RIBO-seq in Bacteria: a Sample Collection and Library Preparation Protocol for NGS Sequencing

Summary

Nous décrivons ici les étapes de la collecte d’échantillons et de la préparation pour RIBO-seq chez les bactéries. Le séquençage des bibliothèques préparées conformément à ces lignes directrices donne suffisamment de données pour une analyse bioinformatique complète. Le protocole que nous présentons est simple, utilise un équipement de laboratoire standard et prend sept jours de la lyse à l’obtention des bibliothèques.

Abstract

La technique de profilage des ribosomes (RIBO-seq) est actuellement l’outil le plus efficace pour étudier le processus de synthèse des protéines in vivo. L’avantage de cette méthode, par rapport à d’autres approches, est sa capacité à surveiller la traduction en cartographiant précisément la position et le nombre de ribosomes sur une transcription d’ARNm.

Dans cet article, nous décrivons les étapes consécutives de la collecte d’échantillons et de la préparation de la méthode RIBO-seq chez les bactéries, en soulignant les détails pertinents à la planification et à l’exécution de l’expérience.

Puisque le RIBO-seq repose sur des ribosomes intacts et des ARNm connexes, l’étape clé est l’inhibition rapide de la traduction et la désintégration adéquate des cellules. Ainsi, nous suggérons la filtration et le flash-congélation dans l’azote liquide pour la récolte cellulaire avec un prétraitement facultatif avec le chloramphénicol pour arrêter la traduction dans les bactéries. Pour la désintégration, nous proposons de broyer les cellules congelées avec du mortier et du pilon en présence d’oxyde d’aluminium pour perturber mécaniquement la paroi cellulaire. Dans ce protocole, un coussin de saccharose ou une ultracentrifugation à gradient de saccharose pour la purification par monosomes n’est pas nécessaire. Au lieu de cela, la séparation d’ADN messagère utilisant l’électrophorèse de gel de polyacrylamide (PAGE) suivie de l’excision ribosomique d’empreinte (bande 28-30 nt) est appliquée et fournit des résultats satisfaisants. Cela simplifie en grande partie la méthode et réduit le temps et les exigences d’équipement pour la procédure. Pour la préparation de la bibliothèque, nous vous recommandons d’utiliser le petit kit d’ARN disponible dans le commerce pour le séquençage Illumina à partir de New England Biolabs, en suivant les directives du fabricant avec un certain degré d’optimisation.

Les bibliothèques d’ADNc qui en résultent présentent la quantité et la qualité appropriées requises pour le séquençage de nouvelle génération (NGS). Le séquençage des bibliothèques préparées selon le protocole décrit donne 2 à 10 mln lectures cartographiées de manière unique par échantillon fournissant des données suffisantes pour une analyse bioinformatique complète. Le protocole que nous présentons est rapide et relativement facile et peut être réalisé avec un équipement de laboratoire standard.

Introduction

La technique de profilage des ribosomes (RIBO-seq) a été développée dans le laboratoire de Jonathan Weissman à l’Université de Californie à San Francisco^1. En comparaison avec d’autres méthodes utilisées pour étudier l’expression des gènes au niveau translationnel, RIBO-seq se concentre sur chaque ribosome se liant à l’ARNm et fournit des informations sur son emplacement et le nombre relatif de ribosomes sur une transcription. Il permet de surveiller le processus de synthèse des protéines in vivo et peut fournir une résolution et une précision de codon unique permettant la mesure de la densité du ribosome sur les deux, l’ARNm individue....

Protocol

1. Prélèvement d’échantillons

1. Préparer une culture bactérienne. Nous recommandons un volume de culture de 100 mL par échantillon.
2. Préparer l’équipement et les réactifs pour le prélèvement des échantillons : deux scoopulas par échantillon, filtres à membrane d’esters de cellulose (ECM) mélangés stériles de 0,45 μm, tubes stériles de 50 mL, azote liquide, chloramphénicol à 50 mg/mL dans de l’éthanol à 70 % (vol/vol) (facultatif). Percer le couvercle des tubes de 50 mL pour permettre l’évaporation de l’azote liquide et empêcher l’explosion des tubes fermés. Décontaminer les scoopulas avec du détergent de laboratoire et de l’éthanol à 70%.
3. Pr....

Results

Les résultats exemplaires présentés ici ont été obtenus dans une étude examinant la régulation de traduction dans les cellules sporulantes de Bacillus subtilis de WT. Pendant la nuit, les cultures ont été diluées à₆₀₀ DO égales à 0,1 dans 100 mL de milieu riche et incubées à 37 °C avec des secousses vigoureuses jusqu’à ce que la DO₆₀₀ atteigne 0,5-0,6. Le milieu riche a ensuite été remplacé par un milieu minimal pour induire le processus de sporulation et l’incubation a été poursuivie jusqu.......

Discussion

Le principal défi technique du profilage des ribosomes est la nécessité d’inhiber rapidement la traduction afin de capturer un instantané des ribosomes sur les ARNm à un état physiologique d’intérêt particulier. Pour ce faire, les inhibiteurs de traduction, la récolte rapide et la congélation instantanée dans l’azote liquide sont couramment utilisés. L’application d’antibiotiques est facultative car ils peuvent causer des artefacts. Le chloramphénicol est un médicament couramment utilisé pour arrêter les ribosomes allong.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
10X TBE (poudre)	Invitrogen	AM9864
2-Mercaptoéthanol, 99 %, pur	Acros Organics	125472500
Adénosine 5'-Triphosphate (ATP)	New England Biolabs	P0756S
Oxyde d’aluminium calciné pur p.a.	Chempur	114560600
Chlorure de calcium dihydraté	Sigma-Aldrich	C3881-500G
Chloramphénicol	MP Biomedicals	190321
ADN Clean & Concentrateur -5	Zymo Research	D4004
Dnase I recombinant, sans Rnase	Roche	4716728001
EDTA sel disodique	Fisher Scientific	E/P140/48
Alcool éthylique absolu 99,8 %  ; Pure-P.A.-Basic	POCH Avantor Performance Materials Poland S.A	BA6480111
Appareil de filtration	VWR Collection	511-0265	Appareil de filtration tout verre, avec entonnoir, base frittée, capuchon, 47 mm & Oslash ; pince à ressort et flacon à joint rectifié
Gel 40 (19:1)	Rotiphorese	3030.1
Gel Loading Dye, Bleu, 6X	New England Biolabs	E6138G
Guanosine 5&prime ;-[&beta ;,&gamma ;-imido]triphosphate trisodique sel hydraté	Sigma-Aldrich	G0635-25MG
labZAP	A& A Biotechnology	040-500
Acétate de magnésium tétrahydraté	Sigma-Aldrich	M5661-250G
Ajusteur de membrane	Alfatec Technology	M47MCE45GWS	taille des pores : 0,45 um
MICROBExpress Purification de l’ARNm bactérien	Invitrogen	AM1905
Multiplex Small RNA Library Set de préparation pour Illumina	New England Biolabs	E7300S
Eau sans nucléase	Ambion	AM9937
Acétate de potassium anhydre pur P.A.	POCH Avantor Performance Materials Poland S.A	744330113
Quick-Load pBR322 DNA-MspI Digest	New England Biolabs	E7323A
RNA Clean & Concentrateur -25	Zymo Research	R1018
Acétate de sodium	Sigma-Aldrich	S2889-250G
Carbonate de sodium	Sigma-Aldrich	223530-500G
Hydrogénocarbonate de sodium pur p.a.	POCH Avantor Performance Materials Poland S.A	810530115
SYBR Coloration en gel d’acide nucléique doré	Life Technologies	S11494
T4 Polynucléotide kinase	New England Biolabs	M0201L
T4 Tampon de réaction polynucléotidique kinase	New England Biolabs	B0201S
Tampon d’échantillon TBE-Urea (2x)	Invitrogen	LC6876
Tris(hydroxyméthyl)amino-méthane, ultra-pur, 99,9 %	AlfaAesar	J65594
Triton X-100, 98 %	Acros Organics	327371000
Urea G.R.	lach :ner	40096-AP0