 375 mm OD	CM Scientific	TSP100375
GELpointes de rame	Eppendorf	30001222
système HPLC	ThermoScientific	Ultimate3000 RSLCnano
Extracteur laser	Sutter	P2000/F
Barre magnétique 2x5 mm	Merck	Z283819
MeOH		Merck 1.06018
microspatule	Merck	Z193216
virole PEEK 360 mm	VICI	JR-C360NFPK	utiliser pour connecter la colonne à l’embout de pipette union UPLC
, 1000 uL		Pipette Merck Z740095
, 1000 uL	Gilson	Pipetman L P1000L
bombe à pression	NextAdvance	PC-77 MAG
	regulator GCE	Jetcontrol 600 200/103
Reprosil Pur C18 AQ 120 1.9 mm	Dr. Maisch	r13.aq.0001
Bouchons à vis sans bouchons, fond conique, autoportant, 0,5 mL	Merck	AXYST050SS
Tubes à vis sans bouchons, fond conique, autoportant, 1,5 mL	Merck	AXYST150SS
Bouchons à vis avec joints toriques	Merck	AXYSCOC
Bain de sonication	Elma	Elmasonic S30 H
union HPLC	VICI	JR-C360RU1PK6	Connexion HPLC de 1/16 OD capillaire à 360 um Colonne
UPLC	VICI	JR-C360RU1FS6	Connexion UPLC de 1/16 OD HPLC capillaire à colonne capillaire 360 um
vortex	BioSan	V-1plus
Eau à 0,1 % (v/v) d’acide formique	Merck	Référence 1,59013