Method Article

Quantification des densités cellulaires et des propriétés antigéniques par lévitation magnétique

DOI:

10.3791/62550

⸱

May 17th, 2021

 ,  ,  ,  ,  , 
1Nano Flow Core Facility, Beth Israel Deaconess Medical Center, Harvard Medical School, 2Department of Medicine, Division of Allergy and Inflammation, Beth Israel Deaconess Medical Center

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Cet article décrit une méthode basée sur la lévitation magnétique qui peut détecter spécifiquement la présence d’antigènes, solubles ou liés à la membrane, en quantifiant les changements dans la hauteur de lévitation des billes de capture avec des densités fixes.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La méthode décrite a été développée sur la base des principes de la lévitation magnétique, qui sépare les cellules et les particules en fonction de leur densité et de leurs propriétés magnétiques. La densité est une propriété d’identification de type cellulaire, directement liée à son taux métabolique, à sa différenciation et à son statut d’activation. La lévitation magnétique permet une approche en une étape pour séparer, imager et caractériser avec succès les cellules sanguines circulantes, et pour détecter l’anémie, la drépanocytose et les cellules tumorales circulantes en fonction de la densité et des propriétés magnétiques. Cette approche se prête également à la détection d’antigènes solubles présents dans une solution en utilisant des ensembles de billes de faible et haute densité recouvertes d’anticorps de capture et de détection, respectivement. Si l’antigène est présent en solution, il reliera les deux ensembles de perles, générant un nouveau complexe perle-perle, qui lévitera entre les rangées de perles recouvertes d’anticorps. Une concentration accrue de l’antigène cible en solution générera un plus grand nombre de complexes perles-billes par rapport à des concentrations plus faibles d’antigène, permettant ainsi des mesures quantitatives de l’antigène cible. La lévitation magnétique est avantageuse pour d’autres méthodes en raison de son temps de préparation des échantillons réduit et de son manque de dépendance aux méthodes de lecture classiques. L’image générée est facilement capturée et analysée à l’aide d’un microscope standard ou d’un appareil mobile, tel qu’un smartphone ou une tablette.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La lévitation magnétique est une technique développée pour séparer, analyser et identifier les types de cellules1,2,3,protéines4,5 et opioïdes6 en fonction uniquement de leur densité spécifique et de leurs propriétés paramagnétiques. La densité cellulaire est une propriété intrinsèque unique de chaque type de cellule directement liée à son taux métabolique et à son statut de différenciation7,8,9,10,11,12,13,14. La quantification des changements subtils et transitoires de la densité cellulaire dans des conditions d’état d’équilibre et au cours de divers processus cellulaires pourrait permettre de mieux comprendre la physiologie et la physiopathologie cellulaires. Les changements de densité cellulaire sont associés à la différenciation cellulaire15,16, la progression du cycle cellulaire9,17,18,19, l’apoptose20,21,22,23, et la transformation maligne24,25,26 . Par conséquent, la quantification de changements spécifiques dans la densité cellulaire peut être utilisée pour différencier les cellules de différents types, ainsi que pour discriminer le même type de cellules subissant divers processus d’activation. Cela permet des expériences qui ciblent une sous-population cellulaire particulière, où les changements dynamiques de densité servent d’indicateur d’altération du métabolisme cellulaire27. Comme il a été établi qu’une cellule peut altérer sa densité en réponse à un environnement changeant7,il est impératif de mesurer la cinétique de la cellule par rapport à sa densité pour la comprendre pleinement, ce que les méthodes actuelles peuvent ne pas fournir12. La lévitation magnétique, quant à elle, permet une évaluation dynamique des cellules et de leurs propriétés28.

Les cellules sont diamagnétiques, ce qui signifie qu’elles n’ont pas de moment dipolaire magnétique permanent. Cependant, lorsqu’il est exposé à un champ magnétique externe, un faible moment dipolaire magnétique est généré dans les cellules, dans la direction opposée du champ appliqué. Ainsi, si les cellules sont suspendues dans une solution paramagnétique et exposées à un fort champ magnétique vertical, elles léviteront loin de la source magnétique et s’arrêteront à une hauteur, qui dépend principalement de leur densité individuelle. La lévitation diamagnétique d’un objet confiné au minimum d’un champ magnétique inhomogène est possible lorsque les deux critères suivants sont remplis : 1) la susceptibilité magnétique de la particule doit être inférieure à celle du milieu environnant, et 2) la force magnétique doit être suffisamment forte pour contrebalancer la force de flottabilité de la particule. Les deux critères peuvent être remplis en suspendant les globules bouclés dans un tampon magnétique et en créant de forts gradients de champ magnétique avec de petits aimants permanents peu coûteux et disponibles dans le commerce1. La position d’équilibre d’une particule piégée magnétiquement sur un axe le long de la direction de la gravité est déterminée par sa densité (par rapport à la densité du tampon), sa susceptibilité magnétique (par rapport à la susceptibilité magnétique du tampon) et la signature du champ magnétique appliqué. Comme la densité et les propriétés magnétiques de la solution sont constantes dans tout le système, les propriétés de densité intrinsèque des cellules seront le principal facteur déterminant la hauteur de lévitation des cellules, les cellules plus denses lévitant moins que les cellules moins denses. Cette approche utilise un ensemble de deux billes de référence de densité (1,05 et 1,2 g/mL) qui nous permettent d’utiliser une analyse ratiométrique précise pour les mesures de densité. La modification de la concentration de la solution magnétique permet d’isoler différentes populations cellulaires, telles que les globules rouges des globules blancs, car la densité des cellules circulantes est spécifique à la cellule, éliminant ainsi le besoin de protocoles d’isolement ou d’autres manipulations cellulaires.

La majorité des méthodes de détection utilisées dans la recherche en biologie reposent sur l’extrapolation d’événements de liaison spécifiques en signaux linéaires faciles à quantifier. Ces méthodes de lecture sont souvent complexes et impliquent un équipement spécialisé et un personnel scientifique dédié. Une approche visant à la détection d’antigènes présents soit sur la membrane plasmique de cellules ou de vésicules extracellulaires, soit solubles dans le plasma, à l’aide d’une ou deux billes recouvertes d’anticorps, est décrite ici. Les perles doivent être de densités différentes les unes des autres et de celles des cibles interrogées. La présence de l’antigène cible dans un biofluide donné se traduit par un changement spécifique et mesurable de la hauteur de lévitation d’une cellule antigène positif liée à une bille de détection. Dans le cas d’antigènes solubles ou de vésicules extracellulaires, ils sont liés à la fois aux perles de capture et de détection, formant un complexe perle-perle plutôt qu’un complexe perle-cellule. Le changement de hauteur de lévitation dépend de la nouvelle densité des complexes perles-cellules ou perles-perles. Outre la modification de la hauteur de lévitation des complexes, qui indique la présence d’antigène dans le biofluide, le nombre de complexes dépend également de la quantité de cible, ce qui fait de la lévitation magnétique également une approche quantitative pour la détection d’antigènes24.

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Protocol

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Le protocole expérimental utilisé dans cette étude a été approuvé par le Beth Israel Deaconess Medical Center Institutional Review Board (IRB).

1. Configuration de l’instrument

REMARQUE: L’imagerie des cellules en lévitation nécessite que deux aimants en néodyme de terres rares magnétisés sur l’axe z soient placés avec le même pôle face à l’autre pour générer un champ magnétique. La distance entre les aimants peut être personnalisée en fonction de l’intensité du champ magnétique et de la densité des cibles. Dans ce cas, les aimants sont séparés par un espace suffisant de 1 mm pour l’insertion d’un tube capillaire en verre carré de 50 mm de long et 1x1 mm. L’appareil a été imprimé en 3D à l’aide d’une conception AutoCAD, disponible sur demande.

  1. Posez le microscope sur le côté, parfaitement horizontal.
    REMARQUE: Un microscope placé en position verticale standard n’est pas directement adapté à l’imagerie d’objets en lévitation en raison de la position des aimants par rapport au condensateur et à l’objectif. Cette limitation peut être contournée en posant le microscope sur le côté, parfaitement horizontal permettant au condensateur de focalisation de la lumière dans le capillaire, et à la lentille de l’objectif d’imager la cellule en lévitation entre les aimants, tout en maintenant les exigences d’éclairage de Köhler.
  2. Soutenez et nivelez le support sur une table à pain à l’aide de 2 ou 3 prises de laboratoire.
  3. Pour limiter les vibrations, soutenez la table de breadboard avec des pieds amortisseurs en caoutchouc.
  4. Retirez la scène et remplacez-la par une prise de laboratoire compacte pour régler la hauteur du dispositif de lévitation(axe y)et deux étages de translation à axe unique; un pour régler la mise au point(axe z),et le second pour scanner le tube capillaire.
  5. Fixez le dispositif de lévitation magnétique à la prise de laboratoire à l’aide de deux poteaux optiques mini-série.

2. Liaison de l’anticorps aux carboxy-microparticules/perles (modifié à partir d’un protocole par PolyAn)

REMARQUE: Seules les billes de faible densité (1,05 g / mL) doivent être recouvertes pour la détection Rh (+), mais les perles de haute et de faible densité sont recouvertes pour la détection des vésicules extracellulaires.

  1. Retirer 1 mg équivalent de suspension de billes et ajouter dans 0,5 mL de tampon d’activation (50 mM MES (MW195,2, 9,72 mg dans 1 mL)) pH 5,0 et 0,001 % Polysorbate-20).
  2. Ajouter 12 μL de 1,5 M EDC fraîchement préparé (MW 191,7, 0,28755 g dans 1 mL) et 12 μL de 0,3 M sulfo-NHS (MW 217,14, 0,0651 g dans 1 mL) dans de l’eau glacée.
  3. Placer les tubes sur un agitateur orbital et agiter vigoureusement pendant 1 h à température ambiante pour activer les groupes carboxyles sur les perles.
  4. Arrêtez l’activation après 1 h en ajoutant 0,5 mL de tampon de couplage (10x PBS, ou 0,1 M de phosphate pH 7-9).
  5. Ar coupez les billes en les centrifugant à 20 000 x g pendant 10 min ou, si les billes ne peuvent pas être granulées, utilisez un filtre à tube centrifuge de 0,45 μm. Aspirez le surnageant ou le débit.
  6. Lavez les billes avec 1 mL de 10x PBS 3 fois comme à l’étape 2.5.
  7. Calculer 25 μg d’anticorps par mg de billes et mélanger l’anticorps désiré avec les billes activées à une concentration finale d’anticorps de 0,7 à 1,0 mg / mL dans 10X PBS.
  8. Placez les tubes sur une bascule à tube réglée à basse vitesse. Rouler les tubes doucement à température ambiante pendant la nuit pour l’accouplement.
  9. Répétez l’étape 2.5 et lavez les billes deux fois avec 1 mL de PBS 10x.
  10. Laver avec 0,5 mL de 1 M d’éthanolamine (98 % de bouillon = 16,2 M) dans un tampon pH 8,0 avec 0,02 % de polysorbate-20 pendant 1 h à température ambiante tout en agitant doucement.
  11. Répétez l’étape 2.5 et lavez les billes une fois dans 1 mL de DPBS. Les billes peuvent être stockées dans 200 μL de DPBS à 4 °C jusqu’à ce que nécessaire.
    REMARQUE: Le protocole peut être mis en pause ici.

3. Collecte et préparation du sang pour la détection rh(+)

  1. À l’aide d’un autopiqueur en un clic, piquez le doigt d’un donneur Rh(+) et prélevez 10 μL de sang dans 1 mL de DPBS.
  2. Colorez les cellules Rh+ avec une coloration fluorescente de la membrane plasmique. Éventuellement, ajouter 1 μL de colorant fluorescent à la suspension de 1 mL de cellules Rh+ (dilution 1:1000).
  3. Incuber les cellules avec le colorant fluorescent à 37 °C pendant 15 min.
  4. Enrobez les cellules en les filant à 5 600 x g pendant 15 s et lavez 3 fois à l’aide de 1 mL de DPBS. Resuspendez dans 1 mL de HBSS avec du calcium et du magnésium (HBSS++).
  5. À l’aide de l’autopiqueur en un clic, piquez le doigt d’un donneur Rh(-) et prélevez 2 μL de sang.
    REMARQUE: Si vous préparez plus de 2 conditions, prélevez suffisamment de sang pour ajouter 1 μL de sang Rh(-) à chaque tube.
  6. Préparer les tubes expérimentaux nécessaires: perles seules, contrôle IgG, échantillon.
    1. Perles seules : ajoutez 174 μL de HBSS++, 1 μL de billes témoins IgG, 1 μL de billes haute densité (1,2 g/mL) et 24 μL de 500 mM Gd3+ (60 mM).
    2. Contrôle IgG : ajouter 172 μL de HBSS++, 1 μL de billes témoins IgG, 1 μL de billes haute densité, 1 μL de sang Rh,1 μL de suspension de sang Rh+ colorée et 24 μL de 500 mM Gd3+.
    3. Le tube d’échantillonnage ajoute 172 μL de HBSS++, 1 μL de billes enduites anti-RhD, 1 μL de perles à haute densité, 1 μL de sang Rh-, 1 μL de suspension de sang Rh(+) colorée et 24 μL de 500 mM Gd3+.
      REMARQUE: Des billes de haute densité sont ajoutées aux échantillons Rh à titre de référence.

4. Isolation des PMN pour la démonstration de la séparation cellulaire

  1. Isolement des neutrophiles
    1. Prélever 40 mL de sang veineux dans une seringue de 60 mL contenant 6 mL de citrate de sodium/acide citrique (0,15 M, pH 5,5) et 14 mL de Dextran-70 à 6 %.
    2. Attendez 50 minutes pour que le sang se sédimente.
    3. Superposez lentement les cellules du pelage bouffant sur 20 mL de Ficoll-Paque en poussant les 18 mL supérieurs à travers le tube de collecte de sang dans un tube de 50 mL, évitant ainsi la contamination par des globules rouges sédimentés. Il est recommandé d’utiliser un ensemble de prélèvement de sang frais, afin de minimiser la contamination par les globules rouges résiduels laissés dans le tube de prélèvement sanguin d’origine.
    4. A granuler les cellules du pelage bouffant par centrifugation pendant 20 min à 3 000 x g. Les neutrophiles et les globulesraux contaminants vont s’granuler au fond du tube. PBMC formera une couche blanche sur Ficoll-Paque.
    5. Transférer les neutrophiles dans un nouveau tube de 50 mL.
    6. Lyser les globules bouclés résiduels en incubant les neutrophiles avec 20 mL de solution froide de NaCl à 0,2 % pendant 25 secondes, suivie de 20 mL supplémentaires de NaCl à 1,6 %. La concertation finale de NaCl devrait être de 0,9% (isotonique).
    7. Centrifuger la suspension pendant 10 min à 3 000 x g.
    8. Retirez le surnageant et ressuspendez les neutrophiles à la concentration souhaitée.
  2. Isolement des lymphocytes
    1. Plaquer les PBLC dans RPMI avec 5% de sérum inactivé à la chaleur dans des plaques de culture à 6 puits.
    2. Incuber les plaques pendant 1 h à 37 °C. Les monocytes adhéreront à la plaque, les lymphocytes flotteront librement.
    3. Retirez le tampon contenant les lymphocytes et lavez-le deux fois avec RPMI.
    4. Resuspendez les lymphocytes à la concentration souhaitée.
  3. Étiqueter les globules, les PMN et les lymphocytes.
    1. Étiquetez chaque type de cellule avec un colorant fluorescent différent. Assurez-vous que chaque colorant fluoresce dans un canal différent. Suivez les instructions du fabricant pour chacun des colorants choisis.

5. Génération de vésicules extracellulaires RBC via l’activation du complément

  1. Obtenir du sang total par ponction veineuse à l’aide de tubes EDTA.
  2. Faire passer le sang à travers un filtre de globules blancs, puis centrifuger 3 fois à 500 x g pendant 10 min chacun pour isoler les globules rouges. Utilisez HBSS++ comme tampon de lavage.
  3. Fabriquez des aliquotes de globules rbc emballés à 100 μL dans des tubes de 1,5 mL et augmentez le volume à 1 mL en ajoutant HBSS++.
  4. Ajouter C5b,6 à une concentration finale de 0,18 μg/mL dans HBSS++, puis vortex.
  5. Mettez un agitateur lent à température ambiante pendant 15 min.
  6. Ajouter la protéine C7 à une concentration finale de 0,2 μg/mL. Mélanger en inversant doucement le tube plusieurs fois. Ne pas tourbillon à partir de ce point.
  7. Placez le tube sur un agitateur à tube réglé à basse vitesse pendant 5 min à température ambiante.
  8. Ajouter la protéine C8 à une concentration finale de 0,2 μg/mL et la protéine C9 à 0,45 μg/mL. Mélanger en inversant doucement les tubes plusieurs fois.
  9. Incuber à 37 °C pendant 30 min.
  10. Centrifuger le tube à 10 000 x g pendant 10 min.
  11. Recueillez le surnageant contenant du VE dans un ou plusieurs nouveaux tubes. Ne faites pas trembler le surnageant trop près de la pastille cellulaire.

6. Analyse des cellules sur le dispositif de lévitation magnétique

  1. Effectuez le démarrage de l’instrument conformément aux instructions du fabricant.
  2. Charger 50 μL d’échantillon dans un tube capillaire jusqu’à ce que le tube soit rempli. Scellez les extrémités du tube capillaire avec du scellant capillaire en vous assurant qu’il n’y a pas de bulles d’air présentes.
  3. Chargez le tube capillaire dans le support entre les aimants supérieurs et inférieurs. Ajustez la scène et la mise au point pour une visualisation optimale.
    REMARQUE: Les cellules / perles peuvent prendre de 5 à 20 minutes pour atteindre leur position d’équilibre magnétique en fonction de leur densité et de la concentration de Gd3+. Plus la concentration de Gd3+est élevée, plus le temps est court.

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Results

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La lévitation magnétique concentre des objets de différentes densités à différentes hauteurs de lévitation en fonction de la densité de l’objet, de sa signature magnétique, de la concentration de solution paramagnétique et de la force du champ magnétique créé par deux aimants puissants de terres rares. Comme les deux aimants sont placés l’un sur l’autre, les échantillons en lévitation ne peuvent être vus, tout en maintenant l’éclairage de Köhler, qu’à l’aide d’un microscope tourné sur le côté(Figure ...

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Discussion

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La centrifugation par gradient est actuellement la technique standard pour isoler les composants subcellulaires en fonction de leurs densités uniques. Cette approche nécessite toutefois l’utilisation de milieux de gradient spécialisés ainsi que d’équipements de centrifugeuse. L’approche de lévitation magnétique présentée ici permet une étude détaillée des propriétés morphologiques et fonctionnelles des cellules circulantes, avec un minimum, voire aucune manipulation des cellules, fournissant un accès quasi in vivo

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Disclosures

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Les auteurs n’ont aucun conflit à divulguer.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les auteurs tiennent à remercier le Dr Getulio Pereira pour son aide dans le travail sur les vésicules extracellulaires.

Ce travail a été soutenu par les subventions suivantes de l’Institut national de la santé à iCG: RO1CA218500, UG3HL147353 et UG3TR002881.

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Acide 2-(N-Morpholino)éthanesulfonique hydratéSigma AldrichM-2933(MES) ; composant du tampon d’activation
Aimants 50x2,5x1 mm, plaqué nickel (Ni-Cu-Ni), grade N52, aimanté sur 5mm (0,197") d’épaisseurK& J MagneticsAimants personnalisés utilisés pour le dispositif de lévitation magnétique
Mastic pour tubes capillaires (Critoseal)Leica Microsystems267620Utilisé pour boucher les extrémités des tubes capillaires
Filtres pour tubes à centrifuger (Corning, Costar, Spin-X)Sigma AldrichCLS8163Utilisé pour laver les billes
Compact Lab JackThorlabsLJ750Utilisé pour régler le dispositif de lévitation magnétique
DPBS, sans calcium, sans magnésiumGibco14190-144Solution pour suspensions de billes
EthanolamineSigma AldrichE9508-100MLUtilisé lors d’une étape de lavage pour billes
Teinture à membrane plasma fluorescente (CellMask Green)InvitrogenC37608Utilisé pour colorer les cellules Rh+
Gadoteridol InjectionProHanceNDC 0270-1111-03Gadolinium (Gd3+) ; solution magnétique utilisée pour suspendre les cellules
HBSS++Gibco14025-092Solution pour la préparation d’échantillons
Humain C5b,6complexe Technologie du complément, IncA122Utilisé pour générer la
protéine C7 humaineEvs Technologie du complément, IncA124Utilisé pour générer la
protéine C8 humaineRBC Evs Technologie du complément, IncA125Utilisé pour générer des globules rouges
Evs Human C9protein Complement Technology, IncA126Utilisé pour générer des colliers de poteau RBC Evs
Mini SeriesThorlabsMSR2Utilisé pour fixer le dispositif de lévitation magnétique aux prises de laboratoire
N-(3-Dimethylaminopropyl)-N&prime ;-ethylcarbodiimide chlorhydrate SigmaAldrichE1769-10G(EDC) ; utilisé dans la réaction de couplage
d’anticorps Contrôle normal des IgGde lapinR& D SystemsAB-105-CUtilisé pour revêtir les billes en tant que condition de contrôle
Solution saline tamponnée au phosphate (solution 10X, pH 7,4)Boston BioproductsBM-220Composant du tampon de couplage, utilisé pour les étapes de lavage
Polysorbate 20 (Tween 20)Sigma AldrichP7949-500MLComposant du tampon d’activation
Polystyrène carboxyleComposite Bangs LaboratoriesPC06004Perles de haute densité (1,05 g/mL), utilisées pour le couplage d’anticorps
Rabbit RhD Anticorps polyclonalInvitrogenPA5-112694Utilisé pour enrober les billes pour la détection du facteur Rh dans les globules rouges
Microscope de qualité rechercheOlympusProvis AX-70Microscope utilisé pour monter un dispositif de lévitation magnétique et visualiser les cellules en lévitation
Pieds amortisseurs en caoutchoucThorlabsRDF1Utilisé pour supporter la table d’essai
Tube carré BoroVitroTubes8100-050Tube capillaire utilisé pour le chargement d’échantillons dans Maglev
Sulfo-NHSThermoscientific24510Utilisé dans la réaction de couplage d’anticorps
Etape translationnelleThorlabsPT1Utilisé pour la focalisation et pour le balayage du tube capillaire
RBC

References

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