Marquage immunofluorescent de protéines de virus végétaux et d’insectes vecteurs dans les intestins d’hémiptères

Résumé

Ce protocole de marquage immunofluorescent des protéines virales végétales et des protéines d’insectes vecteurs dans les intestins d’insectes excisés peut être utilisé pour étudier les interactions entre les insectes virus et vecteurs, les fonctions des protéines d’insectes et les mécanismes moléculaires sous-jacents à la transmission du virus.

Résumé

La plupart des virus végétaux dans la nature sont transmis d’une plante à l’autre par des insectes hémiptères. Une forte densité de population d’insectes vecteurs qui sont très efficaces pour la transmission du virus joue un rôle clé dans les épidémies de virus dans les champs. L’étude des interactions virus-insecte vecteur peut faire progresser notre compréhension de la transmission virale et des épidémies dans le but de concevoir de nouvelles stratégies pour contrôler les virus végétaux et leurs insectes vecteurs. Le marquage par immunofluorescence a été largement utilisé pour analyser les interactions entre les agents pathogènes et les hôtes et est utilisé ici chez la cicadelle à dos blanc (WBPH, Sogatella furcifera), qui transmet efficacement le virus nain strié noir du riz du sud (SRBSDV, genre Fijivirus, famille Reoviridae), pour localiser les virions et les protéines d’insectes dans les cellules épithéliales de l’intestin moyen. À l’aide de la microscopie confocale à balayage laser, nous avons étudié les caractéristiques morphologiques des cellules épithéliales de l’intestin moyen, la localisation cellulaire des protéines d’insectes et la colocalisation de virions et d’une protéine d’insecte. Ce protocole peut être utilisé pour étudier les activités virales chez les insectes, les fonctions des protéines d’insectes et les interactions entre le virus et l’insecte vecteur.

Introduction

La plupart des virus végétaux décrits sont transmis par des insectes de l’ordre des hémiptères qui comprend les pucerons, les aleurodes, les cicadelles, les cicadelles et les thrips ^1,2. Les pièces buccales perçantes-suceuses des insectes hémiptères percent le tissu végétal pour nourrir et sécréter de la salive, transmettant simultanément efficacement le virus². Différents mécanismes de transmission des virus végétaux par les insectes vecteurs ont été décrits. Ceux-ci incluent non persistant, semi-persistant et persistant. Le type persistant est soit non multiplicatif, soit

Protocole

1. Élevage d’insectes non virulifères

1. Collecter les WBPH dans les rizières et les élever avec des plants de riz dans des béchers en verre de 1 L recouverts d’un filet anti-insectes dans un incubateur à 28 °C avec 16 h de lumière et 8 h d’obscurité. Comme le SRBSDV n’est pas transmis par les œufs, les nymphes nouvellement écloses ne sont pas virulifères.
2. À l’aide d’un stylo-brosse, brosser doucement les insectes du bécher dans un nouveau bécher de plants de riz frais chaque semaine jusqu’à ce que les nymphes WBPH aient éclos. Continuez à élever ces nymphes non virulifères écloses à 2 ou 3 étoiles.
   REMARQUE: Brossez soigneusement pour éviter que l....

Résultats

La figure 1 illustre toutes les étapes de ce protocole : élevage d’insectes, acquisition de virus, excision de l’intestin, marquage immunofluorescent et fabrication de la lame.

Les intestins de WBPH excisés des adultes ont été fixés dans du paraformaldéhyde à 4% (m / v), perméabilisés avec 2% (v / v) Triton X-100, puis incubés avec Dylight 633 phalloïdine^10,18. La micrographie confocale à balayage laser de.......

Discussion

Pour de meilleurs résultats, quelques points clés doivent être pris en compte. Tout d’abord, un ratio élevé d’insectes virulifères par rapport à la population totale est nécessaire. Bien que le PAA minimum pour le SRBSDV par les nymphes et les adultes de WBPH soit de 5 min¹⁷, les insectes devraient être autorisés à se nourrir de plants de riz frais infectés par le SRBSDV pendant 2 jours pour atteindre une efficacité d’acquisition allant jusqu’à 80%. Étant donné que les virions SRBSDV peuvent être .......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
3 % d’albumine sérique de taureau (BSA)	Coolaber	SL1331	Anticorps dilués
Verre de couverture	Solarbio	YA0771-18*18mm	Pour la fabrication de lames
Microscope de dissection	Beitja	XTL-7045B1	Pour la dissection d’insectes
Microscope confocal à balayage laser	Zeiss Zeiss	LSM880	Observer le signal de fluorescence
Lames de microscope	Solarbio	ZBP-7105	Pour la fabrication de diapositives
Support de montage avec 4'6-diamidino-2-phénylindole (DAPI)	Abcam	AB104139	Label cellulaire necleus
Paraformaldehyde	Sigma	158127	Pour la fixation des tissus
Phalloidin	; Invitrogen	A22284	Marquage de l’actine des épithiles de l’intestin moyen
Triton X-100	Amresco	0290C484	Pour la perméation des tissus
Pince à épiler (5-SA)	AsOne	6-7905-40	Pour la dissection d’insectes