Perfusion rétrograde de glande parotide à travers le canal de Stensen chez un primate non humain pour l’administration de gènes vectoriels

Résumé

Les glandes salivaires ont été proposées comme site cible tissulaire pour la thérapie génique, en particulier dans le domaine de la vaccination par transfert de gènes. Nous démontrons l’administration de gènes dans un modèle de primate non humain utilisant une perfusion parotide rétrograde.

Résumé

Les glandes salivaires sont une cible tissulaire attrayante pour la thérapie génique avec des résultats prometteurs menant déjà à des essais sur l’homme. Ils sont intrinsèquement capables de sécrétion de protéines dans la circulation sanguine et sont facilement accessibles, ce qui en fait des sites tissulaires potentiellement supérieurs pour la production d’hormones de remplacement ou la vaccination par transfert de gènes. Les méthodes suggérées pour l’administration de gènes comprennent l’injection transcutanée et la perfusion rétrograde par les canaux salivaires. Nous démontrons comment effectuer une perfusion rétrograde de glandes salivaires (RSGI) chez des primates non humains. Nous décrivons les points de repère anatomiques importants, y compris l’identification de la papille parotide, une méthode atraumatique de canulation et de scellement du conduit de Stensen à l’aide d’outils dentaires de base, de tubes en polyéthylène et de cyanoacrylate, et le taux de perfusion approprié. Bien qu’il s’agisse de la méthode d’accouchement la moins traumatisante, la méthode est encore limitée par le volume pouvant être délivré (<0,5 mL) et le risque de traumatisme du canal et de la glande. Nous démontrons par fluoroscopie qu’un infusate peut être entièrement délivré dans la glande, et démontrons en outre par immunohistochimie la transduction d’un vecteur typique et l’expression du gène délivré.

Introduction

Alors que les glandes salivaires sont bien connues pour leur production exocrine de salive, les chercheurs ont depuis longtemps reconnu leur capacité à sécrétionner des protéines directement dans la circulation sanguine^1,ce qui en fait une cible potentielle pour la thérapie génique pour l’administration systémique, comme les hormones de remplacement ou la production d’anticorps. En fait, les glandes salivaires offrent plusieurs avantages par rapport à d’autres cibles tissulaires, tels que la capacité inhérente à produire des protéines pour la sécrétion (une propriété qui manque aux muscles), une encapsulation lourde qui peut limiter la diffusio....

Protocole

Toutes les procédures ont été effectuées à la Wake Forest School of Medicine Clarkson Campus pour des études animales. Le Comité institutionnel de soins et d’utilisation des animaux (IACUC) a été consulté pour des considérations éthiques et les détails des procédures ont été soumis pour examen. Wake Forest IACUC a approuvé notre protocole d’étude et toutes les procédures ont été effectuées en vertu du protocole approuvé par l’IACUC #A17-147.

1. Préparation du dispositif de perfusion

1. Coupez le tube en polyéthylène de taille 10 (PET10) en longueurs de 25 cm à l’aide d’une paire de ciseaux.
2. Marquez PET10 à 1 cm et 2 cm d’un....

Résultats

Procédure, transduction et transcription réussies
La figure 1 montre la papille parotide adjacente à la 2 e molaire sur la joue supérieure^{postérieure.} L’image montre également l’emplacement correct de l’attelle buccale, une extrémité en caoutchouc sur le palais dur et l’autre extrémité en caoutchouc sur la canine ipsilatérale. La figure 2 montre une image prise après une canulation réussie de la papille parotide à la marque de 2 cm.......

Discussion

Nous décrivons ici un protocole d’infusion rétrograde dans la glande parotide à travers le canal de Stensen. La méthodologie décrite offre des conseils qui peuvent potentiellement être utilisés par les chercheurs qui explorent l’utilité du tissu salivaire en tant que site pour la thérapie génique et d’autres applications.

Il existe plusieurs étapes critiques pour assurer le succès de la procédure. Tout d’abord, toutes les étapes de la procédure doivent être complétées en douceur. Un contrevent.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
500 et micro ; Seringues L U100 avec aiguilles de calibre 30	Becton Dickinson	328466	aiguille fixe pour moins de déchets
Adhésif (par exemple, Ethicon Dermabond)	Divers		adhésifs cyanoacrylate pour sceller et maintenir le tube dans le conduit pendant la perfusion.
Solution injectable d’atropine	Patterson Veterinary	07 869-6061	Atropine inj. 0,54 mg/mL
Seringues à insuline ultra-fines BD 30G	Walmart	N/A	Disponible en formats de 0,5 mL et 1,0 mL.
Cyanoacrylate (colle médicale)	Ethicon	DNX12	Adhésif cutané topique Dermabond
Boucles dentaires avec lumière	Amazon (DDP)	B012M3IV80	Utilisé pour améliorer la visualisation de la papille du canal de Stensen
Dilatateur lacrymal infantile	Surgipro	SPOI-137
Solution injectable de kétamine	Patterson Veterinary	07-803-6637	Ketaset inj. 100 mg/mL
Dilatateur lacrymal	Surgipro	SPOI-132	Utilisé pour dialoguer le canal de Stensen.
Solution injectable de midazolam	Patterson Veterinary	07 890-6698	Midazolam inj. 5mg/mL
Paire de ciseaux	Amazon (DDP)	N/A	Utilisé pour couper le tube PET10
Tube en polyéthylène (PE-10)	Scientific Comodities, Inc	BB31695-PE/1	Tube reliant la seringue 30G et inséré dans le conduit.
Q-tips	Walmart	N/A	Utilisé pour étaler du cyanoacrylate sur la joue
Taille 10 Tube en polyéthylène (PET 10)	Produits scientifiques	BB31695-PE/1	tube en polyéthylène basse densité
Ouvre-bouche pour petits animaux	Amazon (DDP	B01F3LVJXC	Utilisé pour garder la bouche de l’animal ouverte.
Pince à épiler	Amazon (DDP)	N/A	Utilisé pour insérer le tube PET10 dans le conduit de Stenson
Chlorure de zinc	Sigma-Aldrich	7646-86-7	Inclus dans les perfusions d’ADN plasmidique