Article de méthode

Utilisation de l’amélioration de la fluorescence induite par les protéines résolues dans le temps pour identifier les conformations locales stables un α-synucléine à la fois

DOI :

10.3791/62655

⸱

30 mai 2021

 , 
1Department of Biological Chemistry, The Alexander Silberman Institute of Life Sciences, Faculty of Mathematics & Science, The Edmond J. Safra Campus, The Hebrew University of Jerusalem, 2The Center for Nanoscience and Nanotechnology, The Hebrew University of Jerusalem

Dans cet article

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

L’amélioration de la fluorescence induite par une seule molécule résolue dans le temps est un capteur de proximité spectroscopique de fluorescence utile sensible aux changements structurels locaux dans les protéines. Ici, nous montrons qu’il peut être utilisé pour découvrir des conformations locales stables dans la α-synucléine, qui est également connue sous le nom de non structurée globulaire et instable lorsqu’elle est mesurée à l’aide de la règle FRET à plus longue portée.

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

L’utilisation de règles spectroscopiques pour suivre les conformations multiples de biomolécules uniques et leur dynamique a révolutionné la compréhension de la dynamique structurelle et de ses contributions à la biologie. Alors que la règle basée sur FRET rend compte des distances inter-colorants dans la gamme 3-10 nm, d’autres techniques spectroscopiques, telles que l’amélioration de la fluorescence induite par les protéines (PIFE), rapportent la proximité entre un colorant et une surface protéique dans la gamme plus courte de 0-3 nm. Quelle que soit la méthode de choix, son utilisation dans la mesure de biomolécules à diffusion libre une à la fois récupère des histogrammes du paramètre expérimental donnant des sous-populations de biomolécules distinctes distribuées centralement, où chaque sous-population représente soit une seule conformation qui est restée inchangée en quelques millisecondes, soit plusieurs conformations qui s’interconvertissent beaucoup plus rapidement que les millisecondes, et donc une sous-population moyenne. Dans fret à molécule unique, où le paramètre rapporté dans les histogrammes est l’efficacité FRET inter-colorant, une protéine intrinsèquement désordonnée, telle que le monomère α-synucléine dans le tampon, a déjà été signalée comme présentant une seule sous-population moyenne de conformations multiples s’interconvertissant rapidement. Bien que ces résultats antérieurs dépendent de la plage de 3 à 10 nm de la règle basée sur FRET, nous avons cherché à tester cette protéine à l’aide de PIFE à molécule unique, où nous suivons la durée de vie de fluorescence des protéines de α-synucléine marquées sCy3 spécifiques au site, une à la fois. Fait intéressant, en utilisant ce capteur de proximité spectroscopique à plus courte portée, la α-synucléine marqué sCy3 présente plusieurs sous-populations de vie avec des durées de vie moyennes distinctement différentes qui s’interconvertissent en 10-100 ms. Ces résultats montrent que si la α-synucléine peut être désordonnée à l’échelle mondiale, elle atteint néanmoins des structures locales stables. En résumé, dans ce travail, nous soulignons l’avantage d’utiliser différents capteurs de proximité spectroscopiques qui suivent les changements structurels locaux ou globaux une biomolécule à la fois.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Au cours des deux dernières décennies, les méthodes basées sur la fluorescence à molécule unique sont devenues un outil puissant pour mesurer les biomolécules1,2, sondant comment les différents paramètres biomoléculaires se distribuent ainsi que comment ils s’interconvertissent dynamiquement entre différentes sous-populations de ces paramètres à une résolution inférieure à la milliseconde3,4,5. Les paramètres de ces techniques comprennent l’efficacité de transfert d’énergie dans les mesures FRET 6,7, l’anisotropie de fluorescence8,9, les rendements quantiques de fluorescence et les durées de vie10,11, en fonction de différents mécanismes de trempe de fluorescence12 ou d’amélioration13. L’un de ces mécanismes, mieux connu sous le nom d’amélioration de la fluorescence induite par les protéines (PIFE)14 introduit l’amélioration du rendement quantique de fluorescence et de la durée de vie en fonction de l’obstruction stérique à l’isomérisation libre du fluorophore à l’état excité, causée par des surfaces protéiques au voisinage du colorant14,15, 16,17,18,19 . Fret et PIFE sont considérés comme des règles spectroscopiques ou des capteurs de proximité puisque leur paramètre mesuré est directement lié à une mesure spatiale au sein de la biomolécule étiquetée sous mesure. Alors que l’efficacité FRET est liée à la distance entre une paire de colorants dans une plage de 3-10 nm20, PIFE suit des augmentations dans les rendements quantiques de fluorescence ou les durées de vie liées à la distance entre le colorant et une surface d’une protéine voisine dans la gamme de 0-3 nm19.

Fret mono-molécule a été largement utilisé pour fournir des informations structurelles sur de nombreux systèmes protéiques différents, y compris les protéines intrinsèquement désordonnées (IDP)21, telles que α-Synucléine (α-Syn)22. α-Syn peut former des structures ordonnées suite à la liaison à différentes biomolécules et dans différentes conditions23,24,25,26,27,28,29,30. Cependant, lorsqu’il n’est pas lié, le monomère α-Syn est caractérisé par une hétérogénéité conformationnelle élevée avec des conformations d’interconversion rapide31,32.

Les conformations de α-Syn ont été étudiées précédemment en utilisant différentes techniques qui aident à identifier la dynamique conformationnelle de ces systèmes protéiques hautement hétérogènes et dynamiques33,34 , 35,36,37,38,39. Fait intéressant, les mesures FRET (smFRET) à molécule unique de α-Syn dans le tampon ont rapporté une seule population FRET39,40 qui est le résultat de la moyenne temporelle des conformations s’interconvertissant dynamiquement à des moments beaucoup plus rapides que le temps de diffusion typique de α-Syn à travers la tache confocale (des fois aussi rapide que quelques microsecondes et même plus rapide que cela, par rapport aux temps de diffusion typiques de la milliseconde)40, 41. Cependant, l’utilisation d’une règle spectroscopique FRET avec la sensibilité de distance de 3 à 10 nm ne rapporte parfois que les changements structurels globaux dans une petite protéine telle que α-Syn. Les mesures à molécule unique utilisant des capteurs de proximité spectroscopiques avec des sensibilités de distance plus courtes ont le potentiel de rendre compte de la dynamique des structures locales. Ici, nous effectuons des mesures PIFE monomoléculeuses de α-Syn et identifions différentes sous-populations de durées de vie de fluorescence mappant à différentes structures locales avec des transitions entre elles aussi lentes que 100 ms. Ce travail résume les mesures smPIFE résolues dans le temps de molécules de α-Syn à diffusion libre une à la fois, dans un tampon et lorsqu’elles sont liées à des membranes à base de SDS en tant que capteur de proximité spectroscopique à molécule unique à courte portée.

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Protocole

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Transformation plasmidique

  1. Préparation de 0,5 L de milieu SOC
    1. Peser 10 g de tryptone, 2,5 g d’extrait de levure, 0,25 g de chlorure de sodium (NaCl), 0,1 g de chlorure de potassium (KCl).
    2. Ajouter l’eau double distillée (DDW) jusqu’à un volume total de 0,5 L.
    3. Ajuster au pH 7 en ajoutant de l’hydroxyde de sodium (NaOH).
    4. Préparer des aliquotes de stock de 100 mL et autoclave.
    5. Avant utilisation, ajouter 0,5 mL de chlorure de magnésium stérile(MgCl2)et 1,8 mL de glucose stérile à 100 mL de SOC.
  2. Décongeler les cellules d’Escherichia coli compétentes BL21 (DE3) sur la glace.
  3. Mélangez doucement les cellules compétentes.
  4. Préparez deux tubes de 15 mL. Étiquetez l’un comme tube de réaction de transformation et l’autre comme tube de contrôle.
  5. Aliquote 100 μL de cellules compétentes dans les tubes.
  6. Ajouter 1 μL de plasmide à une concentration de 0,1 ng/μL dans le tube de réaction de transformation.
  7. Chauffer le milieu SOC au bain-marie à 42 °C pour une utilisation à l’étape 1.8.
  8. Pulser la chaleur des deux tubes dans un bain-marie à 42 °C pendant une durée de 45 secondes. (Étape critique!)
  9. Ajouter 900 μL de SOC chauffé à chaque tube.
  10. Incuber les tubes à 37 °C pendant une durée de 45 minutes en agitant à une vitesse de 225 tr/min.
  11. Étaler 200 μL des cellules avec le plasmide transformé sur une plaque de gélose LB (Luria-Bertani) contenant 100 μg/mL d’ampicilline, à l’aide d’un épandeur de cellules stériles.
  12. Étaler 200 μL des cellules avec le plasmide transformé sur une plaque de gélose LB sans ampicilline, à l’aide d’un épandeur stérile (témoin positif).
  13. Étaler 200 μL des cellules témoins (ne contenant pas de plasmide) sur une plaque lb-gélose contenant 100 μg/mL d’ampicilline, à l’aide d’un épandeur stérile(témoin négatif).
  14. Incuber les plaques pendant la nuit à 37 °C.

2. Préparation des protéines

  1. Expression et purification de la α-synucléine recombinante
    1. Choisissez une seule colonie et cultivez dans 100 mL de milieu liquide LB (Luria-Bertani) autoclavé contenant 100 μg/mL d’ampicilline à 37 °C (démarreur).
    2. Préparer quatre flacons d’erlenmeyer de 2 L, contenant chacun 1 L de milieu LB autoclavé et 100 μg/mL d’ampicilline (grande inoculation).
    3. Mesurer la densité optique (OD à λ = 600 nm) de la solution cellulaire. Lorsque la densité cellulaire du démarreur atteint un ODλ= 600nm de 0,6-0,7, ajouter 10 mL de solution de démarrage pour chaque 1 L de milieu LB préparé à l’étape précédente.
    4. Cultivez les milieux bactériens dans un agitateur d’incubateur à 37 °C et à une vitesse de 200 tr/min.
    5. Lorsque la densité cellulaire atteint une DOλ = 600nm de 0,6-0,8, induire l’expression des protéines en ajoutant de l’isopropyle β-d-1-thiogalactopyranoside (IPTG) pour chaque 1 L de milieu de croissance à une concentration finale de 1 mM.
      REMARQUE: Dissoudre 0,96 g d’IPTG dans 4 mL de DDW et ajouter 1 mL de la solution d’IPTG obtenue pour chaque 1 L de croissance bactérienne.
    6. Cultivez les cellules pendant une durée de 4 heures et collectez-les par centrifugation dans des tubes de 50 mL à une vitesse de 5 170 x g pendant une durée de 8 minutes.
      REMARQUE: À chaque tour, jetez le surnageant, conservez la pastille et remplissez à nouveau les mêmes tubes avec une croissance bactérienne.
    7. Conservez la pastille bactérienne dans un entrepôt de congélation (p. ex., -80 °C) pour le lendemain.
    8. Le lendemain, préparez 200 mL de tampon de lyse : 40 % (p/v) de saccharose et tampon A, qui comprend 30 mM de Tris-HCl, 2 mM d’acide éthylènediaminetétraacétique (EDTA), 2 mM de dithiothréitol (TNT) à un pH de 8,0.
    9. Ajouter 25 mL de tampon de lyse à chaque tube avec une pastille bactérienne.
    10. Re-suspendre la pastille (utiliser des pipettes Pasteur en plastique stérile) dans un tampon de lyse (voir 2.1.8).
    11. Préparer une fiole stérile d’Erlenmeyer de 250 mL avec un aimant agitateur sur glace.
    12. Ajoutez 5 mL de tampon de lyse, puis transférez-y les cellules homogènes en suspension.
    13. Remuer les cellules pendant une durée de 20 minutes à 200 tr/min à température ambiante.
    14. Répartir la solution en tubes de 50 mL et centrifuger à 4 °C pendant 30 minutes à une vitesse de 17 400 x g.
    15. Jetez le surnageant.
    16. Préparer une fiole stérile d’Erlenmeyer de 250 mL avec un aimant agitateur sur glace.
    17. Ajouter 15 mL de tampon de dissolution (90 mL de tampon A refroidi et 37 μL deMgCl2 dissous au-delà de la limite de solubilité et filtrés) dans chaque tube. Utilisez des pipettes Pasteur en plastique stérile et dissolvez le granulé.
    18. Lorsqu’une partie de la solution devient homogène, déplacez-la dans une fiole d’Erlenmeyer agitée sur de la glace.
    19. Déterminez le volume de la solution dans l’Erlenmeyer.
    20. Ajouter 10 mg de sulfate de streptomycine par 1 mL de solution (avant d’ajouter, dissoudre le sulfate de streptomycine dans 2 mL de tampon A).
      REMARQUE: Cette étape est effectuée afin d’éliminer l’ADN et les ribosomes.
    21. Remuer la solution pendant une durée de 10-20 minutes à température ambiante.
    22. Diviser la solution en tubes de 50 mL et centrifuger à 4 °C et à une vitesse de 20 700 x g pendant une durée de 30 minutes.
    23. Recueillir le surnageant et jeter la pastille.
    24. Préparer une fiole stérile d’Erlenmeyer de 250 mL sur de la glace avec un agitateur.
    25. Filtrer le surnageant à l’aide d’un filtre à seringue de 0,22 μm dans la fiole d’Erlenmeyer propre.
    26. Déterminer le volume de la solution et peser 0,3 g de sulfate d’ammonium pour chaque 1 mL de solution.
    27. Ajouter progressivement le sulfate d’ammonium à la solution agitée.
      REMARQUE: Cette étape est effectuée pour précipiter les protéines. Lorsque le sulfate d’ammonium lie les protéines, la solution devient obscurcie et floue, ce qui se présente sous forme de couleur blanche.
    28. Remuer pendant 30 minutes à température ambiante.
    29. Répartir la solution dans des tubes de 50 mL et centrifuger à 4 °C et à une vitesse de 20 700 g pendant une durée de 30 minutes.
    30. Jetez soigneusement le surnageant et conservez la pastille.
    31. Dissoudre la pastille avec 20 mL de tampon A.
    32. Unifiez toutes les solutions en un seul tube, puis mesurez le spectre d’absorption UV de la solution.
      REMARQUE: Si le spectre montre une signature d’agrégation (absorption au-dessus d’une longueur d’onde de 300 nm), passez à l’étape suivante. Si ce n’est pas le cas, ignorez l’étape suivante et passez à l’étape 2.1.34.
      REMARQUE: L’indice d’agrégation (I.A.) calculé à partir des spectres UV comme ODλ = 350nm/ (ODλ = 280nm - ODλ = 350nm) ×100. 41
    33. Utiliser des tubes centrifuges de coupure de 100 kDa et centrifuger à une vitesse de 3 590 x g à 4 °C pendant une durée de 15 minutes. Recueillez le liquide qui a traversé le filtre.
    34. Dialysez la solution à 4 °C pendant la nuit, contre le tampon A, à l’aide de sacs de dialyse avec une coupure de 3,5 kDa.
    35. Effectuez une autre série de dialyse pour une durée d’au moins 4 heures.
    36. Chargez l’échantillon dialysé sur une colonne d’échange d’anions MonoQ de 1 mL. Utilisez un tampon de chlorhydrate de Tris (Tris-HCl) de 30 mM à pH 7,5 comme tampon de lavage et un tampon tris-HCl de 30 mM pH 7,5 avec 500 mM de NaCl comme tampon d’élution.
    37. Injectez l’échantillon dans la colonne. Ensuite, lavez avec 20 volumes de colonne (CV) de tampon d’élution à 0% et de tampon de lavage à 100% afin d’éliminer les protéines non liées.
    38. Laver avec 7 CV de tampon d’élution de 30%.
    39. Éluez l’échantillon de protéine α-Syn à l’aide d’un gradient qui passe de 30 % à 100 % de tampon d’élution pour 30 CV, à un débit de 1,5 mL/min.
      REMARQUE: α-Syn élue à 46-66 CV à une conductivité de 20-24 mS / cm, ce qui fait référence à un tampon d’élution de 38-50%.
    40. Collectez les fractions du pic d’élution principal. Vérifier la présence de α-Syn en exécutant des échantillons dans une électrophorèse sur gel de polyacrylamide de dodécylsulfate de sodium à 15 % (SDS-PAGE), après coloration avec une solution de coloration Coomassie Blue ou Fast SeeBand. Une bande à 15 kDa est attendue.
    41. Unifiez les fractions pertinentes et dialysez-les pendant la nuit, contre le tampon A, à l’aide de sacs de dialyse avec une coupure de 3,5 kDa à 4 °C.
    42. Préparer les aliquotes de l’échantillon de protéines et les conserver à -20 °C.
  2. α-synucléine marquée Cy3
    1. Réduire le thiol du résidu de cystéine dans le mutant α-Syn A56C en ajoutant la TNT à une concentration finale de 2 mM pendant une durée de 1 heure à température ambiante.
    2. Retirez la TNT en effectuant deux cycles de dialyse à l’aide de sacs de dialyse à coupure de 3,5 kDa. Pour le premier tour, dialyze contre 30 mM Tris-HCl pH 8.0 et 2 mM EDTA. Pour le second tour, dialyze contre 50 mM HEPES pH 7,2 et 2 mM EDTA.
    3. Réduire les résidus de cystéine en ajoutant du chlorhydrate de tris(2-carboxyéthyl)phosphine (TCEP) à l’échantillon de protéines, à une concentration finale de 50 μM pendant une durée de 30 minutes à température ambiante.
      REMARQUE: TCEP est un agent réducteur non sulfhydryle, donc il maintient les groupes thiol réduits sans réagir avec le colorant. Nous avons ajouté 0,5 μL à partir d’une solution stock de 1 M TCEP.
    4. Calculer les quantités de protéines nécessaires pour le volume de réaction final de 1 mL.
      REMARQUE: Voici un exemple pour le calcul que nous avons utilisé:
      Concentration protéique finale de 20 μM × 1 mL de volume final = 56 μM concentration initiale en protéines × protéine V à ajouter
    5. Calculer la quantité de colorant nécessaire pour un volume de réaction final de 1 mL. Le profilage colorant d’une seule cystéine doit être effectué avec un excès de colorant, à un rapport molaire colorant/protéine d’au moins 3:1.
      REMARQUE: Un exemple pour le calcul que nous avons utilisé:
      Concentration finale de colorant de 60 μM × 1 mL de volume final = concentration initiale de colorant de 370 μM × colorant V à ajouter
    6. Calculer la quantité de tampon du dialysat nécessaire pour ajuster le volume total de réaction à 1 mL.
      REMARQUE: Exemple de calcul: 1 mL - (V calculé à partir de l’étape 2.2.4 + V calculé à partir de l’étape 2.2.5)
    7. Préparer le flacon de réaction avec un aimant sur le dessus d’un agitateur.
    8. Tout d’abord, ajoutez la quantité calculée de la protéine et le tampon. Ensuite, ajoutez la quantité calculée du colorant (maléimide de sulfo-Cy3).
    9. Gardez la réaction à température ambiante dans l’obscurité pendant une durée de 3 à 5 heures.
    10. Terminez la réaction en ajoutant 2 mM de TNT et continuez pendant une durée de 1 heure.
    11. Effectuez trois cycles de dialyse contre le tampon A, en utilisant des sacs de dialyse avec une coupure de 3,5 kDa pour éliminer l’excès de colorant libre de la solution.
    12. Chargez l’échantillon sur une colonne d’exclusion de taille pour séparer davantage le α-Syn étiqueté du colorant libre.
    13. Déterminer la concentration de α-Syn pur marqué en mesurant l’absorption du colorant (le coefficient d’absorption pour le sulfo-Cy3 est de 162 000 M-1cm-1à λ=548 nm).
    14. Si nécessaire, concentrez la solution pure étiquetée α-Syn à l’aide d’un concentrateur à vide (par exemple, SpeedVac). Ensuite, effectuez une série de dialyse contre le tampon A, en utilisant des sacs de dialyse avec un seuil de 3,5 kDa et déterminez à nouveau la concentration de la protéine étiquetée.
    15. Préparer les aliquotes de l’échantillon de protéines étiquetées et les conserver à -20 °C.

3. Mesures

  1. Configuration expérimentale smPIFE
    REMARQUE: Utilisez la configuration confocale suivante ou similaire.
    1. Utilisez une source laser pulsée (dans notre cas, un laser pulsé picoseconde de 532 nm avec une largeur d’impulsion d’environ 100 ps FWHM), fonctionnant à un taux de répétition approprié (20 MHz dans notre cas) et acheminé vers le SYNC d’une carte de comptage de photons uniques (TCSPC) corrélée dans le temps, comme source d’excitation sulfo-Cy3 (sCy3).
    2. Utilisez un miroir dichroïque à haute réflectivité à 532 nm, pour séparer l’excitation et la diffusion de la fluorescence.
    3. Utilisez un sténopé de 100 μm de diamètre au foyer de la lumière émise, après que le faisceau d’émission collimaté a été focalisé par une lentille et avant que le faisceau d’émission n’ait été re-collimé par une autre lentille.
    4. Utilisez un filtre passe-bande (585/40 nm dans notre cas) pour filtrer davantage la fluorescence sCy3 à partir d’autres sources lumineuses.
    5. Détectez la fluorescence à l’aide d’un détecteur (diode d’avalanche monophotonique ou photomultiplicateur hybride, dans notre cas) acheminé (via un routeur 4-to-1, dans notre cas) vers un module TCSPC (Becker & Hickl SPC-150, dans notre cas).
      REMARQUE: Dans notre cas, l’acquisition de données est effectuée via le logiciel VistaVision (ISSTM) au format de fichier TTTR (time-tagged-time-resolved).
  2. Préparation de l’échantillon smPIFE
    1. Préparer 25 pM sCy3 marqué α-Syn dans le tampon de mesures: 10 mM d’acétate de sodium, 10 mM de dihydrogénophosphate de sodium, 10 mM de glycine pH 8,0, 20 mM de NaCl, 10 mM de cystéamine et 1 mM d’acide 6-hydroxy-2,5,7,8-tétraméthylchroman-2-carboxylique (TROLOX), dans un tube à faible liaison aux protéines.
      REMARQUE: Si α-Syn est mesuré en présence de vésicules SDS, ajoutez également la quantité de FDS appropriée.
    2. Rincez une lame de couverture de microscopie à 18 chambres avec 100 μL de 1 mg/mL d’albumine sérique bovine (BSA) pendant une durée de 1 minute, puis retirez la BSA.
    3. Ajouter 100 μL de l’échantillon de α-Syn marqué sCy3 de 25 pM à une chambre dans la lame de couverture.
    4. Effectuez la mesure smPIFE de l’échantillon à l’aide de la configuration décrite, comme suit dans les étapes suivantes.
  3. Acquisition de données smPIFE
    1. Utilisez un objectif à immersion dans l’eau à grande ouverture numérique (dans notre cas, Olympus UPLSAPO 60x N.A. 1.2) et ajoutez une goutte d’eau ultra-pure sur le dessus de l’objectif.
    2. Fixez la glissière de couverture dans une chambre de scène et installez-la sur le dessus de l’étage du microscope.
    3. Amenez la lentille de l’objectif vers le haut, jusqu’à ce que la gouttelette d’eau sur le dessus de la lentille de l’objectif s’étale au bas de la glissière de couverture.
    4. Ouvrez l’obturateur laser et amenez l’objectif vers le haut, tout en inspectant le motif sur une caméra CMOS, en collectant la lumière diffusée par l’échantillon. Observez le motif des anneaux Airy : le premier représente la mise au point à l’interface eau-verre, puis le second représente la mise au point à l’interface entre le verre et la solution échantillon.
    5. Augmentez la hauteur de l’objectif de 75 μm supplémentaires, apportant la mise au point laser profondément dans la solution, afin de minimiser l’auto-fluorescence de la surface en verre du couvercle.
    6. Réglez la puissance laser de l’objectif à environ 100 μW.
    7. Commencez l’acquisition des photons détectés pendant une durée prédéfinie (2 heures, dans nos mesures).
      REMARQUE: La majorité du signal d’acquisition doit avoir un débit (mesuré en nombres par seconde, cps) qui est similaire à celui acquis lors de la mesure uniquement du tampon; les données en millisecondes devraient montrer des événements de sursaut de photons rares, la majorité des bacs ayant un débit moyen comparable au taux de fond typique du détecteur (<1 000 cps, dans notre cas).

4. Analyse d’éclatement smPIFE

  1. Conversion de données brutes
    REMARQUE: Les données sont généralement stockées dans un fichier binaire avec un format prédéfini par la société qui fabrique la carte TCSPC (fichiers .spc dans notre cas).
    1. Convertissez le fichier de données brutes au format de fichier universel photon-HDF542, à l’aide de la suite logicielle phconvert (https://github.com/Photon-HDF5/phconvert). Appelez le fichier de données brutes en entrée et convertissez-le en fichier .hdf5 de données brutes à l’aide du code approprié de la suite phconvert (le bloc-notes Convert ns-ALEX Becker-Hickl en Photon-HDF5.ipynb Jupyter, dans notre cas).
      REMARQUE: La conversion en un fichier .hdf5 comprend: (1) la détermination des flux de photons pertinents dans les données brutes (c’est-à-dire les flux de photons enregistrés de l’ID de détecteur pertinent); (2) les nanotemps photoniques pertinents (les temps de détection des photons par rapport au temps SYNC d’excitation) ; et (3) ajout de métadonnées.
  2. Recherche et sélection en rafale à l’aide de FRETbursts43
    REMARQUE: Tous les fichiers de données brutes photon-HDF5 des mesures smPIFE, ainsi que le code résumant l’analyse des données brutes, sont stockés dans Zenodo (https://doi.org/10.5281/zenodo.4587698). Toutes les étapes ci-dessous sont détaillées et affichées dans les blocs-notes Jupyter, également fournis dans le lien du référentiel Zenodo.
    1. Ouvrez les blocs-notes Jupyter (dans le cadre Anaconda, dans notre cas).
    2. Ouvrez l’ordinateur portable smPIFE-aSyn 56C(Cy3) 25 pM newBuffer (Ordinateur portable final).ipynb (vous pouvez le trouver dans le lien Zenodo).
    3. Charger FRETbursts.
    4. Chargez le fichier de données photon HDF5.
    5. Évaluation du taux BG: à l’aide de l’histogramme des temps interphotoniques, calculez les taux de fond (BG) pour chaque 30 secondes d’acquisition de données dans le fichier de données photon HDF5.
      REMARQUE: Les étapes suivantes décrivent la recherche en rafale à l’aide de l’algorithme de fenêtre coulissante44,45,46.
    6. Déplacez une fenêtre temporelle de m=20 photons consécutifs, un photon à la fois.
    7. Collectez les données de photons uniquement si le taux de photons instantanés, ( figure-protocol-1 ), est au moins F = 11 fois plus grand que le taux BG pour cette période d’acquisition de données.
      REMARQUE: Un sursaut est construit à partir de tous les photons consécutifs qui ont été collectés en faisant glisser la fenêtre un photon à la fois (étape 4.2.6.) et en accordant avec le critère de taux de photons (étape 4.2.7).
    8. Calculez les caractéristiques de rafale suivantes :
      Taille du sursaut : la quantité de photons dans un sursaut.
      Durée du sursaut : la différence de temps entre le dernier et le premier temps de détection de photons dans un sursaut.
      Luminosité du sursaut : la plus grande valeur du taux de photons instantanés dans un sursaut.
      Séparation des rafales : l’intervalle de temps entre les rafales consécutives.
      REMARQUE: Les points suivants décrivent la procédure de sélection en rafale ultérieure.
    9. Tracez l’histogramme des valeurs de luminosité du sursaut (le taux de photons instantané le plus élevé dans un sursaut), avec l’axe des événements à l’échelle logarithmique.
    10. Définissez le seuil de luminosité de rafale comme la valeur de luminosité de rafale minimale à partir de laquelle l’histogramme présente un motif de désintégration.
    11. Sélectionnez des rafales dont les valeurs de luminosité sont supérieures au seuil de luminosité des rafales.
      REMARQUE: Les étapes suivantes décrivent les durées de vie moyennes de fluorescence en rafale.
    12. Tracez l’histogramme des nanotemps de photons pour tous les photons dans tous les sursauts sélectionnés avec l’axe du nombre de photons à l’échelle logarithmique.
    13. Définissez le seuil de nanotemps comme la valeur nanotempéraire minimale à partir de laquelle l’histogramme des nanotemps de photons présente un motif de désintégration.
    14. Sélectionnez uniquement les photons dont les nanotemps sont supérieurs au seuil de nanotemps.
    15. Calculer la moyenne algébrique de tous les nanotemps photoniques sélectionnés.
    16. Soustrayez le seuil de nanotemps de la moyenne algébrique du nanotemps des photons. Le résultat est le nanotemps moyen des photons du sursaut, qui est directement proportionnel à la durée de vie moyenne de la fluorescence.
    17. Tracez l’histogramme de toutes les durées de vie moyennes de fluorescence en rafale. Des sous-populations de fluorescence distribuées centralement peuvent apparaître. Les sous-populations avec des moyennes de faible valeur représentent des espèces moléculaires avec sCy3 qui n’a pas été obstruée stériquement, tandis que les sous-populations avec des moyennes de valeur plus élevées représentent des espèces moléculaires avec sCy3 qui était plus stériquement obstruée.
      REMARQUE : Les étapes suivantes décrivent la dynamique lente entre les rafales basée sur l’analyse de la récurrence desrafales 47
    18. Tracez l’histogramme des temps de séparation des rafales, avec l’axe des temps de séparation à l’échelle logarithmique.
      NOTE: Deux sous-populations de temps de séparation en rafale apparaîtront:
      Une sous-population majeure avec des temps de séparation de secondes, représentant des sursauts consécutifs provenant de différentes molécules mesurées consécutivement.
      Une sous-population mineure avec des temps de séparation ~<100 ms, représentant des sursauts consécutifs provenant tous deux de la même molécule, récurrents à travers le volume confocal.
    19. Sélectionnez cette option pour enregistrer toutes les paires de sursauts consécutifs qui sont séparés par moins d’un temps de séparation maximal qui définit la sous-population de la même molécule (<100 ms, dans notre cas).
    20. Tracer un histogramme ou un nuage de points des durées de vie moyennes de fluorescence des premier et deuxième sursauts pour toutes les paires de sursauts qui se sont reproduits en dessous d’un certain seuil de temps de séparation

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Résultats

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En tant que PDI, lorsqu’il n’est pas lié à une autre biomolécule, α-Syn présente une dynamique structurelle entre de multiples conformations, avec des transitions à quelques microsecondes40 et même à des centaines de nanosecondes41. Lorsque α-Syn traverse la tache confocale, il peut subir des milliers de transitions entre les conformations. En effet, ce fut le cas lorsque smFRET était utilisé39,40. Ici, nous effectu...

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Des études biochimiques et biophysiques approfondies ont été réalisées pour étudier les caractéristiques structurelles de α-Syn et sa nature désordonnée33,34,35,36,37,38. Plusieurs travaux ont déjà utilisé le smFRET à diffusion libre pour étudier la dynamique intramoléculaire du monomère α-Syn exempt de liaison. Ces travaux o...

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Déclarations de divulgation

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tous les auteurs ne partagent aucun conflit d’intérêts.

Remerciements

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Le mutant plasmidique pT-t7 acodant A56C α-Syn nous a été remis en cadeau par le Dr Asaf Grupi, le Dr Dan Amir et le Dr Elisha Haas. Cet article a été soutenu par les National Institutes of Health (NIH, subvention R01 GM130942 à E.L. en tant que sous-prix), la Fondation israélienne pour la science (subvention 3565/20 dans le cadre du programme de recherche KillCorona - Curbing Coronavirus), le Fonds Milner et l’Université hébraïque de Jérusalem (fonds de démarrage).

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Unités de filtration centrifuge Amicon Ultra-15 MercC7715coupure : 100 kDa
sulfate d’ammoniumSigma-AldrichA4418
BSASigma-AldrichA9647
cystéamineSigma-Aldrich30070
sacs de dialyse - MEGA GeBaFlex-tubeGene Bio-ApplicationMEGA320
dithiothréitol (DTT)Sigma-Aldrich43815
Acide éthylènediaminetétraacétique (EDTA)Sigma-AldrichE5134
Fast SeeBand solution de colorationGene Bio-ApplicationSB050
GlycineSigma-Aldrich50046
D-GlucoseSigma-AldrichG7021
HEPESSigma-Aldrich54457
HiTrap Dessalage 5 mLSigma-AldrichGE17-1408
Acide 6-hydroxy-2,5,7,8-tétraméthylchroman-2-carboxylique (TROLOX)Sigma-Aldrich238813
isopropyle &beta ;-d-1-thiogalactopyranoside (IPTG)Sigma-AldrichI5502
LB bouillonSigma-AldrichL3152
Magnésium chlorureSigma-Aldrich63068
Colonne MonoQSigma-Aldrich54807
protéine LoBind tubeSigma-AldrichEP00301080940,5 mL
Rincer une micro-lame 18Ibidi81816
SDSSigma-Aldrich75746
Acétate de sodiumSigma-AldrichS2889
Hydroxyde de sodiumSigma-AldrichS8045
Phosphate de sodium monobasique monohydratéSigma-Aldrich71507
Épandeurs de cellules stériles, spatules Drigalskimini-plast815-004-05-001
sulfate de streptomycineSigma-AldrichS9137
sulfo-Cy3  ; MaléimideAbcamAB146493
Chlorhydrate de tris(2-carboxyéthyl)phosphine (TCEP)Sigma-Aldrich75259
Tris-HClSigma-Aldrich93363
TryptoneSigma-AldrichT7293
Extrait de levureSigma-AldrichY1625

Références

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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