L’utilisation de la technique Patch-Clamp pour étudier la capacité thermogénique des mitochondries

Résumé

Cet article sur la méthode détaille les principales étapes de la mesure de la fuite H⁺ à travers la membrane mitochondriale interne avec la technique patch-clamp, une nouvelle approche pour étudier la capacité thermogénique des mitochondries.

Résumé

La thermogenèse mitochondriale (également connue sous le nom de découplage mitochondrial) est l’une des cibles les plus prometteuses pour augmenter la dépense énergétique afin de lutter contre le syndrome métabolique. Les tissus thermogéniques tels que les graisses brunes et beiges développent des mitochondries hautement spécialisées pour la production de chaleur. Les mitochondries d’autres tissus, qui produisent principalement de l’ATP, convertissent également jusqu’à 25% de la production totale d’énergie mitochondriale en chaleur et peuvent donc avoir un impact considérable sur la physiologie de tout le corps. La thermogenèse mitochondriale est non seulement essentielle pour maintenir la température corporelle, mais prévient également l’obésité induite par l’alimentation et réduit la production d’espèces réactives de l’oxygène (ROS) pour protéger les cellules des dommages oxydatifs. Étant donné que la thermogenèse mitochondriale est un régulateur clé du métabolisme cellulaire, une compréhension mécaniste de ce processus fondamental aidera au développement de stratégies thérapeutiques pour lutter contre de nombreuses pathologies associées au dysfonctionnement mitochondrial. Il est important de noter que les mécanismes moléculaires précis qui contrôlent l’activation aiguë de la thermogenèse dans les mitochondries sont mal définis. Ce manque d’information est en grande partie dû à une pénurie de méthodes pour la mesure directe des protéines de découplage. Le développement récent de la méthodologie patch-clamp appliquée aux mitochondries a permis, pour la première fois, l’étude directe du phénomène à l’origine de la thermogenèse mitochondriale, de la fuite H⁺ à travers l’IMM, et de la première caractérisation biophysique des transporteurs mitochondriaux qui en sont responsables, la protéine de découplage 1 (UCP1), spécifique des graisses brunes et beiges, et le transporteur ADP/ATP (AAC) pour tous les autres tissus. Cette approche unique fournira de nouvelles informations sur les mécanismes qui contrôlent les fuites H⁺ et la thermogenèse mitochondriale et sur la façon dont ils peuvent être ciblés pour lutter contre le syndrome métabolique. Cet article décrit la méthodologie patch-clamp appliquée aux mitochondries pour étudier leur capacité thermogénique en mesurant directement les courants H⁺ à travers l’IMM.

Introduction

Les mitochondries sont célèbres pour être la centrale électrique de la cellule. En effet, ils sont la principale source d’énergie chimique, l’ATP. Ce que l’on sait moins, c’est que les mitochondries génèrent également de la chaleur. En fait, chaque mitochondrie génère constamment les deux types d’énergies (ATP et chaleur) et un équilibre fin entre les deux formes d’énergie définit l’homéostasie cellulaire métabolique (Figure 1). Comment les mitochondries distribuent l’énergie entre l’ATP et la chaleur est certainement la question la plus fondamentale dans le domaine de la bioénergétique, bien qu’elle soit encore largement inconnue. Nous s....

Protocole

Toutes les procédures expérimentales sur les animaux qui ont été effectuées sont conformes aux directives des National Institutes of Health et ont été approuvées par le Comité institutionnel de soins et d’utilisation des animaux de l’Université de Californie à Los Angeles (IACUC).

REMARQUE: La procédure d’isolement mitochondrial est basée sur la centrifugation différentielle et varie légèrement d’un tissu à l’autre. Par exemple, comme le tissu adipeux brun est extrêmement riche en lipides, il nécessite une étape supplémentaire pour séparer les débris cellulaires et les organites de la phase lipidique avant de récolter les mitochondries. Pou....

Résultats

Le développement de la méthodologie patch-clamp appliquée aux mitochondries a fourni la première étude directe de la fuite H⁺ à travers l’IMM et les transporteurs mitochondriaux, UCP1 et AAC, qui en sont responsables. L’analyse électrophysiologique des fuites H⁺ dépendantes de l’UCP1 et de l’AAC peut fournir un premier aperçu de la capacité thermogénique des mitochondries. La section des résultats décrit les procédures standard pour mesurer ^{les fuites H+} via UCP1 et AAC.

Discussion

Cet article sur la méthode vise à présenter la technique patch-clamp récemment appliquée aux mitochondries, une nouvelle approche pour étudier directement la fuite H⁺ à travers l’IMM responsable de la thermogenèse mitochondriale ^5,6,7,15. Cette technique ne se limite pas aux tissus et peut également être utilisée pour analyser les fuites H⁺ et d’autres conductances de l’IM.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
0,1 % gélatine	Millipore	ES-006-B
60X Objectif à immersion dans l’eau, ouverture numérique 1,20	Olympus	UPLSAPO60XW
Axopatch 200B	amplificateur Dispositifs moléculaires Capillaires
en verre borosilicaté	Sutter Instruments	BF150-86-10
Digidata 1550B Numériseur	Dispositifs
Cage de Faraday	Homemade
French Press	Glen Mills	5500-000011
IKA Eurostar PWR CV S1 Agitateur
suspendu Microscope inversé	Olympus	IX71 ou IX73
Micro Forge	(Narishige)	MF-830
Micromanupulateur MPC-385	Sutter Instruments	FG-MPC325
Porte-microélectrode pour pont en gélose	World Precision Instruments	MEH3F4515
Extracteur de micropipettes	(Sutter Instruments)	P97
Mini Cell pour French Press	Glen Mills	5500-FA-004
MÉLANGEUR IKA 6-2000RPM	Cole Parmer	EW-50705-50
Objectif Grossissement 100X	Objectif Nikon	MPlan 100/0.80 ELWD 210/0
pClamp 10	Dispositifs
Chambre de perfusion	Warner Instruments	RC-24E
Potter-Elvehjem homogénéisateur 10 ml	Wheaton	358039
Centrifugeuse réfrigérée SORVALL X4R PRO-MD	Thermo Scientific	75 009 521
Petites lamelles rondes en verre : 5 mm de diamètre, 0,1 mm d’épaisseur	Warner Instruments	640700
Table d’isolation vibratoire	Newport	VIS3036-SG2-325A
Chemicals
D-gluconic	acid Sigma Aldrich	G1951
D-mannitol	; Sigma Aldrich	M4125
EGTA&	nbsp ; Sigma Aldrich	3777
HEPES	·’sp ; Sigma Aldrich	H7523
KCl	; Sigma Aldrich	60128
MgCl2	; Sigma Aldrich	63068
saccharose	; Sigma Aldrich	S7903
TMA	; Sigma Aldrich	331635
TrisBase	; Sigma Aldrich	T1503
TrisCl	; Sigma Aldrich	T3253