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Une méthode de notation microscopique automatisée pour le test de foyers γ-H2AX dans les lymphocytes du sang périphérique humain

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DOI :

10.3791/62623

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25 décembre 2021

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1Radiation Biophysics Division, Nuclear Medicine Department, iThemba LABS, 2Department of Biotechnology, University of the Western Cape, 3Department of Medical Biosciences, University of the Western Cape, 4Division of Medical Physiology, Department of Medicine and Health Sciences, Stellenbosch University, 5Biodosimetry Service, Instituto de Investigaciones Biológicas Clemente Estable and Academic Unit on Radiation Protection, Faculty of Medicine, University of the Republic, 6MetaSystems Hard & Software GmbH

Dans cet article

Résumé

Ce protocole présente la préparation des lames et la notation automatisée du test des foyers γ-H2AX sur les lymphocytes du sang périphérique. Pour illustrer la méthode et la sensibilité du test, des lymphocytes isolés ont été irradiés in vitro. Cette méthode automatisée de détection de l’ADN DSB est utile pour les applications de dosimétrie biologique rapides et à haut débit.

Résumé

Les rayonnements ionisants sont un puissant inducteur des dommages à l’ADN et un cancérogène bien documenté. La dosimétrie biologique comprend la détection des effets biologiques induits par l’exposition aux rayonnements ionisants pour effectuer une évaluation individuelle de la dose. Ceci est pertinent dans le cadre des urgences radiologiques, où les évaluations de la santé et la planification du traitement clinique pour les victimes exposées sont essentielles. Étant donné que les cassures double brin d’ADN (DSB) sont considérées comme la forme la plus mortelle de dommages à l’ADN induits par les radiations, ce protocole présente une méthode pour détecter l’ADN DSB dans les échantillons de sang. La méthodologie est basée sur la détection d’une protéine de réparation de l’ADN phosphorylé marquée par fluorescence, à savoir γ-H2AX. L’utilisation d’une plate-forme de microscopie automatisée pour noter le nombre de foyers γ-H2AX par cellule permet une analyse standardisée avec une diminution significative du délai d’exécution. Par conséquent, le test γ-H2AX a le potentiel d’être l’un des tests les plus rapides et les plus sensibles pour la dosimétrie biologique. Dans ce protocole, des échantillons de sang total provenant de volontaires adultes en bonne santé seront traités et irradiés in vitro afin d’illustrer l’utilisation du test automatisé et sensible γ-H2AX pour les applications de biodosimétrie. Un système automatisé de balayage de diapositives et une plate-forme d’analyse avec un microscope à fluorescence intégré sont utilisés, ce qui permet la notation rapide et automatique de l’ADN DSB avec un degré de biais réduit.

Introduction

Depuis sa découverte, les rayonnements ionisants (RI) sont devenus un outil indispensable dans les pratiques médicales et industrielles actuelles, ainsi que dans les applications agricoles et militaires. Cependant, l’utilisation généralisée de l’IR augmente également le risque de surexposition aux rayonnements tant pour les travailleurs professionnels des rayonnements que pour les membres du public. L’IR est un cancérogène physique bien connu qui peut induire des dommages à l’ADN de manière directe ou indirecte, entraînant des risques importants pour la santé 1,2. Par conséquent, il est important d’effectuer une évaluation de la dose, car le degré d’exposition constitue une première étape importante dans la gestion de l’accident radiologique 1.

En cas d’urgence nucléaire ou radiologique à grande échelle, le nombre d’évaluations de dose à effectuer peut varier de quelques à des milliers de personnes selon l’ampleur de l’accident3. Dans ces scénarios, la dosimétrie physique peut également être ambiguë (p. ex., si le dosimètre n’est pas porté correctement) ou indisponible, lorsque des membres du public sont impliqués. Bien que les symptômes cliniques puissent être utilisés pour le triage, ils ne sont pas nécessairement spécifiques à la radiothérapie et peuvent entraîner un faux diagnostic. Par conséquent, il est conseillé d’utiliser la dosimétrie biologique parallèlement à la dosimétrie physique et aux évaluations cliniques. Cette méthode permet l’analyse des changements radio-induits au niveau cellulaire et permet l’identification sans équivoque des individus exposés qui nécessitent un traitement médical4. Le médecin peut ensuite utiliser cette évaluation de la dose biologique pour compléter les reconstructions de dose physique et d’autres diagnostics cliniques, afin de prescrire les soins médicaux appropriés5. Le besoin de dosimétrie biologique sera particulièrement important pour le triage et la prise en charge médicale des victimes lorsque le scénario d’exposition n’est pas bien connu et que les victimes sont des membres du public. L’objectif principal du triage est de distinguer efficacement les personnes « bien inquiètes », qui pourraient présenter des symptômes prodromiques mais qui n’ont pas reçu une dose élevée, des personnes exposées ayant besoin d’une aide médicale immédiate et de soins spécialisés. Le niveau seuil de dose de rayonnement pouvant causer le mal des rayonnements est d’environ 0,75 à 1,00 Gy. Ensuite, les personnes qui reçoivent > 2 Gy d’exposition sont plus à risque de syndrome d’irradiation aiguë et devraient recevoir un traitement médical rapide6,7. Il est essentiel d’estimer en temps opportun et avec précision les doses biologiques pour les victimes prises dans les tirs croisés de telles catastrophes. De plus, il peut également réconforter et rassurer les victimes peu exposées8.

Les autorités de radioprotection utilisent divers marqueurs de biodosimétrie, qui sont principalement basés sur la détection de dommages cytogénétiques, tels que les chromosomes dicentriques ou les micronoyaux, dans les lymphocytes humains en culture9. La détection des dommages cytogénétiques peut également être effectuée par le test de translocation par hybridation fluorescente in situ (FISH)10. Cependant, l’inconvénient majeur des méthodes cytogénétiques conventionnelles est le long délai d’exécution pour obtenir les résultats dans une situation d’urgence8.

L’une des premières étapes du processus de reconnaissance de l’ADN DSB est la phosphorylation de la variante d’histone H2AX, conduisant à la formation de γ-H2AX et au recrutement ultérieur de facteurs de réparation. Au cours de la dernière décennie, la détection des foyers γ-H2AX radio-induits dans les lymphocytes du sang périphérique à l’aide de la microscopie par immunofluorescence a fait l’objet d’une attention croissante en tant qu’outil de dosimétrie biologique fiable11,12, 13,14,15. Selon la qualité du rayonnement et le type de cellule, le rendement maximal des foyers γ-H2AX est détecté dans les 0,5 à 1 heure suivant l’irradiation16,17. On s’attend à ce qu’il existe une corrélation étroite entre le nombre de foyers d’ADN DSB et de γ-H2AX, ainsi qu’entre la disparition des foyers et la réparation de DSB. Des expériences de ciseaux laser avec un microfaisceau laser pulsé ont démontré que les foyers γ-H2AX se localisent sur les sites de l’ADN DSB18. Bien que cela reste un sujet de débat actif, l’une des premières études avec 125j’ai suggéré une corrélation un-à-un entre le nombre calculé de désintégrations par cellule (représentable pour le nombre d’ADN DSB radio-induit) et le nombre de foyers γ-H2AX qui a été noté19,20.

Au cours de la dernière décennie, l’Union européenne a financé les projets MULTIBIODOSE (Multi-disciplinary biodosimetric tools to manage high scale radilogical casualties) et RENEB (Realizing the European Network of Biodosimetry) pour créer un réseau durable en dosimétrie biologique et rétrospective21,22. Ce projet comprenait divers laboratoires à travers l’Europe pour évaluer les capacités d’intervention d’urgence en cas d’urgence radiologique14,21,22. Le test de foyers γ-H2AX présente un certain nombre d’avantages considérables, tels qu’un temps de traitement rapide, la possibilité d’un traitement par lots permettant un débit élevé, ainsi que sa sensibilité élevée s’il est utilisé quelques heures après l’exposition.13,23,24. La sensibilité élevée du test dans la gamme de faibles doses a donné lieu à un certain nombre d’études où le test de foyers γ-H2AX a été utilisé comme indicateur de l’effet de l’exposition aux rayonnements médicaux, à la fois en radiothérapie et dans les applications d’imagerie diagnostique.25,26,27,28,29,30. Ces caractéristiques font du test de foyers γ-H2AX une alternative très compétitive aux autres méthodes de triage précoce dans les grands accidents nucléaires afin de séparer les personnes gravement exposées des personnes à faible risque. Plusieurs expériences d’optimisation ont montré qu’il est possible d’effectuer le test des foyers γ-H2AX avec de petits volumes de sang, comme l’étude de Moquet et al. qui ont rapporté qu’il est possible d’effectuer le test des foyers γ-H2AX avec seulement une goutte de sang (piqûre au doigt)31. Une approche similaire a été utilisée dans le développement du système RABIT (Rapid Automated Biodosimetry Tool) à haut débit entièrement automatisé, optimisé pour mesurer les rendements en γ-H2AX à partir d’échantillons de sang dérivés de bâtons de doigts.32,33. Dans l’ensemble, les résultats des études d’intercomparaison MULTIBIODOSE et RENEB suggèrent que le test des foyers γ-H2AX pourrait être un outil de triage très utile à la suite d’une exposition aiguë récente (jusqu’à 24 heures) aux rayonnements12,13,14. Dans une étude inter-comparaison de plage de faibles doses, une dose aussi faible que 10 mGy a pu être distinguée des échantillons témoins irradiés simulés, soulignant la sensibilité du test dans la plage de faibles doses34. Il est important de noter que la sensibilité élevée du test est particulièrement vraie pour les lymphocytes, ce qui en fait l’un des types de cellules les plus appropriés pour l’évaluation des expositions à de faibles doses. Les lymphocytes sont principalement des cellules non cycliques et représentent une population synchrone. Ce dernier évite l’expression de γ-H2AX est associé à la réplication de l’ADN, ce qui réduit considérablement la sensibilité du test à détecter le DSB radio-induit pendant la phase G2 et S du cycle cellulaire.35. En plus de sa sensibilité aux faibles doses pour les lymphocytes, le délai d’exécution du test de foyers γ-H2AX est significativement plus rapide que les techniques cytogénétiques telles que le test dicentrique et le test du micronoyau, car il ne nécessite pas la stimulation des lymphocytes. Par conséquent, les résultats peuvent être obtenus en quelques heures par rapport à quelques jours pour les techniques cytogénétiques. Un inconvénient majeur du test est la disparition rapide du signal de foyer γ-H2AX, qui sera normalement réduit aux niveaux de base dans les jours suivant l’exposition au rayonnement en fonction de la cinétique de réparation de l’ADN.36. Par conséquent, l’application la plus appropriée du test dans un contexte de biodosimétrie est à des fins de triage initial et de donner la priorité à un suivi plus long de la dosimétrie biologique cytogénétique pour certaines victimes. Cependant, pour une biodosimétrie rétrospective précise et des effets à long terme, il faut s’appuyer sur des techniques cytogénétiques telles que les analyses FISH tricolores pour la détection d’aberrations chromosomiques stables au cas où l’exposition aurait eu lieu il y a plusieurs années.10.

Dans le cadre de plusieurs initiatives de biodosimétrie, plusieurs essais ont été évalués à des fins de triage à côté du test de foyers γ-H2AX pour trier les personnes en cas d’urgence radiologique à grande échelle; tels que le test dicentrique, le test de micronoyau en bloc de cytocinèse, la résonance paramagnétique électronique (EPR), le test de protéine sérique (SPA), le test de mouchetures cutanées (SSA), la luminescence stimulée optiquement (OSL), ainsi que l’analyse de l’expression génique 37,38. Le test de foyers γ-H2AX peut être utilisé quantitativement pour l’évaluation de la formation et de la réparation de l’ADN DSB39. Cependant, le test dépend du temps car le niveau de foyers γ-H2AX varie avec le temps après l’irradiation en raison de la cinétique de réparation de l’ADN DSB40. Une étude comparative a montré que le scoring microscopique avec une capacité d’étage Z offre les résultats les plus précis après 1 Gy d’irradiation, tandis que la cytométrie en flux ne donne des résultats fiables qu’à des doses plus élevées d’IR41. Il existe de nombreux rapports sur le développement de solutions d’analyse d’images à utiliser dans la notation automatisée42,43,44,45,46. Dans ce protocole, une plate-forme de microscopie fluorescente automatisée à haut débit est utilisée pour analyser les foyers γ-H2AX dans les lymphocytes du sang périphérique. L’utilisation d’un système de notation automatique évite à la fois le biais de notation inter-laboratoire et inter-observateur, tout en permettant une sensibilité suffisante pour détecter les doses inférieures à 1 Gy47. Le principal avantage de ce système par rapport aux logiciels open source gratuits pour la notation des foyers est le fait que le processus complet, de la numérisation des diapositives à la capture et à la notation, est automatisé. Le concept de classificateurs définissables et stockables par l’utilisateur garantit une reproductibilité qui ajoute un degré de qualité impartial aux résultats. Par conséquent, ce travail illustre comment les résultats des foyers γ-H2AX peuvent être obtenus à l’aide d’une méthode automatisée de balayage et de notation microscopiques qui peut être utilisée lorsque des échantillons de sang d’individus potentiellement surexposés sont reçus par les laboratoires de radiobiologie à des fins de dosimétrie biologique.

Protocole

Cette étude a été approuvée par le Comité d’éthique de la recherche biomédicale du Comité d’éthique de l’Université du Cap-Occidental - Code BM18/6/12.

1. Préparation des solutions48

  1. Solution de fixation cellulaire (3% PFA dans PBS)
    1. Porter l’équipement de protection individuelle (EPI) approprié et, en travaillant dans une hotte, ajouter 20 g de paraformaldéhyde à 200 mL deH2Odistillé. Chauffer le mélange à 60 °C pour faciliter la dissolution.
    2. Une fois le PFA dissous, ajouter 40 gouttes de 5 N NaOH soigneusement pendant 30 minutes et refroidir à la température ambiante. Ajuster à pH 7 à l’aide de 1 M HCl et porter à un volume final de 250 mL avec duH2Odistillé (les aliquotes peuvent être conservées à -20 °C pendant 1 an). Ajouter 25 mL de cette solution à 41,7 mL de PBS pour obtenir une solution de PFA à 3%.
  2. Solution d’albumine sérique bovine (BSA) à 1 % : Ajouter 10 g de BSA à 1000 mL de PBS et mélanger jusqu’à dissolution. Conserver à 4 °C jusqu’à utilisation (maximum 72 heures).
  3. Solution de Triton-X à une concentration de 1:500 : Ajouter 1 μL de Triton-X à 500 μL de PBS, conserver à 4 °C jusqu’à utilisation (maximum 24 heures).
  4. Solutions d’anticorps
    1. Anticorps primaire - Anti-γ-H2AX à une concentration de 1:500 : Ajouter 1 μL d’anti-γ-H2AX à 500 μL de solution de BSA à 1 %, conserver à 4 °C jusqu’à utilisation (maximum 24 heures).
    2. Anticorps secondaire - DAM-TRITC à la concentration de 1:1000: Ajouter 1 μL de DAM-TRITC à 1000 μL de solution de BSA à 1%, conserver à 4 °C jusqu’à utilisation (maximum 24 heures).
  5. Compléter roswell park memorial institute (cRPMI) Médias
    1. Ajouter le sérum fœtal bovin (FBS) filtré et la pénicilline-streptomycine au milieu RPMI 1640 dans un flacon stérile pour obtenir une concentration finale de 10% FBS et 1% de pénicilline-streptomycine.

2. Préparation des échantillons

REMARQUE: Pour ce protocole, des échantillons de sang total périphérique sont prélevés par ponction veineuse dans des tubes de prélèvement de lithium-héparine chez des volontaires adultes en bonne santé (avec le consentement éclairé - BM18/6/12 Biomedical Research Ethics Committee of The University of Western Cape Ethics Committee). Avant de commencer, assurez-vous que le sang et le milieu de densité de 1,077 g/mL sont acclimatés à la température ambiante.

  1. Dans une armoire de biosécurité préparée, diluer le sang total périphérique dans un volume de 1:1 avec du PBS et superposer doucement le sang dilué sur un volume égal à deux volumes de milieu d’une densité de 1,077 g/mL. Il est important de superposer progressivement le sang sur le milieu de densité en maintenant le tube incliné à 45°, en veillant à ce que le sang et le milieu de densité ne se mélangent pas.
  2. Transférer délicatement la suspension dans une centrifugeuse et tourner à 900 x g pendant 20 minutes. Par la suite, pipettez la couche « trouble » uniquement dans un nouveau tube conique stérile et remplissez le tube de PBS et de centrifugeuse pendant 10 minutes à 1000 x g. Par la suite, aspirez le surnageant avec une pipette, en veillant à ne pas déranger la pastille, remettez soigneusement la pastille PBMC dans 1 mL pbS et remplissez le tube avec PBS.
  3. Répétez l’étape de lavage ci-dessus deux fois de plus pour obtenir un total de trois lavages.
  4. Comptez le nombre de PBMC à l’aide d’un hémocytomètre, sachez que chaque mL de sang périphérique d’un donneur adulte entraînera une moyenne approximative de 1 - 1,5 x10 6 PBMC49. Après comptage, diluer la pastille de PBMC à une concentration de 8 x 105 lymphocytes dans 1 mL de cRPMI. Ajoutez ensuite environ 2 x 106 PBMC ou 2,5 mL de la solution isolée de PBMC dans un tube conique stérile pour les irradiations.

3. Irradiations d’échantillons

ATTENTION : Manipulez l’unité de rayonnement conformément aux directives de radioprotection et portez un dosimètre physique en tout temps. S’assurer que le système d’irradiation utilisé est étalonné et configuré de manière à ce que les doses attendues correctes soient atteintes.

  1. Irradier les PBMC à température ambiante à l’aide d’une source de 60Co. Étalonner (protocole TRS-398) avec une chambre Farmer 117 pour laquelle un facteur d’étalonnage de chambre obtenu auprès de l’Institut national de métrologie d’Afrique du Sud (NMISA)50.
    1. Pour ce dosage, placez les tubes coniques entre une feuille acrylique de 5 mm (utilisée pour l’accumulation de l’entrée du faisceau) et un matériau de rétrodiffusion de 50 mm avec le débit de dose actuel de la source 60Co de 0,57 Gy/min pour une taille de champ homogène de 300 mm × 300 mm à une distance source-surface de 750 mm.
  2. Irradier les PBMC avec des doses graduées de 0,125, 0,500, 1 000, 1 500 et 2 000 Gy, et maintenir les échantillons témoins irradiés simulés, dans la salle de contrôle, en ne recevant qu’une exposition au rayonnement ambiant.
  3. Incuber les échantillons irradiés pendant 1 heure à 37 °C dans un incubateur humidifié à 5% de CO2 afin d’atteindre le nombre maximum de foyers γ-H2AX.
    REMARQUE: Le temps d’incubation peut être modifié en fonction de la conception expérimentale.

4. Préparation des diapositives

REMARQUE : Reportez-vous à la Figure 1 pour la configuration des diapositives.

  1. Préparer 3 lames (répétitions techniques) à l’aide de lames recouvertes d’une surface chargée positivement pour améliorer l’adhérence par condition d’irradiation (ou par tube conique). Placez la diapositive dans le support du clip, ajoutez la carte de filtre sur le dessus et enfin l’entonnoir. Fixez les clips de glissière et placez-les dans la cytocentrifugeuse.
  2. Ajouter 250 μL de la suspension cellulaire à l’entonnoir (200 000 cellules/lame) et tourner pendant 30 x g pendant 5 minutes à l’aide d’une cytocentrifugeuse.
  3. Après cytocentrifugation, retirez la lame du porte-clip et, à l’aide d’un stylo hydrophobe, dessinez un cercle autour de la tache avec les cellules afin de conserver la tache immunofluorescente sur les cellules liées pendant le processus de coloration.

5. Fixation et immunofluorescence γ-H2AX

REMARQUE: Toutes les solutions sont soigneusement ajoutées directement sur la zone cellulaire qui est marquée par un cercle hydrophobe. Les solutions de coloration sont distribuées légèrement au-dessus de la lame sans permettre à la pointe de la pipette de perturber les cellules. Les solutions ne sont PAS ajoutées à l’ensemble de la diapositive.

  1. Fixez les lames dans du PFA à 3 % fraîchement préparé pendant 20 minutes.
    REMARQUE: Les lames peuvent être stockées dans du PBS contenant 0,5% de PFA à 4 ° C pendant un maximum de 2 jours avant que l’immunocoloration ne soit effectuée. Par la suite, laver les lames dans un pot Coplin avec du PBS pendant 5 minutes, puis couvrir les cellules avec 100 μL de la solution froide de Triton-X pendant 10 minutes pour permettre la perméabilisation.
  2. Déposer la solution Triton-X sur du papier de soie et laver les lames trois fois dans une solution de BSA à 1 % pendant 10 minutes. Ceci est fait pour éviter un arrière-plan indésirable en bloquant la liaison d’anticorps non spécifiques.
  3. Incuber des lames à température ambiante avec 100 μL de l’anticorps anti-γ-H2AX primaire dilué à 1:500 pendant 1 heure dans une chambre humidifiante, facilement accompli en ajoutant du papier de soie humide à la base d’une boîte de rangement rectangulaire.
    1. Déposer la solution d’anticorps sur du papier de soie et effectuer trois lavages avec une solution de BSA à 1% pendant 10 minutes dans un pot Coplin pour éliminer l’anticorps primaire non lié et empêcher la liaison non spécifique de l’anticorps secondaire.
  4. Incuber les lames avec 100 μL de la solution secondaire d’anticorps DAM-TRITC diluée à 1:1000 pendant 1 heure dans la chambre d’humidification. Déposer la solution d’anticorps sur du papier de soie et laver les lames dans PBS pendant 10 minutes trois fois.
  5. Enfin, séchez les lames à l’extérieur du cercle hydrophobe avec du papier de soie doux et sans poussière et ajoutez 1 à 2 gouttes de DAPI résolues dans un support de montage aqueux et recouvrez doucement la glissière avec un couvercle de 24 x 50 mm, en veillant à ce qu’il n’y ait pas de bulles d’air piégées et placez-la au réfrigérateur à 4 ° C pendant la nuit. Les diapositives peuvent être conservées à 4 °C pendant un maximum de 2 semaines avant la numérisation.

6. Numérisation et notation automatisées des diapositives

REMARQUE: Le système de numérisation doit disposer d’un microscope fluorescent, d’une caméra CCD (dispositif couplé chargé) haute résolution connectée à une carte d’acquisition d’images pour la numérisation en temps réel des images vidéo, d’une étape de numérisation, d’un trackball pour les mouvements manuels, d’une souris 3D, d’un PC et d’un moniteur rapides et d’un disque dur pour l’archivage (Figure 2).

  1. Configuration du classificateur
    REMARQUE : Le classificateur est un ensemble de paramètres définissant la façon dont le système détecte les cellules. Il résulte de la formation basée sur des champs d’image pré-classifiés. Un classificateur est spécifique pour un grossissement de microscope, un type de cellule et un laboratoire. Les classificateurs peuvent donc nécessiter des modifications des paramètres suivants pour les adapter aux conditions actuelles. Il est recommandé de tester les paramètres à l’aide d’une diapositive de référence avant l’évaluation.
    1. Acquisition d’images : Utilisez un objectif sec 40x pour l’imagerie. Pour obtenir une qualité d’image comparable dans toutes les cellules, réglez le temps d’intégration de la caméra en mode automatique. Réglez le temps d’intégration maximal sur au moins 1 seconde pour les deux canaux de couleur (gain de caméra 4.0). Le canal de signal est acquis avec 10 plans de mise au point et 14/40 μm entre les plans.
    2. Sélection cellulaire : Les PBMC dans une plage de 20,00 μm2 et 76,00 μm2 sont détectés. Définissez la profondeur de concavité maximale sur 0,05 et le rapport d’aspect maximal sur 1,4. Définissez le seuil de niveau de gris relatif sur 20 %.
    3. Traitement des cellules : Traitez le canal de contre-tache DAPI avec un algorithme maximal d’histogramme pour réduire l’arrière-plan. Le canal de signal est traité avec un filtre TopHat (force 7, facteur de lissage 0) pour réduire l’arrière-plan et améliorer les signaux.
    4. Comptage du signal : comptez les foyers à l’aide de la fonction Nombre d’objets de l’appareil. Pour éviter l’évaluation faussement positive des signaux de fond restants, seuls les signaux qui montrent au moins 30% de l’intensité par rapport à l’objet le plus brillant de la cellule sont comptés.
  2. Insérez/placez les glissières sur la plate-forme de balayage automatisée ou l’étage de glissière, après avoir été nettoyées en douceur avec de l’éthanol à 70 %, pour éliminer toute poussière.
  3. Configuration des diapositives - Ouvrir le menu de dialogue Configuration des diapositives (Figure 3)
    1. Sélectionnez le chemin de donnéescorrect , qui spécifie où les fichiers de diapositives résultant de la recherche sont stockés.
    2. Donnez un nom à la diapositive, chaque diapositive doit recevoir un nom unique. Si une série de diapositives est entrée sous la forme d’une liste énumérée, le '?' peut être utilisé comme caractère générique pour le numéro de diapositive.
    3. Sélectionnez le classificateur approprié, comme décrit dans les sections 1.1 à 1.4 (Figure 4).
    4. Sélectionnez la fenêtre de recherche et sélectionnez Prédéfini s’il existe une définition de fenêtre de recherche correspondant au cercle de cellules cytocentrifuges, sélectionnez la définition correspondante dans la colonne Taille ou sélectionnez Manuel si aucune définition de fenêtre de recherche prédéfinie n’est disponible. Dans ce cas, il n’est pas nécessaire de définir la colonne Taille.
    5. Sélectionnez Nombre maximal de cellules et ajoutez le nombre maximal de cellules à analyser. La recherche est terminée même si la fenêtre de recherche sélectionnée n’a pas encore été complètement analysée dès que le nombre maximal de cellules est atteint. Pour les applications de biodosimétrie, la notation automatisée de 1000 cellules par lame est suffisante, étant donné que 3 lames par échantillon de sang sont préparées. Cliquez sur OK pour confirmer les paramètres.
  4. Configuration de l’analyse des diapositives
    1. Cliquez sur le bouton Rechercher dans la barre latérale. Si le paramètre Fenêtre de recherche manuelle a été sélectionné dans la configuration des diapositives, une boîte de dialogue s’ouvre permettant de déterminer la zone de numérisation (Figure 5). En utilisant l’objectif 10x, sélectionnez la zone de recherche rectangulaire sur la diapositive de manière interactive en fixant deux coins du champ de recherche par un clic gauche de la souris. Cela peut être confirmé avec le bouton OK. Si la fenêtre de recherche fait référence à une fenêtre de recherche prédéfinie, cette étape sera omise.
    2. L’utilisateur est invité à ajuster une position de début de mise au point. Un objet de référence sera alors sélectionné automatiquement, le logiciel invitera l’utilisateur à focaliser et centrer un noyau de référence (à l’aide de l’objectif 40x) pour chaque diapositive et à confirmer les paramètres avec OK. Le système se déplace automatiquement vers toutes les diapositives séquentiellement. Si nécessaire, ajustez Live Image Setup - Integration Time pour cette étape ( Figure5).
    3. Vérifiez tous les paramètres du microscope et confirmez l’invite du système avec OK. Le système lancera la procédure automatisée de mise au point et de numérisation. Une fois la numérisation terminée, les données sont enregistrées sur l’ordinateur pour analyse. Le système d’analyse s’éteint automatiquement une fois l’analyse terminée.
      REMARQUE: Assurez-vous que le levier du tube du microscope est dans une position qui détourne toute la lumière vers la caméra.
    4. Fin de la recherche, la recherche est terminée si toute la recherche a été analysée, si le nombre maximal de cellules a été atteint ou si la recherche a été annulée.
  5. Analyse des diapositives
    REMARQUE : L’analyse terminée est représentée à la figure 6.
    1. Une fois l’analyse terminée, cliquez sur le bouton Galerie dans la barre latérale. Passez en revue la galerie, qui se compose de petites images de cellules détectées. Dans cette fenêtre (Figure 7), spécifiez si les cellules stockées dans la galerie par un critère à choisir dans un menu déroulant. Les cellules sont généralement affichées dans l’ordre dans lequel elles ont été détectées.
    2. Cliquez sur Histogramme de qualité/Diagramme de la valeur des caractéristiques (Figure 8) pour donner la distribution de la mesure de la qualité pour les cellules détectées, ainsi que les moyennes et l’écart-type des foyers notés.

Résultats

Pour ce protocole, les cellules mononucléaires du sang périphérique humain (PBMC) ont été isolées du sang total de quatre volontaires adultes en bonne santé et ont été exposées à des doses de rayonnement de 0,125, 0,250, 0,500, 1 000 et 2 000 Gy. Par la suite, les échantillons ont été incubés pendant 1 heure à 37 °C dans un incubateur humidifié à 5 % de CO2. Après fixation et coloration par immunofluorescence, les lames sont automatiquement scannées et notées. Les figures 6,7 et 8 donnent une représentation de ce que le logiciel produit à l’utilisateur. Une fenêtre d’analyse apparaît une fois l’analyse terminée, donnant un aperçu des foyers notés. La galerie donne tous les foyers notés avec un menu interactif qui peut supprimer les valeurs aberrantes et enfin un histogramme avec un résumé détaillé des données est donné.

Le rendement des foyers γ-H2AX après exposition aux rayons γ est présenté à la figure 9. Il y a eu une augmentation progressive du nombre de foyers de γ-H2AX avec une dose croissante. Ce graphique illustre non seulement la dépendance à la dose et la sensibilité du test, mais l’ajustement peut également être utilisé pour effectuer une estimation de la dose lorsqu’un échantillon est reçu d’une personne qui a été exposée à une dose inconnue. Il est important de noter que l’on n’aura pas de contrôle irradié simulé ou de foyers de fond pour cette personne. Par conséquent, la figure 9 comprend la valeur de 0 Gy des échantillons témoins irradiés simulés, qui était de 0,57 ± 0,23 Gy pour les quatre donneurs adultes de cette étude.

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Figure 1: Préparation des lames pour lacytocentrifugation. Placez la diapositive dans le support du clip, ajoutez la carte de filtre sur le dessus et enfin l’entonnoir. Fixez les clips de glissière et placez-les dans la cytocentrifugeuse. Après cytocentrifugation, retirez la lame du support du clip et dessinez un cercle autour de l’endroit avec les cellules à l’aide d’un stylo hydrophobe. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

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Figure 2: La plate-forme de balayage automatisée utilisée dans ce protocole, contenant un scanner automatisé relié à un microscope fluorescent. Veuillez cliquer ici pour afficher une version agrandie de cette figure.

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Figure 3: Menu pour la configuration des diapositives. Ouvrez la boîte de dialogue en cliquant sur le bouton SETUP dans la barre latérale. Sélectionnez ou entrez le répertoire cible pour les fichiers de résultats Veuillez cliquer ici pour afficher une version plus grande de cette figure.

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Figure 4: Menu de configuration du classificateur. Assurez-vous que les paramètres de classificateur sélectionnés correspondent au type de cellule actuel, aux conditions de préparation et aux modèles de coloration de l’échantillon. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

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Figure 5: Menu de configuration de la fenêtre de recherche manuelle. La fenêtre a été sélectionnée dans la configuration des diapositives ; un dialogue s’ouvrira permettant de déterminer la zone de numérisation. En utilisant l’objectif 10x, la zone de recherche rectangulaire de la diapositive est sélectionnée de manière interactive en fixant deux coins du champ de recherche par un clic gauche de la souris. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

figure-results-6
Figure 6: Fenêtre d’analyse, une fois l’analyse terminée, la fenêtre d’analyse affiche les résultats de l’analyse. Veuillez cliquer ici pour afficher une version agrandie de cette figure.

figure-results-7
Figure 7: Vue Galerie pour la diapositive sélectionnée. L’onglet Galerie se trouve dans la barre latérale. La galerie d’images se compose de petites images des cellules détectées, affichées sous la forme d’une image DAPI-TRITC combinée. Dans les coins inférieur gauche et droit de chaque image, le nombre direct de foyers et le nombre de foyers corrigés sont affichés. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

figure-results-8
Figure 8: Images d’histogramme pour la diapositive sélectionnée. Cette fenêtre s’ouvre en cliquant avec le bouton droit de la souris sur l’histogramme. En cliquant sur l’histogramme, la feuille d’onglet de l’histogramme fournit un résumé des données qui répertorie la moyenne, l’écart-type, le coefficient de variation, les valeurs minimales, maximales et médianes des cellules analysées. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

figure-results-9
Figure 9: Nombre de foyers γ-H2AX en fonction de la dose pour les lymphocytes exposés à 60co γ rayons. Les barres d’erreur sont les écarts-types représentant la variation interindividuelle entre les donneurs. Les données représentent le nombre moyen de foyers γ-H2AX ±'écart-type de quatre volontaires sains. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Discussion

Ce protocole décrit une procédure par étapes pour la notation automatisée par microscopie fluorescente du test de foyers γ-H2AX. Il illustre l’utilité du test des foyers en tant que méthode efficace en termes de temps pour analyser le nombre d’ADN DSB radio-induit dans les lymphocytes du sang périphérique afin d’effectuer une évaluation de la dose biologique dans un scénario d’accident radiologique où les individus pourraient être exposés à des niveaux inconnus d’IR.

Dans ce protocole spécifique, les PBMC ont été irradiés in vitro pour imiter une exposition in vivo aux rayonnements. Une fois l’irradiation et le temps d’incubation d’une heure terminés, les lames sont faites à l’aide d’une cytocentrifugeuse pour créer un point de concentration de cellules sur la lame. L’utilisation d’une cytocentrifugeuse est essentielle pour atteindre des conditions normalisées pour la notation automatisée. Une fois terminé, un stylo hydrophobe est utilisé pour faire un cercle autour des cellules, afin de réduire le gaspillage de réactifs en permettant à l’utilisateur de localiser les réactifs de coloration. Ce type de stylo peut être utilisé dans diverses techniques d’immunocoloration telles que sur des sections de paraffine, des sections congelées et des préparations cytologiques. De plus, il est important de choisir un stylo hydrophobe compatible avec les systèmes de détection à base d’enzymes et de fluorescents. Après la préparation des lames, la fixation et l’immunofluorescence γ-H2AX se sont produites. Dans ce protocole, les cellules sont fixées à l’aide de PFA à 3% dans une solution de PBS pendant 20 minutes. Pour que l’immunocoloration réussisse, il est essentiel que la morphologie des cellules soit conservée et que les sites antigéniques soient accessibles aux réactifs de détection utilisés. Le PFA est un agent relativement doux pour la fixation et stabilise les cellules tout en préservant les structuresprotéiques 51. Des expériences d’optimisation avec des concentrations de PFA plus élevées et des temps de fixation plus longs ont eu un impact négatif sur la qualité de la lame, mais un stockage ultérieur (pendant la nuit) dans 0,5% de PFA jusqu’à 24 heures a donné de bons résultats.

L’anticorps monoclonal primaire 2F3 utilisé dans ce protocole réagit à la variante d’histone H2AX lorsqu’il est phosphorylé à la sérine 139 après induction de l’ADN DSB. L’anticorps est capable de se lier au résidu phosphorylé sans réactivité croisée avec d’autres histones phosphorylées52. Comme il s’agit d’un anticorps monoclonal primaire de souris, un anticorps secondaire a été sélectionné contre l’espèce hôte de l’anticorps primaire alors qu’il était élevé dans un hôte alternatif, à savoir l’âne-anti-souris (DAM)-TRITC. Alors que la coloration immunofluorescente est basée sur une liaison anticorps-épitope spécifique, plusieurs forces intermoléculaires peuvent également entraîner une coloration de fond non spécifique. Afin de réduire la liaison non spécifique, il est important d’utiliser un réactif bloquant dans les protocoles de coloration immunofluorescente53; nous avons utilisé une solution BSA. En outre, un temps suffisant doit être alloué à cette étape de blocage en laissant les lames dans la solution pendant au moins 20 minutes avant la coloration des anticorps primaires et secondaires. En outre, la solution de BSA doit également être utilisée comme diluant pour les anticorps primaires et secondaires. En fonction de l’anti-γ-H2AX et de l’anticorps secondaire utilisés pour la coloration, il faut envisager de tester différentes dilutions d’anticorps afin de déterminer la concentration optimale. Pour un score plus précis, une double coloration peut être effectuée, en ajoutant des anticorps supplémentaires de la protéine de réparation de l’ADN DSB.

Un inconvénient majeur de ce type d’analyse est la nécessité d’acquérir des échantillons de sang dès que possible après l’exposition, car le nombre maximal de foyers est connu pour diminuer à des niveaux normaux dans les 48 heures suivant l’irradiation. Par conséquent, lorsque l’heure de l’accident de rayonnement et du prélèvement sanguin subséquent est connue, il pourrait être utile de travailler avec différentes courbes d’étalonnage qui ont été établies à différents moments après l’irradiation in vitro (p. ex., 4, 8, 12 et 24 heures). Cependant, comme déjà mentionné dans la section d’introduction du manuscrit, la force du test de foyers γ-H2AX réside dans des objectifs de triage initial et rapide et il devrait être utilisé pour donner la priorité à une dosimétrie biologique cytogénétique plus longue. Un scénario combiné où plusieurs biomarqueurs de biodosimétrie sont utilisés en parallèle, générera l’estimation de dose la plus fiable et divers laboratoires de biodosimétrie du monde entier ont uni leurs forces pour mettre en place des réseaux nationaux qui peuvent être activés et utilisés pour permettre de multiples évaluations de biodosimétrie parallèles par des laboratoires ayant des expertises différentes37,54,55 . En outre, des développements sont en cours pour des analyses ultrarapides telles qu’un laboratoire mobile sur ou à proximité du site de l’accident56. De nouvelles méthodes de biodosimétrie prometteuses sont constamment développées, ce qui, espérons-le, se traduira par un débit encore plus rapide et plus fiable à l’avenir57.

Pour le système d’analyse d’images automatisé, les diapositives sont insérées ou placées sur la plate-forme de numérisation automatisée ou la scène de diapositive. Par la suite, nommez et enregistrez les détails de la diapositive dans le dossier approprié sur l’ordinateur connecté. Pour cette expérience, la détection automatisée des noyaux et des foyers est basée sur les paramètres de classificateur respectifs. Lors de la création d’un classificateur, assurez-vous que les paramètres de classificateur sélectionnés correspondent au type de cellule actuel, aux conditions de préparation et à la coloration immunofluorescente de l’échantillon. Des canaux fluorescents appropriés correspondant au spectre d’excitation des anticorps primaires et secondaires sont définis dans le classificateur. Le classificateur permet de définir des paramètres de notation supplémentaires si nécessaire (par exemple, la taille du noyau, l’intensité fluorescente, comme décrit à la section 6.1). Si deux ou plusieurs protéines de réparation de l’ADN (par exemple, γ-H2AX et 53BP1) sont combinées dans une expérience, le système est également capable de détecter des colocalisations de signaux. Tout d’abord, le système acquiert des images DAPI, applique un traitement d’image et identifie les noyaux à l’aide de critères morphologiques définis dans le classificateur. Les signaux TRITC sont acquis à l’aide de 10 piles z d’une taille de pas de 0,35 mm entre les plans focaux47. Le classificateur a utilisé le nombre direct de foyers, où le nombre de signaux TRITC distincts dans le noyau est noté. Ici, il est important de prendre en considération qu’avec l’augmentation de la dose de rayonnement, les signaux de foyer ont tendance à fusionner dans des objets plus grands, ce qui entraîne une sous-estimation du nombre réel de foyers si les objets sont comptés directement. Il n’était pas nécessaire pour l’analyse décrite ici, mais une étape supplémentaire avec le nombre de foyers corrigé peut être implémentée pour résoudre ce problème. Ce dernier permet au système d’obtenir les tailles des signaux détectés et de les peser en conséquence. L’utilisation des deux méthodes de comptage peut fournir une estimation plus réaliste du nombre réel de foyers à des doses plus élevées.

Pour commencer la numérisation automatisée, la zone de numérisation est déterminée en utilisant l’objectif 10x du microscope pour créer une zone de recherche rectangulaire en fixant deux coins du champ de recherche par un clic gauche de la souris (Graphique 5), suivi de la mise au point de la position de départ. L’objet de référence est sélectionné automatiquement et le logiciel invite l’utilisateur à focaliser et à centrer un noyau de référence (à l’aide de l’objectif 40x) pour chaque diapositive. Une fois la recherche commencée, le système se déplace vers le centre de la fenêtre de recherche de la première diapositive sélectionnée et demande à centrer et à mettre au point l’objet de référence. Cet objet sera ensuite utilisé comme référence de position pour corriger tout décalage dans les positions de la cellule. Le deuxième objectif du champ de référence est le réglage automatique de la lumière, en mode de lumière transmise, la lumière est ajustée jusqu’à ce que le niveau de lumière optimal soit atteint. En mode fluorescence, le niveau de lumière est fixe, mais le temps d’intégration de la caméra CCD peut être augmenté jusqu’à ce que le signal requis soit mesuré. Pour permettre un réglage correct de la lumière, la référence doit contenir des objets présentant une coloration typique. Il est important de ne pas utiliser un champ qui contient des artefacts avec une intensité de coloration très élevée. Après le réglage de la lumière, le système démarre l’autofocus de la grille à la position de grille la plus proche du champ de référence. Il continue de concentrer les champs sur une grille régulière, se déplaçant dans un méandre vers l’avant et l’arrière de la fenêtre de recherche. L’analyse commence lorsque l’autofocus de la grille est terminé. La scène est déplacée dans un motif de méandre champ après champ pour capturer des données. Lorsqu’une cellule est détectée, sa position et l’image de la galerie sont stockées et affichées à l’écran et le nombre de cellules est mis à jour. Si une erreur de microscope, de scène ou d’alimentation se produit, la recherche est automatiquement annulée. La seule étape où il y a une intervention manuelle de l’opérateur est lors de la configuration de la numérisation des diapositives. C’est également le moment où un contrôle de qualité rapide a lieu (bulles d’air, faible nombre de cellules, décoloration des artefacts de coloration du signal fluorescent) et où il peut être décidé d’interrompre le balayage d’une lame de qualité inférieure. Une recherche est terminée si la diapositive entière a été analysée, si le nombre maximal de cellules a été atteint ou si la recherche a été annulée. Une fois l’analyse terminée, les données sont présentées comme on le voit dans Graphique 6. Pour afficher les cellules numérisées, la fenêtre Galerie s’ouvre et chaque cellule peut être affichée (Graphique 7). C’est un autre point où l’opérateur peut effectuer un contrôle de qualité en vérifiant la mise au point des images de la galerie et le nombre total de cellules qui ont été notées. Si trop de cellules sont floues ou si trop peu de cellules ont été détectées par le système pour faire une estimation réaliste de la dose (par exemple, 100 cellules au lieu des 1000 cellules prévues), alors la décision devrait être prise d’exclure la lame et le score automatique de l’évaluation finale. Toutes les données sont résumées dans des histogrammes (Graphique 8), ainsi que des informations sur la distribution, les moyennes et l’écart-type des foyers notés pour chaque cellule. Les histogrammes peuvent également être utilisés pour sélectionner et afficher des sous-populations de noyaux en fonction des résultats automatisés pour examen. Les analyses statistiques des résultats sont effectuées après que la distribution, la moyenne et l’écart-type du nombre de foyers par cellule ont été enregistrés manuellement. Le graphique peut être utilisé comme courbe d’étalonnage pour faire une estimation de dose d’un échantillon de biodosimétrie. Cela peut être fait en utilisant l’équation de la ligne de tendance pour faire une estimation approximative de la dose reçue. En outre Graphique 9 illustre que l’analyse automatisée est suffisamment sensible pour détecter les foyers induits à faibles doses. En outre, les résultats montrent une nette augmentation linéaire du nombre de foyers par cellule avec la dose. Il convient de noter que les résultats ne sont représentatifs que pour le classificateur utilisé, les résultats différeront selon les paramètres du classificateur. Par conséquent, dans le cas d’une analyse de biodosimétrie, il est important que le même classificateur et la même préparation de lame soient utilisés pour les échantillons de biodosimétrie que ceux qui ont été utilisés pour établir la courbe d’étalonnage utilisée pour effectuer l’estimation de la dose. Bien que cela ne fasse pas partie de la portée de cette étude, il est important de noter que le test des foyers γ-H2AX peut également être utilisé pour déterminer les irradiations partielles du corps. La plupart des expositions accidentelles aux rayonnements sont des expositions corporelles inhomogènes ou partielles, où seule une région localisée du corps a reçu une exposition à forte dose. Plusieurs études ont montré qu’il est possible d’utiliser le test des foyers γ-H2AX pour estimer la fraction du corps qui a été irradiée et la dose à la fraction irradiée42. Lorsqu’une irradiation du corps entier a lieu, il y aura induction aléatoire de l’ADN DSB dans toutes les cellules et on peut s’attendre à trouver une distribution de Poisson. Semblable aux méthodes cytogénétiques où l’induction d’aberrations chromosomiques a tendance à être trop dispersée dans les lymphocytes du sang périphérique où il y a une forte abondance de cellules avec de multiples aberrations et de cellules avec des métaphases normales, l’analyse de dispersion des foyers γ-H2AX à l’aide d’une méthode de Poisson contaminée suggérée sur des distributions de foyers dispersés58. Ce dernier a également été confirmé dans in vivo expériences avec des minipigs et un macaque rhésus59.

Déclarations de divulgation

C. Schunck est un employé de MetaSystems Hard & Software GmbH, Altlussheim, Allemagne.

Remerciements

Les auteurs tiennent à remercier les participants à l’étude pour leurs dons de sang, ainsi que l’infirmière V. Prince pour le prélèvement d’échantillons de sang. L’aide financière de la South African National Research Foundation (NRF) à cette recherche est reconnue. Les opinions exprimées et les conclusions auxquelles on est parvenu sont celles des auteurs et ne doivent pas nécessairement être attribuées à la NRF. Ce travail a été soutenu financièrement par l’Agence internationale de l’énergie atomique (AIEA), par le biais d’un projet de coopération technique (numéro: URU6042) pour soutenir W. Martínez-López, ainsi que du projet de recherche coordonné E35010 (numéro de contrat: 22248).

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Albumine sérique bovine - BSAMerckA3059
Coplin JarSigmaS6016
Cover Slips (Taille 24 x 50 mm)LasecGlass2C29M2450Rec
Flacons cryogéniques (1,2 mL)WhiteSci607101
CytospinHealthcare TechnologiesJC370-12-L
Cytospin ClipsHealthcare TechnologiesJC302
Cartes filtrantes CytospinTechnologies de la santéJC307
Entonnoirs CytospinTechnologies de la santéJC372
DAM-TRITCInvitrogenA16022
DAPI-FluroshieldSigma/MerckF6057
EthanolKimixETD901
Filtre conseilsWhiteSci  ; 200ul (312012) et 1000ul (313012)
Acide chlorhydrique - HClMerck
HistopaqueSigma/Merck10771
lithium&ndash ; tubes de prélèvement d’héparineLe groupe scientifique367526
MetaSystems - MetaferMetasystemsAzio Imager Z2 : 195-041848
NaOHMerck221465
NovoPenLeica BiosystemsNCL-PEN
ParaformaldéhydeSigma/Merck158127
Comprimésde solution saline tamponnée au phosphateSéparationsSH30028,02
PipettesWhiteSciP11037 et P1033X-tra Les lames d’angle clipsées sont clipsées à des angles de 45 degrés pour aider à réduire les bris de verre.
Anticorps anti-H2A.X Phospho (Ser139) purifiéBiolegend613402 / 100 &mu ; g
RPMI mediumWhiteSciBE12-702F
Triton X-100 (Octoxinol 9)Sigma/MerckT-9284
Tubes (15ml)WhiteSci601002
X-Tra lames adhésives &ndash ; d’angle clipséSMM Technologies3800200E

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Mots-clés

Essai Gamma H2AXcassures double brin de l ADNmicroscopie automatis edosim trie biologiquemicroscopie fluorescencemarquage immunofluorescentsyst me de num risation de lamesvaluation de l exposition aux rayonnementsisolement des lymphocytes
Une méthode de notation microscopique automatisée pour le test de foyers γ-H2AX dans les lymphocytes du sang périphérique humain
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