Article de méthode

Évaluation in vitro de la reprogrammation cardiaque en mesurant le flux de calcium spécifique cardiaque avec un rapporteur GCaMP3

DOI :

10.3791/62643

22 février 2022

* These authors contributed equally

Dans cet article

Résumé

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Nous décrivons ici l’établissement et l’application d’une ligne de rapporteur de souris Tg(Myh6-cre)1Jmk/J /Gt(ROSA)26Sortm38(CAG-GCaMP3)Hze/J (appelée αMHC-Cre/Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3 ci-dessous) pour l’évaluation de la reprogrammation cardiaque. Les fibroblastes cardiaques néonatals (NCF) isolés de la souche de souris sont convertis en cardiomyocytes induits (iMC), ce qui permet une évaluation pratique et efficace de l’efficacité de la reprogrammation et de la maturation fonctionnelle des iMC via un flux de calcium (Ca2+).

Résumé

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La reprogrammation cardiaque est devenue une thérapie potentiellement prometteuse pour réparer un cœur endommagé. En introduisant plusieurs facteurs de transcription, y compris Mef2c, Gata4, Tbx5 (MGT), les fibroblastes peuvent être reprogrammés en cardiomyocytes induits (iCM). Ces iMC, lorsqu’ils sont générés in situ dans un cœur infarctus, s’intègrent électriquement et mécaniquement au myocarde environnant, entraînant une réduction de la taille des cicatrices et une amélioration de la fonction cardiaque. En raison de l’efficacité, de la pureté et de la qualité relativement faibles de la reprogrammation des iMC, la caractérisation des iMC reste un défi. Les méthodes actuellement utilisées dans ce domaine, y compris la cytométrie en flux, l’immunocytochimie et la qPCR, se concentrent principalement sur l’expression des gènes et des protéines spécifiques au cœur, mais pas sur la maturation fonctionnelle des iCM. Déclenchée par des potentiels d’action, l’ouverture de canaux calciques voltage-dépendants dans les cardiomyocytes entraîne un afflux rapide de calcium dans la cellule. Par conséquent, quantifier le taux d’afflux de calcium est une méthode prometteuse pour évaluer la fonction cardiomyocytaire. Ici, le protocole introduit une méthode pour évaluer la fonction iCM par flux de calcium (Ca2+). Une souche de souris αMHC-Cre/Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3 a été établie en croisant des souris Tg(Myh6-cre)1Jmk/J (appelée Myh6-Cre ci-dessous) avec des souris Gt(ROSA)26Sortm38(CAG-GCaMP3)Hze/J (appelées Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3 ci-dessous). Les fibroblastes cardiaques néonatals (NCF) de souris néonatales P0-P2 ont été isolés et cultivés in vitro, et une construction polycistronique de MGT a été introduite dans les NCF, ce qui a conduit à leur reprogrammation en iCM. Étant donné que seuls les iCM reprogrammés avec succès exprimeront le rapporteur GCaMP3, la maturation fonctionnelle des iCM peut être évaluée visuellement par flux Ca2+ avec microscopie à fluorescence. Par rapport aux NCF non reprogrammés, les NCF-iCM ont montré un flux transitoire de calcium significatif et une contraction spontanée, similaires aux CM. Ce protocole décrit en détail l’établissement de la souche de souris, l’isolement et la sélection des cœurs de souris néonatales, l’isolement NCF, la production de rétrovirus pour la reprogrammation cardiaque, l’induction iCM, l’évaluation du flux iCM Ca2+ à l’aide de notre ligne de rapporteurs, ainsi que l’analyse statistique et la présentation des données connexes. On s’attend à ce que les méthodes décrites ici fournissent une plate-forme précieuse pour évaluer la maturation fonctionnelle des iCM pour les études de reprogrammation cardiaque.

Introduction

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L’infarctus du myocarde (IM) est une maladie grave dans le monde entier. Les maladies cardiovasculaires (MCV) sont la principale cause de décès dans le monde et représentent environ 18,6 millions de décès en 20191,2. La mortalité totale des MCV a diminué au cours du dernier demi-siècle. Cependant, cette tendance a été ralentie, voire inversée, dans certains pays sous-développés1, ce qui nécessite des traitements plus efficaces des MCV. En tant que l’une des manifestations mortelles des MCV, l’IM représente environ la moitié de tous les décès attribués aux MCV aux États-Unis2.

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Protocole

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Toutes les procédures et pratiques expérimentales impliquant des animaux ont été approuvées par le comité institutionnel de soins et d’utilisation des animaux de l’Université du Michigan. Toutes les procédures et pratiques expérimentales impliquant la culture cellulaire doivent être effectuées BSL2 Biological Safety Cabinet dans des conditions stériles. Pour les procédures et les pratiques impliquant des virus, la ligne directrice sur l’élimination appropriée des cellules transfectées, des embouts de pipette et des tubes afin d’éviter le risque de dangers pour l’environnement et la santé a été suivie.

1. Établissement d’une souche de souris T....

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Résultats

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Le flux de travail expérimental pour générer la souche de souris Myh6-Cre/Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3 et la structure génique des souris transgéniques sont illustrés à la figure 1. Pendant que la souche de souris est établie, le cœur des chiots a été isolé et observé sous un microscope à fluorescence inverse pour confirmer le génotype. Les cœurs avec un génotype correct montrent un flux de Ca2+ synchronisé avec les battements, visualisé comme fluorescence GCaMP3, alors qu’aucune.......

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Discussion

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L’évaluation de la fonction iCM est nécessaire pour le domaine de la reprogrammation cardiaque. Dans ce manuscrit, le protocole décrit une souche de souris Tg(Myh6-cre)1Jmk/J /Gt(ROSA)26Sortm38(CAG-GCaMP3)Hze/J qui a été établie, comment utiliser les NCF isolés des souris néonatales dans cette souche pour la reprogrammation en iCM, et l’évaluation de la fonction iCM par flux Ca2+ . Il s’agit d’une méthode de novo pour évaluer la maturation fonctionnelle des iMC.

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Déclarations de divulgation

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Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

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Nous apprécions les efforts de Leo Gnatovskiy dans l’édition du texte anglais de ce manuscrit. La figure 1 a été créée avec BioRender.com. Cette étude a été soutenue par la subvention des National Institutes of Health (NIH) des États-Unis (1R01HL109054) au Dr Wang.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Tubes de centrifugation coniques de 15 mLThermo Fisher Scientific14-959-70C
Tubes de centrifugation coniques de 50 mlThermo Fisher Scientific14-959-49A
Plaques de culture cellulaire à 6 puitsAlkali ScientificTP9006
A83-01Stemgent04&ndash ; 0014
Microscope à fluorescence tout-en-unKeyenceBZ-X800EMicroscope à fluorescence inversée
B-27 Supplement (50X), sans sérumThermo Fisher Scientific17504044
Blasticidine S HCl (10 mg/mL)Thermo Fisher ScientificA1113903
Albumine sérique bovine (BSA) Poudre sans DNase et protéaseThermo Fisher Scientific
CD90.2 Microbilles, sourisMiltenyi Biotec130-049-101Microbilles Thy1.2
Colgénase, type 2Thermo Fisher ScientificNC9693955
chambre de comptageThermo Fisher Scientific02-671-51BHémocytomètre
DMEM, glycémie élevée, sans glutamineThermo Fisher Scientific11960069
DPBS, calcium, magnésiumThermo Fisher Scientific14-040-133
Éthanol, 200 proof (100 %)Thermo Fisher Scientific04-355-451
Acide éthylènediamine tétraacétique (certifié ACS)Thermo Fisher ScientificE478-500
Sérum de bovin fœtalCorning35-010-CV
HBSS, calcium, magnésium, sans rouge de phénolThermo Fisher Média IMDM14025092
Thermo Fisher Scientific12440053
IX73 Microscope inverséOlympusIX73P2FMicroscope à fluorescence inversée
Lipofectamine 2000 Réactif de transfectionThermo Fisher Scientific11-668-019
LS ColonnesMiltenyi Biotec130-042-401
Moyen 199, Earle’s SaltsThermo Fisher Scientific11150059
MidiMACS Séparateur et kits de démarrageMiltenyi Biotec130-042-302
Millex-HV Unité de filtre à seringue, 0,45 et micro ; m, PVDF, 33  ; mm, stérilisé aux rayons gammaMillipore SigmaSLHV033RB
MM589Obtenu du Dr Shaomeng Wang' s laboratoire à l’Université du Michigan
Opti-MEM I Sérum réduit moyenThermo Fisher Scientific31-985-070
PBS, pH 7,4Thermo Fisher Scientific10-010-049
Pénicilline-Streptomycine (10 000 U/mL)Thermo Fisher Scientific15140122
Platinum-E (Plat-E) Retroviral PackagingCell Line Cell  ; BiolabsRV-101
pMx-puro-MGTAddgene111809
Poly(éthylène glycol)Millipore SigmaP5413-1KGPEG8000
Réactif d’infection / transfection en polybrèneMillipore SigmaTR-1003-G
PTC-209SigmaSML1143&ndash ; 5MG
Chlorhydrate de puromycineThermo Fisher ScientificA1113803
Humain recombinant IGF-IPeprotech100-11
RPMI 1640 MediumThermo Fisher Scientific11875093
ST 16 Série de centrifugeusesThermo Fisher Scientific75-004-381
Crêtres à cellules stérilesThermo Fisher Scientific22-363-54740 et micro ; m strainer
Boîtes de culture tissulaire traitées en surfaceThermo Fisher ScientificFB012921
TE BufferThermo Fisher Scientific12090015
Trypan Blue solutionMillipore SigmaT8154
Trypsine-EDTA (0,05 %), rouge de phénolThermo Fisher Scientific25300054
Mélangeur VortexThermo Fisher Scientific
BP9706100scientifique02215365

Références

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  1. Vos, T., et al. Global burden of 369 diseases and injuries in 204 countries and territories, 1990-2019: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2019. The Lancet. 396 (10258), 1204-1222 (2020).
  2. Virani, S., et al.

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Mots-clés

Cardiomyocytes induitsfibroblastes cardiaques n onatauxmaturation fonctionnellemicroscopie de fluorescencediff renciation cardiaquetransduction r troviraleisolation du c ur

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