Déploiement AAV de constructions d’expression basées sur des amplificateurs in vivo dans le cerveau de souris

Tracy L. Warren; Jason T. Lambert; Alex S. Nord

doi:10.3791/62650

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Article de méthode

Déploiement AAV de constructions d’expression basées sur des amplificateurs in vivo dans le cerveau de souris

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DOI :

10.3791/62650

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31 mars 2022

Tracy L. Warren¹^,² , Jason T. Lambert¹^,² , Alex S. Nord¹^,²

¹Department of Psychiatry and Behavioral Sciences, University of California, Davis, ²Department of Neurobiology, Physiology and Behavior, University of California, Davis

Dans cet article

Résumé

Ce protocole décrit un nouveau test d’amplificateur-rapporteur transitoire basé sur le rAAV. Ce test peut être utilisé pour induire une expression pilotée par l’amplificateur in vivo dans le cerveau de la souris.

Résumé

Les amplificateurs sont des plates-formes de liaison pour un large éventail de facteurs de transcription qui conduisent à des modèles d’expression spécifiques de gènes spécifiques aux tissus et aux types cellulaires. De multiples moyens d’évaluer l’ADN non codant et divers états de chromatine se sont révélés utiles pour prédire la présence de séquences d’amplificateurs dans le génome, mais valider l’activité de ces séquences et trouver les organes et les stades de développement dans lesquels elles sont actives est un processus à forte intensité de main-d’œuvre. Les progrès récents dans les vecteurs de virus adéno-associés (AAV) ont permis la livraison généralisée de transgènes aux tissus de souris, permettant des tests d’amplificateur in vivo sans nécessiter un animal transgénique. Ce protocole montre comment une construction rapporteur qui exprime l’EGFP sous le contrôle d’un promoteur minimal, qui ne conduit pas d’expression significative par elle-même, peut être utilisée pour étudier les modèles d’activité des séquences d’amplificateurs candidats dans le cerveau de la souris. Une construction de rapporteur emballée AAV est livrée au cerveau de la souris et incubée pendant 1 à 4 semaines, après quoi l’animal est sacrifié et des sections de cerveau sont observées au microscope. L’EGFP apparaît dans les cellules dans lesquelles l’amplificateur testé est suffisant pour initier l’expression génique, en localisant l’emplacement et le stade de développement dans lequel l’amplificateur est actif dans le cerveau. Les méthodes de clonage standard, l’emballage AAV à faible coût, les sérotypes AAV en expansion et les méthodes d’administration in vivo et de lecture d’imagerie standard en font une approche accessible pour l’étude de la régulation de l’expression génique dans le cerveau.

Introduction

Les amplificateurs sont des éléments cis-régulateurs génomiques qui servent de sites de liaison au facteur de transcription et peuvent conduire l’expression d’un gène cible d’une manière spatio-temporellement spécifique ^1,2. Ils sont différentiellement actifs dans différents types de cellules, tissus et stades de développement et peuvent être des substrats de variation génomique liée au risque de maladie ^3,4. Ainsi, la nécessité de comprendre la dynamique de la fonction de l’amplificateur est essentielle pour progresser dans les applications scientifiq....