Reconstruire le rétinoblastome humain in vitro

Résumé

Nous décrivons une méthode de génération de rétinoblastome humain (RB) en introduisant des mutations bialléliques RB1 dans les cellules souches embryonnaires humaines (CSEh). Les lignées cellulaires RB pourraient également être cultivées avec succès en utilisant le RB isolé dans une boîte.

Résumé

La RB humaine est un cancer pédiatrique, qui est mortel si aucun traitement n’est administré. Comme la RB provient de précurseurs de cônes, ce qui est relativement rare dans les modèles de rongeurs, en ce qui concerne les différences inter-espèces entre les humains et les rongeurs, un modèle de maladie dérivé de l’homme est plus bénéfique pour découvrir les mécanismes de la RB humaine et rechercher les cibles thérapeutiques. Ici, le protocole décrit la génération de deux lignées de CSEh génétiquement modifiées avec une mutation ponctuelle RB1 biallélique (RB1 Mut/^Mut) et une mutation knockout RB1 (RB1-^/-), respectivement. Au cours du processus de développement rétinien, la formation de RB est observée. Les lignées cellulaires RB sont également établies en se séparant des organoïdes RB. Au total, en différenciant les lignées de CSEh génétiquement modifiées en organoïdes rétiniens à l’aide d’un protocole de différenciation combinée 2D et 3D, nous avons réussi à reconstruire la RB humaine dans une boîte et à identifier son origine conique-précurseur. Il fournirait un modèle de maladie utile pour observer la genèse, la prolifération et la croissance du rétinoblastome, ainsi que pour développer de nouveaux agents thérapeutiques.

Introduction

Le rétinoblastome humain (RB) est une tumeur rare et mortelle dérivée des précurseurs du cône rétinien ^1,2,3, est le type le plus courant de malignité intraoculaire dans l’enfance⁴. L’inactivation homozygote du gène RB1 est la lésion génétique initiatrice de RB⁵. Cependant, les souris porteuses de mutations RB1 ne parviennent pas à former la tumeur rétinienne². Bien que les tumeurs de souris puissent être générées avec la combinaison de mutations Rb1 et d’autres modifications gé....

Protocole

Cette étude est approuvée par le Comité d’éthique institutionnel de l’hôpital Tongren de Pékin, Capital Medical University. Les CSEh H9 sont obtenues auprès de l’Institut de recherche WiCell.

1. Génération de CSEh avec mutation RB1

1. Vecteur de ciblage CRISPR/Cas9 pour le KO (KO) de RB1.
   1. Concevez une paire d’ARNg. Pour l’ablation de RB1, cibler le premier exon de ce gène. La séquence d’amorce avant est CACCGCGGTGGCGGCCGTTTTTTTCGG, et la séquence d’amorce inverse est AAACCCGAAAAACGGCCGCCACCGC.
      REMARQUE: Pour la mutation RB1 spécifique, un modèle réparé est également requis. Dans ce pro....

Résultats

La procédure de génération RB est élucidée dans la figure 1, qui combine la culture adhérente et flottante. Il a été possible de récolter la RB humaine à partir de RB1-KO hESC et d’obtenir la lignée cellulaire RB en isolant les organoïdes RB.

Ici, le protocole fournit les détails de la différenciation en différentes étapes (Figure 2). Des sphères creuses se forment au cours des 3 premiers jours qui s’attachent à la surface de.......

Discussion

Le rétinoblastome humain (RB) est causé par l’inactivation de RB1 et le dysfonctionnement de la protéine Rb. Dans ce protocole, le RB1-KO hESC est l’étape cruciale pour la génération de RB dans une boîte. Alors que même avec RB1-^/- hESC, il est possible qu’il n’y ait pas de formation de RB en raison des méthodes de différenciation organoïde rétinienne¹⁰. Dans ce protocole, le passage de la culture adhérente à la culture flottante est essentiel dans le processu.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
2-mercaptoéthanol	Life Technologies	21985-023
Anti-ARR3	Sigma	HPA063129	Anticorps
Anti-CRX (M02)	Abnove	ABN-H00001406-M02
Anticorps Anti-Ki67	Abcam	; ab15580	Anticorps
Anti-Syk (D3Z1E)	Technologie de signalisation cellulaire	13198
Anticorps BbsI	NEB	R3539S	Enzymes de restriction
Dispase (1U/mL)	Stemcell Technologies	7923
DMEM basic	Gibco	10566-016
DMEM/F-12-GlutaMAX	Gibco	10565-042
DMSO	Sigma	D2650
DPBS	Gibco	C141905005BT
EDTA	Thermo	15575020
Sérum de veau fœtal (FBS), qualifié pour les cellules souches embryonnaires humaines	Industrie biologique	04-002-1A
Glutamine	Gibco	35050-061
Mélange nutritif Ham’s F-12 (Hams F12)	Gibco	11765-054
MEM Solution d’acides aminés non essentiels (100X)	Sigma	M7145
Neurobasal Medium	Gibco	21103-049
P3 Primary Cell 4D-Nucleofector X Kit S	Lonza	V4XP-3032	Nucleofection kit
Pen Strep Gibco		15140-122
Puromycin	Gene Operation	ISY1130- 0025MG
QIAquick PCR Purification Kit	QIAGEN	28104
ncEpic-hiPSC/hESC milieu de culture	Nuwacell	RP01001	ncEpic-hiPSC/hESC milieu de culture en 1.2.1
Facteur de croissance réduit membrane basale	matrice BD	356231	Matrigel en 1.2.1
Enzyme de dissociation cellulaire	Gibco	12563-011	TrypLE Express en 1.2.8
RNeasy Midi Kit	QIAGEN	75144
RNeasy Mini Kit	QIAGEN	74104
Supplément A	Life Technologies	17502-048	N-2 Supplément (100X), liquide, supplemet in medum I
Supplement B	Life Technologies	17105-041	B-27 Supplement (50X),liquide, supplemet in medum I,II,III
T4 Polynucléotide Kinase	Life Technologies	EK0032
Taurine	Sigma	T-8691-25G
Y-27632 2HCl	Selleck	S1049
pX330-U6- Chimérique BB-CBh-hSpCas9-2A-Puro	Addgene	42230
Nucleofector 4D	Lonza
RPMI	Sigma	R0883-500ML