Article de méthode

Un système d’imagerie haute définition réglable pour les études comportementales des adultes drosophiles

DOI :

10.3791/62533

⸱

8 juin 2021

 ,  , 
1Department of Zoology and Animal Physiology, College of Biological Sciences, China Agricultural University, 2College of Life Sciences, Capital Normal University

* These authors contributed equally

Dans cet article

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ce protocole décrit comment créer une simple chambre d’observation du comportement de la drosophile adulte et comment prendre des photographies / vidéos haute définition de la morphologie ou du comportement de différents types de mouches des fruits dans la chambre d’observation grâce à des méthodes relativement simples et abordables.

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Drosophila melanogaster est un modèle très puissant dans la recherche biologique, mais un mauvais modèle pour la photographie ou la vidéographie. Cet article décrit une méthode simple mais efficace pour observer et documenter le comportement ou la morphologie des mouches. Les mouches ont été placées dans une chambre d’observation translucide c.a. Ø15 x 5 mm (pas de nourriture à l’intérieur) ou Ø15 x 12 mm (avec un morceau de nourriture de 8 mm de haut à l’intérieur). Après avoir recouvert d’un filtre ultraviolet (UV) / clair avec une transmission lumineuse élevée, la chambre a été placée sous un stéréomicroscope à zoom 5-50x, et des mini-diodes électroluminescentes (LED) ont été placées des deux côtés du microscope pour éclairer la chambre afin d’obtenir une lumière uniforme, douce, lumineuse et presque sans ombre. Ensuite, un appareil photo numérique compact avec zoom optique 3-5x, qui peut enregistrer une vidéo haute définition 1080 P ou haute résolution (à une fréquence d’images de ≥30 ips), a été connecté à l’oculaire du microscope via un support, et des photos ou des vidéos ont été prises à travers l’oculaire. En ajustant le bouton de zoom du stéréomicroscope zoom, il était très facile de suivre les mouches et de prendre des images panoramiques ou détaillées en gros plan selon les besoins, tandis que la caméra enregistrait tout au microscope. Parce que les mouches peuvent rester à n’importe quelle position dans la chambre, elles peuvent être observées et enregistrées de toutes les directions. Les photographies ou vidéos prises sont de bonne qualité d’image. Cette méthode peut être utilisée à la fois pour la recherche scientifique et l’enseignement.

Introduction

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Drosophila melanogaster est un modèle exceptionnel en recherche biologique; cependant, c’est un mauvais modèle pour la photographie ou la vidéographie, car il est trop petit pour un appareil photo ou un caméscope et trop grand pour un microscope composé1. Malgré d’excellentes recherches décrites dans la littérature, la plupart des études n’ont fourni que des images floues et peu claires, plutôt que des photographies claires et nettes avec des détails clairs qui illustrent le comportement de la mouche décrit. De plus, bien que les comportements des mouches aient été largement étudiés (par exemple, la parade nuptiale et les combats), la plupart de ces articles ont utilisé des illustrations pour expliquer leurs recherches aux lecteurs.

Cet article décrit une approche simple et économique. En utilisant cette méthode, non seulement les différents comportements de la drosophile peuvent être observés, mais aussi tous les détails qui peuvent être observés sous un microscope stéréo zoom peuvent être enregistrés clairement et nettement. Bien sûr, cette méthode peut également être utilisée pour enregistrer la morphologie des mouches, car lorsqu’elles entrent dans un état de sommeil ou de semi-sommeil, le modèle stationnaire permet à l’utilisateur de prendre une photo ou une pile de photographies avec différents plans focaux pour obtenir une photo de profondeur de champ étendue. Ces méthodes peuvent être réalisées sans technologie compliquée et équipement coûteux ou même de superbes compétences manuelles.

La composante vidéo de cet article montre des vidéos de plusieurs comportements typiques des mouches. Le but de la diffusion de ces vidéos est double: l’un est de faire savoir au public ce qui peut être capturé et de présenter la qualité d’image obtenue en utilisant cette méthode; l’autre est de permettre aux nouveaux étudiants qui s’intéressent à la drosophile, mais qui n’ont pas encore eu l’occasion d’observer le comportement des mouches, de comprendre le comportement des mouches (comme la parade nuptiale, les combats) à travers ces vidéos claires plutôt que des illustrations ou des images floues.

Vidéo supplémentaire : Comportement de la mouche des fruits: Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

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Protocole

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1. Construction du système d’observation/documentation

REMARQUE: Les matériaux nécessaires à la construction du système d’observation/documentation du comportement des mouches sont illustrés à la figure 1et le système terminé est illustré à la figure 2. Le protocole pour construire le système et comment l’utiliser sont décrits ci-dessous.

  1. Faire un hamber fly behavior observation chamber (FBOC).
    1. Obtenir un petit récipient translucide (non transparent) pour faire un FBOC de diamètre (Ø) de taille 15 mm x 20 mm. Utilisez un bouchon de bouteille en plastique translucide de taille ~Ø17 mm x 22 mm pour faire un FBOC, ou coupez une section d’environ 17 mm à partir de l’extrémité épaisse d’une pointe de pipette de 5 mL pour faire un FBOC.
    2. Versez 1% d’agar dans le FBOC pour ajuster sa profondeur. Si la nourriture doit être placée dans le FBOC (voir pour la méthode de préparation de l’aliment), versez la gélose pour obtenir une profondeur de 12 mm. Si la nourriture n’a pas besoin d’être placée dans le FBOC, versez la gélose à une profondeur de 5 mm pour suivre plus facilement la localisation des mouches des fruits.
    3. Si vous utilisez une pointe de pipette pour fabriquer un FBOC, placez la section de la pointe de la pipette de coupure dans une boîte de Petri de Ø35 mm ou de Ø60 mm. Versez le gel d’agar à 1% dans la boîte de Pétri jusqu’à une épaisseur d’environ 5 mm, attendez que la gélose se solidifie et scellez le fond du FBOC. Ensuite, versez le gel d’agar dans le FBOC à l’épaisseur souhaitée.
  2. Fabriquez une base FBOC en alésant un trou d’environ 10 mm de profondeur au centre d’une pièce d’une feuille de mousse d’éthylamine de 60 mm x 60 mm x 15 mm avec le même diamètre que la FBOC. Insérez le FBOC dans le trou.
    REMARQUE: La base FBOC maintient la FBOC stable et l’empêche de basculer et facilite le mouvement du FBOC pour suivre les mouches pendant l’observation et la vidéographie.
  3. Faites de la nourriture pour mouches, si nécessaire, avec du milieu de levure2, un régime artificiel3, ou du saccharose / glucose pur (utilisez 1% d’agar comme agent gélifiant), selon le but de l’observation.
    1. Pour déterminer visuellement si les mouches se nourrissent et augmenter le contraste entre les mouches et leur environnement, ajoutez des colorants alimentaires (voir le tableau des matériaux)à l’aliment à une concentration finale de 12,5 mg / 100 mL.
      REMARQUE: L’abdomen des mouches change de couleur immédiatement après l’alimentation.
    2. Versez les aliments préparés dans une boîte de Pétri à une hauteur de 8 mm. Après la solidification, utilisez une lame de rasoir pour découper un morceau de nourriture de taille 8 mm x 4 mm x 8 mm et placez-le sur un morceau de plastique (comme un emballage de bonbons).
    3. Coupez la nourriture en une pyramide quadrangulaire ou une pyramide quadrangulaire frustum, comme le montre la figure 3,pour permettre l’observation et l’enregistrement du comportement des mouches sous différents angles lorsque les mouches atterrissent sur la nourriture au hasard. Utilisez le plastique sous les aliments pour empêcher le colorant dans les aliments de se diffuser dans la gélose dans le FBOC. Utilisez une pince à épiler pour placer la nourriture au centre du FBOC.
  4. Dans certaines observations comportementales, assurez-vous que les mouches sont affamées à l’avance. Verser 1% de gel de gélose (1 g d’agar/100 mL d’eau, 600 μL d’acide propionique) dans une bouteille propre et vide d’une épaisseur de 1-2 cm, et placer à température ambiante pendant 1-2 h. Transférer les mouches à la bouteille et placer à 25 °C pendant ≥36 h.
    REMARQUE: Les mouches peuvent absorber l’eau du gel de gélose, il n’est donc pas nécessaire d’ajouter de l’eau de temps en temps4,5.
  5. Transférez une ou plusieurs mouches dans le FBOC à l’aide d’un aspirateur. Si l’utilisation d’un aspirateur est difficile, refroidissez et inactivez les mouches dans de la glace pilée, triez-les sur un sac de glace et transférez-les au FBOC comme décrit précédemment6.
    REMARQUE: L’utilisation de la congélation facilite grandement le transfert des mouches; les mouches réfrigérées peuvent reprendre conscience en 1 min, beaucoup plus rapidement que celles anesthésisées au CO2. Bien que le refroidissement puisse avoir des effets néfastes sur le comportement des mouches, par exemple, une latence de copulation accrue des mouches de 5 min7 à 40 min8,il ne change pas le comportement des mouches (comme le comportement de parade nuptiale). Par conséquent, la méthode de refroidissement peut être utilisée pour transférer des mouches à des fins d’observation générale (telles que des expériences d’enseignement) et de vidéographie. Cependant, si les observations doivent être utilisées dans un rapport scientifique, il est fortement recommandé de ne pas exposer les mouches à une anesthésie.
  6. Après avoir transféré les mouches au FBOC, couvrez-le avec un filtre UV / clair de 30 à 40 mm pour que la caméra forme un complexe FBOC (Figure 4). Placez le complexe FBOC sous le stéréomicroscope pour observation.
    REMARQUE: Pour obtenir des images claires et nettes, il est fortement recommandé d’utiliser un filtre UV / clair de haute qualité avec une transmission de la lumière élevée (>98%) et une éruption réduite. Reportez-vous à quelques suggestions décrites précédemment9,10; Bien qu’il ne soit pas nécessaire d’acheter des filtres coûteux, évitez de recouvrir le FBOC de verre tel que le couvercle d’une boîte de Pétri.
  7. Illuminez le FBOC. Montez des mini-lumières vidéo LED pour faire clignoter les supports de montage de sabots et placez-les sur les côtés gauche et droit du FBOC (Figure 2). Allumez les voyants LED et réglez la luminosité à 100% et la température de couleur à 5000-5600 K.
    REMARQUE: Les mini lumières vidéo LED avec lumière dimmable, température de couleur 5600 K peuvent fournir un éclairage uniforme, lumineux, presque sans ombre. L’utilisation de la source de lumière supérieure fournie avec le stéréomicroscope, l’illuminateur LED Ring Light ou l’illuminateur à fibre optique n’a pas donné de résultats satisfaisants. Il est préférable d’utiliser une alimentation continue (transformateurs) pour les lumières vidéo LED.
  8. Observation et vidéographie du comportement des mouches
    1. Allumez les lumières vidéo LED et ajustez le microscope à zoom stéréo jusqu’à ce que le bord du FBOC puisse être clairement vu à l’œil nu. Déplacez le FBOC au centre du champ de vision.
    2. Fixez la pince de l’adaptateur universel de l’appareil photo numérique du télescope à un oculaire du stéréomicroscope, puis fixez solidement un appareil photo numérique compact à l’adaptateur en tournant alternativement la vis de montage de l’appareil photo et la vis de fixation de l’appareil photo (Figure 2).
    3. Allumez l’appareil photo numérique et tournez les boutons de réglage fin horizontaux/verticaux jusqu’à ce que le bord FBOC apparaisse clairement au centre du champ de vision circulaire lumineux sur l’écran LCD de l’appareil photo. Faites pivoter la molette de mode sur le mode automatique de priorité à l’ouverture, appuyez sur le sélecteur multiple, choisissez Macro en gros plan, puis appuyez sur le bouton OK. Déplacez le commutateur de zoom de l’extrémité grand angle à l’extrémité téléobjectif et effectuez un zoom sur l’image circulaire jusqu’à ce que sa partie centrale remplisse l’écran LCD complet. Appuyez sur le bouton Enregistrement vidéo pour démarrer l’enregistrement (appuyez à nouveau sur le bouton pour terminer l’enregistrement).
      REMARQUE: Si l’image est trop sombre ou trop lumineuse, appuyez sur le côté de la molette de commande près de l’icône de compensation d’exposition (Figure 1) et faites pivoter la molette pour modifier la valeur d’exposition (EV) suggérée par l’appareil photo pour obtenir l’effet souhaité. Les véhicules électriques positifs rendent l’image plus lumineuse et les véhicules électriques négatifs rendent l’image plus sombre. L’image doit être uniforme, lumineuse, sans vignettage.
    4. Tournez le bouton de mise au point du microscope jusqu’à ce que les mouches du FBOC soient clairement visibles. Choisissez le comportement de la mouche qui vous intéresse pour l’observation ou l’enregistrement vidéo. Tournez le bouton de zoom pour effectuer un zoom avant et arrière afin d’obtenir le grossissement souhaité pour l’observation ou l’enregistrement vidéo.
      REMARQUE: Cette méthode de prise d’images au microscope à travers les oculaires est applicable à tout microscope avec oculaires. Pour prendre des photos de résultats expérimentaux, utilisez un appareil photo capable de prendre des photos au format RAW, car les fichiers image RAW sont préférables aux JPEG. Utilisez l’écran LCD de l’appareil photo comme écran pour observer le comportement des mouches des fruits et assurez-vous que le microscope à zoom stéréo a un zoom d’au moins 5 à 50x.

2. Protocoles d’observation et de vidéographie du comportement des mouches

  1. Préparation des mouches
    1. Culturez les mouches sur un milieu de semoule de maïs à 25 °C avec 60% d’humidité et un cycle lumière/obscurité de 12 h. Recueillez les mouches dans les 6 jours suivant l’éclosion pour observation (sauf parade nuptiale et comportement de combat).
      NOTE: Ici, le milieu était composé de 1000 mL d’eau, 105 g de farine de semoule de maïs, 75 g de saccharose, 15 g d’agar, 40 g de levure en poudre, 28 mL de méthylparabène à 10% (p / v dans éthanol à 95%) et 6,25 mL d’acide propionique.
  2. Reprendre conscience de l’anesthésie en refroidissant
    1. Refroidissez les mouches comme décrit précédemment. 6 Transférer la drosophile de la glacière au FBOC à l’aide d’une pince à épileuse. Enregistrez le processus de la mouche de l’inactivité à la posture normale sur vidéo.
  3. Sommeil, alimentation, excrétion et comportement social
    1. Affamé vole pendant 36 h. Transférez 4 à 6 mouches des fruits au FBOC avec de la nourriture tachée. Observez et enregistrez le comportement des mouches sur vidéo.
      REMARQUE: Les mouches qui restent immobiles pendant plus de 5 minutes affichent leur comportement de sommeil11. La drosophile peut dormir sur de la nourriture ou sur une paroi FBOC verticale (le corps est perpendiculaire à la paroi de la chambre d’observation). Bien que le corps ne bouge pas pendant le sommeil, l’abdomen peut être vu comme ondulant. Le comportement alimentaire se manifeste lorsque la mouche étire sa trompe, se déplace sur la nourriture tout en suçant constamment et que son abdomen devient bleu. Pendant l’alimentation de groupe ou d’autres activités, les mouches des fruits étirent leurs pieds pour toucher le corps d’autres mouches des fruits de manière amicale. C’est un comportement social.
  4. Comportement de toilettage des mouches
    1. Refroidir les mouches comme décrit6. Jetez les mouches congelées dans de la poudre d’agar et roulez pour les recouvrir de poudre d’agar. Transférez les mouches au FBOC. Observez et enregistrez le comportement de toilettage.
      REMARQUE: Lorsque la mouche des fruits reprend conscience de la congélation, elle secoue rapidement la poudre d’agar de son corps et nettoie chaque partie de son corps avec ses pattes12,13. Le comportement de toilettage peut également être vu pendant l’alimentation, la parade nuptiale et d’autres comportements.
  5. Faire la cour et le comportement de combat
    1. Recueillir les mouches femelles et mâles comme décrit précédemment7. Pour observer le comportement de parade nuptiale des mouches, placez une mouche femelle et une mouche mâle dans le FBOC pour observer et enregistrer 6 comportements de parade nuptiale (réussis et échoués).
    2. Pour observer le comportement de combat des mouches, placez deux mâles dans le FBOC. Observez et enregistrez leur comportement de se pousser et de se bousculer.
  6. Comportement de ponte des mouches
    1. Préparez les mouches femelles comme décrit précédemment5. Transférer 4 mouches femelles dans FBOC avec de la nourriture.

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Résultats

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Photographiez à travers un filtre UV pour des images claires et nettes
Effectuez une expérience simple pour observer la différence entre un filtre UV et un verre ordinaire en laboratoire. Prenez un flacon de culture de mouche, retirez le bouchon, placez-le sous un microscope à dissection stéréo et recouvrez-le (alternativement) d’un filtre UV et d’un couvercle de boîte de Pétri. Les photographies prises dans ces deux cas sont montrées à la figure 5. La photographie prise ...

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Discussion

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La lumière est au cœur même de la photographie et de la vidéographie et est le facteur décisif pour obtenir des images de haute qualité16. Ici, deux lumières vidéo LED avec luminosité et température de couleur réglables ont été utilisées comme illuminateurs, et un matériau translucide a été sélectionné pour fabriquer le FBOC. Les panneaux lumineux LED des deux côtés fournissaient suffisamment de luminosité et le matériau translucide adoucissait et dispersait la lumière, produisant finalement une l...

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Déclarations de divulgation

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nous remercions le professeur Li Xiangdong et le photographe M. Cheng Jing pour leurs discussions et suggestions utiles. Ce travail a été soutenu par le projet exploratoire (20200101) du Centre de démonstration de l’enseignement expérimental des sciences de la vie de l’Université agricole de Chine.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
appareil photo compact, Nikon P310Nikon3-5x, enregistrement de caméra 1080 P, vidéo HD,
mousse d’éthylamine60 mm x 60 mm x 15 mm
, bleu alimentaire n° 1CAS 3844-45-9
mini LED lights et transformateurGODOXLED-P120ont une température de couleur de 5000-5600 K
, petit récipient (par exemple, bouchon de bouteille)à propos de Ø ; Filtre UV/transparent de 15 mm x 20 mm
, filtre UV/transparent de haute qualité avec transmission élevée, zoom 30-40 mm,
, zoom optique , microscope stéréoscopique 5-50x

Références

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Chyb, S., Gompel, N. Atlas of Drosophila morphology: Wild-type and classical mutants. , Academic Press. (2013).
  2. Yang, D. Carnivory in the larvae of Drosophila melanogaster and other Drosophila species. Scientific Reports. 8, 15484(2018).
  3. Piper, M. D., et al. A holidic medium for Drosophila melanogaster. Nature Methods. 11, 100-105 (2014).
  4. Shiraiwa, T., Carlson, J. R. Proboscis extension response (PER) assay in Drosophila. Journal of visualized experiments : JoVE. (3), e193(2007).
  5. Yang, C. -H., Belawat, P., Hafen, E., Jan, L. Y., Jan, Y. -N. Drosophila egg-laying site selection as a system to study simple decision-making processes. Science. 319 (5870), 1679-1683 (2008).
  6. Yang, D. Simple homemade tools to handle fruit flies-Drosophila melanogaster. Journal Of Visualized Experiments: JoVE. (149), e59613(2019).
  7. Nichols, C. D., Becnel, J., Pandey, U. B. Methods to assay Drosophila behavior. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (61), e3795(2012).
  8. Barron, A. B. Anesthetizing Drosophila for behavioural studies. Journal of Insect Physiology. 46 (4), 439-442 (2000).
  9. Cicala, R. My not quite complete protective filter article. , Available from: https://www.lensrentals.com/blog/2017/06/the-comprehensive-ranking-of-the-major-uv-filters-on-the-market (2017).
  10. Carnathan, B. UV and clear lens protection filters review. , Available from: https://www.the-digital-picture.com/Reviews/UV-and-Clear-Lens-Protection-Filters.aspx (2013).
  11. Shaw, P. J., Cirelli, C., Greenspan, R. J., Tononi, G. Correlates of sleep and waking in Drosophila melanogaster. Science. 287 (5459), 1834-1837 (2000).
  12. Barradale, F., Sinha, K., Lebestky, T. Quantification of Drosophila grooming behavior. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (125), e55231(2017).
  13. Szebenyi, A. L. Cleaning behaviour in Drosophila melanogaster. Animal Behaviour. 17 (4), 641-651 (1969).
  14. Arkema Inc. Plexiglas : optical and transmission characteristics. , Available from: https://www.plexiglas.com/export/sites/plexiglas/.content/medias/downloads/sheet-docs/plexiglas-optical-and-transmission-characteristics.pdf (2000).
  15. Fluegel, A. Calculation of the light reflection and transmission. , Available from: https://www.glassproperties.com/reflection/ (2007).
  16. Hunter, F., Biver, S., Fuqua, P. Light science & magic: an introduction to photographic Lighting. , Routledge. (2015).
  17. Hendricks, J. C., et al. Rest in Drosophila is a sleep-like state. Neuron. 25 (1), 129-138 (2000).
  18. Rieger, D., et al. The fruit fly Drosophila melangaster favors dim light and times its activity peaks to early dawn and late dusk. Journal of Biological Rhythms. 22 (5), 387-399 (2007).

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