Un modèle de stéatose expérimentale in vitro: culture de cellules hépatocytaires dans un milieu conditionné par surcharge lipidique

Résumé

Ce protocole se veut un outil d’étude de la stéatose et des changements moléculaires, biochimiques, cellulaires produits par la surexposition des hépatocytes aux lipides in vitro.

Résumé

La stéatose hépatique associée au dysfonctionnement métabolique (MAFLD), précédemment connue sous le nom de stéatose hépatique non alcoolique (NAFLD), est la maladie du foie la plus répandue dans le monde en raison de sa relation avec l’obésité, le diabète de type 2 et la dyslipidémie. La stéatose hépatique, l’accumulation de gouttelettes lipidiques dans le parenchyme hépatique, est une caractéristique clé de la maladie précédant l’inflammation observée dans la stéatohépatite, la fibrose et la maladie hépatique terminale. L’accumulation de lipides dans les hépatocytes pourrait interférer avec le métabolisme approprié des xénobiotiques et des molécules endogènes, ainsi que pour induire des processus cellulaires conduisant à l’avancée de la maladie. Bien que l’étude expérimentale de la stéatose puisse être réalisée in vivo,les approches in vitro pour l’étude de la stéatose sont des outils complémentaires avec différents avantages. La culture d’hépatocytes dans un milieu conditionné par surcharge lipidique est une excellente option reproductible pour l’étude de la stéatose hépatique permettant l’identification des processus cellulaires liés à l’accumulation de lipides, tels que les stress oxydatifs et réticulaires, l’autophagie, la prolifération, la mort cellulaire, etc., ainsi que d’autres tests, y compris l’efficacité des médicaments et les tests toxicologiques, parmi de nombreuses autres applications possibles. Ici, il s’agissait de décrire la méthodologie de la culture de cellules hépatocytaires dans un milieu conditionné par une surcharge lipidique. Les cellules HepG2 ont été cultivées dans un milieu RMPI 1640 conditionné avec du palmitate de sodium et de l’oléate de sodium. Il est important de noter que le rapport de ces deux lipides est crucial pour favoriser l’accumulation de gouttelettes lipidiques, tout en maintenant la prolifération cellulaire et un taux de mortalité modéré, comme cela se produit dans le foie pendant la maladie. La méthodologie, à partir de la préparation des stocks de solution lipidique, du mélange, de l’addition au milieu et de la culture d’hépatocytes est montrée. Avec cette approche, il est possible d’identifier les gouttelettes lipidiques dans les hépatocytes qui sont facilement observables par coloration O rouge huile, ainsi que les courbes des taux de prolifération / mortalité.

Introduction

La stéatose hépatique associée à un dysfonctionnement métabolique est très répandue dans le monde^{entier 1,2}; on estime que jusqu’à 25% de la population est touchée³. Cette maladie précédemment connue sous le nom de stéatose hépatique non alcoolique (NAFLD), a mis à jour sa nomenclature pour la stéatose hépatique associée au dysfonctionnement métabolique (MAFLD) afin de refléter avec précision la pathogenèse liée à l’obésité, à la résistance à l’insuline, au diabète de type 2 et à la dyslipidémie, ainsi que les prises en charge possibles de la maladie^3,....

Protocole

1. Préparation de milieu standard et conditionné

1. Pour préparer le RPMI 1640 standard, compléter le milieu de culture RPMI 1640 avec 10% (v/v) de sérum bovin fœtal (FBS, précédemment inactivé par la chaleur) et 1% (v/v) de solution de pénicilline-streptomycine. Conserver le milieu à 4 °C.Stériliser à l’aide de filtres de 0,22 μm.
2. Pour préparer une solution mère de palmitate, préparer une solution de palmitate de 50 mM dans le RPMI 1640 standard préalablement complété par 1% d’albumine sérique bovine (sans lipides). Un volume de 5 à 10 mL de ce stock sera suffisant. Stériliser la solution mère à l’aide de filtres de 0,22 μm. Conserver à 4 °C à l’abri....

Résultats

Les hépatocytes cultivés dans le milieu stéatogène présentent une croissance sur toute la surface du puits; cependant, les hépatocytes gras présentent un taux de croissance inférieur à celui des cellules cultivées en milieu témoin. Le rapport et la concentration proposés d’arthrose et d’AP garantissent la survie cellulaire pendant la culture. L’ensemencement de 1 x^{10 5} cellules par puits dans des plaques de 24 puits permet une confluence optimale comme le montre la figure 1.

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Discussion

Ce protocole vise à fournir une stratégie pour étudier la stéatose in vitro. La culture cellulaire est un outil puissant pour étudier les aspects cellulaires, moléculaires, biochimiques et toxicologiques des cellules exposées à différentes conditions. Avec cette approche, la stéatose peut être visualisée non seulement comme un stade de la maladie complexe qu’est la MAFLD, mais aussi comme la surexposition hépatocytaire aux lipides et les résultats possibles résultant d’une telle exposition. Par conséquent, son a.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Enceinte de biosécurité	ESCO Airstream	AC2-452+C2 :C26	Classe II  ; Type A2  ; Biological Safety Cabinet
Filtre à bouteille	Corning, États-Unis	430513	; Non apyrogène, polystyrène, stérile. 1 filtre/sac. 0,22 &mu ; m, 500 mL.
Sérum bovin albimun (BSA)	Gold Biotechnology, US	A-421-10	BSA Sans acides gras pour culture cellulaire
Milieux de culture RPMI 1640	ThermoFisher-Gibco, US	31800-022-Fetal
Bovine Serum (FBS)	ThermoFisher-Gibco, US	A4766801-Hemocytometer
	Marienfeld, DE	640010-HepG2
Lignée cellulaire	ATCC, US	HB-8065	Carcinome hépatocellulaire cellules humaines.
Incubateur humidifié	Thermo Electronic Corporation, US	Modèle : 3110	Température (37 ° ; C ± ; 1 ° ; C), humidité (90 % ± ; 5 %), CO2 (5 % ± ; 1 %)
Microscope inversé Eclipse	NIKON, JPN	Modèle : TE2000-S-Isopropanol
	Sigma-Aldrich, US	I9030-4L-Oil
Red O Kit	Abcam, US	ab150678	Kit pour la visualisation histologique de la graisse neutre.
Paraformaldéhyde	Sigma-Aldrich, US	P6148-500G-Pénicilline
/streptomycine	ThermoFisher-Gibco, US	15140-122	Antibiotiques 10 000 U/mL Pénicilline, 10 000 &mu ; g/mL PH-mètre de streptomycine
	Beckman, US	Modèle : 360 PH/Temp/MV	Meter-Saline
tamponnée au phosphate	ThermoFisher-Gibco, US	10010-023-Pipettes
sérologiques	Sarstedt, AUS	86.1253.001	; Pipettes sérologiques apyrogènes, stériles, de 5 mL
	Sarstedt, AUS	; 86.1254.001	; Non apyrogène, stérile, 10 mL
Bicarbonate de sodium	Sigma-Aldrich, US	S5761-1KG	Préparation du milieu de culture
Oléate de sodium	Santa Cruz Biotechnology, US	sc-215879A-Palmitate
de sodium	Santa Cruz Biotechnology, US	sc-215881-Filtre
à seringue	Corning, US	431219	; Non apyrogène, stérile, 28 mm, 0,2 &m.
Trypan Blue	Sigma-Aldrich, US	T6146-25G-Trypsine
0.05 % /EDTA 0.53 mM	Corning, US	25-052-Cl-24
Cluster de culture cellulaire de puits	Corning, US	3524	Fond plat avec couvercle. Culture tissulaire traitée. Non apyrogène, polystyrène, stérile. 1/paquet.
Grappe de culture cellulaire 96 puits	Corning, US	3599	Fond plat avec couvercle. Culture tissulaire traitée. Non apyrogène, polystyrène, stérile. 1/paquet.