Caractérisation unicellulaire de l’afflux de calcium et de l’infection par le VIH-1 à l’aide d’une plateforme optofluidique multiparamètres

Résumé

Ici, nous présentons un protocole dans lequel les cellules individuelles sont surveillées pour les événements aigus et l’infection productive par le VIH-1 sur un dispositif nanofluidique. Les données d’imagerie définissent les interactions virus-récepteur hôte et la dynamique de la voie de signalisation. Il s’agit de la première méthode de culture et d’imagerie unicellulaires longitudinales nanofluidiques à haut débit pour étudier la cinétique de signalisation et les interactions moléculaires.

Résumé

Le VIH-1 provoque une infection chronique qui touche plus de 37 millions de personnes dans le monde. Les personnes vivant avec le virus de l’immunodéficience humaine (VIH) éprouvent une comorbidité liée à l’inflammation chronique malgré le traitement antirétroviral. Cependant, ces signalisations inflammatoires n’ont pas été entièrement caractérisées. Le rôle des événements d’entrée précoce sur l’activation des événements de signalisation cellulaire et l’expression des gènes en aval n’a pas été capturé au niveau unicellulaire. Ici, les auteurs décrivent une méthode qui applique les principes de la microscopie à fluorescence à cellules vivantes à une plate-forme unicellulaire automatisée qui cultures et images des cellules sur des cours de temps personnalisés par l’utilisateur, permettant une analyse à haut débit des processus cellulaires dynamiques. Ce test permet de suivre la microscopie à fluorescence vivante unicellulaire des événements précoces qui suivent immédiatement l’infection par le VIH-1, notamment l’afflux de calcium qui accompagne l’exposition au virus et le développement d’une infection productive à l’aide d’un virus rapporteur fluorescent. Les cellules MT-4 sont chargées d’un colorant sensible au calcium et cultivées dans des enclos isolés sur un dispositif nanofluidique. Les cellules cultivées sont infectées par un virus rapporteur du VIH-1 (NLCI VIH-1). Un microscope à fluorescence placé au-dessus du dispositif nanofluidique mesure l’afflux de calcium sur une trajectoire de temps de 8 minutes après une exposition aiguë au VIH-1. L’infection productive par le VIH-1 est mesurée dans ces mêmes cellules sur une période de 4 jours. Les données d’imagerie de ces cours de temps sont analysées pour définir les interactions virus-récepteur hôte et la dynamique de la voie de signalisation. Les auteurs présentent une alternative intégrée et évolutive aux méthodes d’imagerie traditionnelles à l’aide d’une nouvelle plate-forme optofluidique capable de trier, de culture, d’imagerie et d’automatisation logicielle unicellulaires. Ce test peut mesurer la cinétique des événements dans diverses conditions, y compris le type de cellule, l’agoniste ou l’effet antagoniste, tout en mesurant un éventail de paramètres. Il s’agit de la première méthode établie pour la culture et l’imagerie unicellulaires longitudinales nanofluidiques à haut débit : cette technique peut être largement adaptée pour étudier la cinétique de signalisation cellulaire et les interactions moléculaires dynamiques.

Introduction

L’inflammation chronique est l’une des principales causes de morbidité précoce et de mortalité associées au VIH^1,2,3. Il existe de multiples mécanismes par lesquels le VIH peut activer la signalisation inflammatoire, et des preuves récentes suggèrent un rôle pour les récepteurs P2X dans l’entrée du VIH qui sont des récepteurs d’adénosine triphosphate (ATP)^3,4,5,6,7,8,

Protocole

1. Préparation des cellules pour l’imagerie

1. Préparer une solution fraîche de chargement fluo-4 AM : Ajouter 25 μL de solvant détergent concentré 100x, puis ajouter 2,5 μL de Fluo-4 AM 1000x à un tube de 1,5 mL. Vortex à mélanger.
2. Pipeter 2,5 mL de milieu de culture dans la solution de chargement et inverser pour mélanger. Protéger de la lumière.
3. Centrifuger 2 x 10⁶ cellules MT-4 à 500 x g pendant 3 min.
4. Retirer le milieu et ressusciter la pastille dans 2 mL de la solution de chargement fluo-4 AM préparée. Protéger de la lumière.
5. Pipette remettait les cellules dans une boîte de Pétri de 35 mm. Incube....

Résultats

La figure 1 illustre le format de la puce et des données d’imagerie brutes acquises par le microscope à fluorescence. L’identification et le regroupement des cellules non infectées et infectées par mesure mCherry sont illustrés à la figure 2. Ces grappes sont analysées pour la cinétique d’afflux de calcium dans la figure 3, qui démontre l’afflux précoce de calcium dans les cellules infectées par le VIH. La figur.......

Discussion

La méthodologie décrite pour étudier la relation entre l’afflux de calcium et l’infection productive par le VIH-1 dans les cellules individuelles peut être adaptée pour étudier la cinétique du calcium intracellulaire en réponse à d’autres agonistes ou antagonistes d’intérêt. La préparation des cellules pour l’imagerie est simple, peu chronophage, et les réactifs sont disponibles dans des kits pratiques de fabricants largement utilisés. La mesure du calcium à base de fluo-4 est bien décrite dans la littérature, et le VIH-.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
; Système optofluidique Beacon	Berkeley Lights
; Sérum fœtal bovin	Gibco
; FIDJI	Logiciel open source	PMID : 22743772, 22930834
Kit d’imagerie calcique Fluo-4	Thermo Fisher	; F10489
; Laboratoire VIH-1 NLCINL4-3	de Benjamin Chen	PMID : 28148796
Hyclone Pennecillin Streptomycin solution	GE Healthcare Life sciences	; SV30010
Cellules MT-4	NIH SIDA Réactif		; ARP-120
; Puce OptoSelect 3500	Berkeley Lights
; Embouts de pipette	Denville Scientific	; P3020-CPS
; Prism 9.0.0	GraphPad
; RPMI-1640 Moyen	Sigma-Aldrich	; R8758
Pipettes Sérologiques	Fisher Brand	; 13-678-11E
Capot de culture tissulaire	Différents modèles
T75 flacons	Corning	3073