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Article de méthode

Étude de transfert d’énergie de fluorescence à molécule unique de synthèse de protéines ribosomes

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DOI :

10.3791/62664

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6 juillet 2021

1Department of Biology and Biochemistry, University of Houston

Dans cet article

Résumé

Le transfert d’énergie de fluorescence à molécule unique est une méthode qui suit la dynamique de l’ARNt pendant la synthèse des protéines ribosomiques. En suivant les ribosomes individuels, des populations inhomogènes sont identifiées, ce qui met en lumière les mécanismes. Cette méthode peut être utilisée pour suivre les changements conformationnels biologiques en général afin de révéler les relations dynamique-fonction dans de nombreux autres biosystèmes complexes. Les méthodes à molécule unique peuvent observer des pas de limitation de débit et des intermédiaires clés peu peuplés, qui ne sont pas accessibles par les méthodes d’ensemble conventionnelles en raison de l’effet moyen.

Résumé

Le ribosome est un grand complexe ribonucléoprotéique qui assemble les protéines de manière processive le long des modèles d’ARNm. Le diamètre du ribosome est d’environ 20 nm pour accueillir de grands substrats d’ARNt sur les sites A, P et E. Par conséquent, la dynamique des ribosomes est naturellement déphasée rapidement. La méthode à molécule unique peut détecter chaque ribosome séparément et distinguer les populations inhomogènes, ce qui est essentiel pour révéler les mécanismes complexes des systèmes à plusieurs composants. Nous rapportons les détails d’une méthode smFRET basée sur le microscope inversé Nikon Ti2 pour sonder la dynamique des ribosomes entre la protéine ribosomique L27 et les ARNt. Le L27 est étiqueté à sa position unique Cys 53 et reconstitué en un ribosome conçu pour manquer de L27. L’ARNt est marqué à la région du coude. Au fur et à mesure que l’ARNt se déplace vers différents endroits à l’intérieur du ribosome pendant le cycle d’allongement, tels que la pré- et la post-translocation, l’efficacité et la dynamique fret présentent des différences, qui ont suggéré de multiples sous-populations. Ces sous-populations ne sont pas détectables par les méthodes d’ensemble. Le microscope smFRET basé sur le TIRF est construit sur un microscope inversé manuel ou motorisé, avec un éclairage laser fait maison. Les échantillons de ribosomes sont purifiés par ultracentrifugation, chargés dans une cellule d’échantillonnage multicanal construite à la maison, puis éclairés via un champ laser évanescent. Le point laser à réflexion peut être utilisé pour obtenir un contrôle de rétroaction de la mise au point parfaite. Les signaux de fluorescence sont séparés par une tourelle filtrante motorisée et collectés par deux caméras CMOS numériques. Les intensités sont récupérées via le logiciel NIS-Elements.

Introduction

Le ribosome est un grand complexe ribonucléoprotéique de ø 20 nm d’une grande (50S) et d’une petite (30S) sous-unité. Il assemble de longs peptides le long du modèle d’ARNm de manière processive et coopérative. Le ribosome 30S se lie à l’ARNmfMet et à l’ARNm pour commencer la synthèse des protéines, et le 50S se joint ensuite pour former le complexe d’initiation 70S. Les ARNt apportent des acides aminés au ribosome au site A (site de liaison de l’aRNt aminoacyle), tandis que la chaîne peptidyle allongée est maintenue au site P (site de liaison de l’ARNt peptidyle). Dans le complexe de pré-translocation, la chaîne peptidyle est transférée à l’ARNt au site A avec un acide aminé ajouté. Pendant ce temps, l’ARNt du site P est désacylé. Ensuite, les ARNt A, P se déplacent vers les sites P, E pour former le complexe post-translocation, dans lequel le site E représente le site de sortie de l’ARNt. Dans cet état, le peptidyl-ARNt retourne au site P. Le cycle d’allongement se poursuit entre les pré- et post-conformations tandis que le ribosome se transloque sur l’ARNm, un codon à la fois1. Le ribosome est hautement coordinateur de différents sites fonctionnels pour rendre ce processus efficace et précis, tels que le cliquet inter-sous-unités2,les fluctuations d’hybridation de l’ARNt3,les activations de la GTPase4,l’ouverture-fermeture de la tige L15,etc. Par conséquent, les ribosomes se déphasent rapidement car chaque molécule se déplace à son propre rythme. Les méthodes conventionnelles ne peuvent déduire que des paramètres moyens apparents, mais les espèces peu peuplées ou de courte durée de vie seront masquées dans l’effet moyen6. La méthode à molécule unique peut briser cette limitation en détectant chaque ribosome individuellement, puis identifier différentes espèces via une reconstruction statistique7. Différents sites de profilage ont été mis en œuvre pour sonder la dynamique des ribosomes, tels que les interactions entre l’ARNt-ARNt8,l’EF-G-L119,l’ARNt10,etc. De plus, en étiquetant les grandes et les petites sous-unités, respectivement, on observe une cinétique de cliquet inter-sous-unités et une coordination avec les facteurs11,12. Pendant ce temps, la méthode smFRET a de vastes applications dans d’autres processus biologiques centraux, et les méthodes FRET multicolores émergent13.

Auparavant, une nouvelle paire fret de ribosomes a été développée14,15. La protéine ribosomique recombinante L27 a été exprimée, purifiée et étiquetée, et réincorporée dans le ribosome. Cette protéine a interagi avec les ARNt à une distance rapprochée et a aidé à stabiliser l’ARNt du site P dans le complexe post-translocation. Lorsque l’ARNt se déplace du site A vers le site P, la distance entre cette protéine et l’ARNt est raccourcie, ce qui peut être distingué par le signal smFRET. De multiples sous-populations de ribosomes ont été identifiées à l’aide de méthodes statistiques et de mutagénèse, et l’échange spontané de ces populations dans le complexe pré- mais pas post-translocation suggère que le ribosome est plus flexible avant de se déplacer sur l’ARNm, et plus rigide lors du décodage16,17,18. Ces variations sont essentielles à la fonction du ribosome. Ici, le protocole décrit les détails du labeling ribosome/ARNt, leur incorporation dans le ribosome, la préparation de l’échantillon smFRET et l’acquisition/analyse des données19.

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Protocole

1. Préparation du ribosome et de l’ARNt marqués pour la détection FRET

  1. Isoler le ribosome sans L27 de la souche IW312 d’E. coli selon les protocoles standard20,21. Extraire le ribosome ordinaire de la souche MRE600 d’E. coli.
  2. Cloner le gène rpmA de L27 avec le marqueur His-terminal C en plasmide pET-21b (+), qui est transformé et exprimé dans les cellules BL21(DE3)pLysS15. Purifier la protéine via une colonne de sépharose préemballée.
  3. Étiquetage de L27
    1. Incuber 20-100 μM de L27 purifié dans 100 μL avec un excès de TCEP (Tris-2-carboxyéthyl-phosphine) à température ambiante (RT) pendant 30 min. Échange de tampons la solution en tampon PBS (10 mM Na2HPO4,1,8 mM KH2PO4,2,7 mM KCl; 0,137 M NaCl), à l’aide d’une colonne nap-5. Ajouter 10 fois l’excès de colorant mono-réactif Cy5-maleimide dans le DMSO dans la solution et incuber à RT dans l’obscurité pendant 2 h.
    2. Chargez la solution protéique étiquetée (500 μL) mentionnée ci-dessus sur une colonne Nap-5 pour éliminer l’excès de colorant. Assurez-vous que la protéine élue dans la première bande colorée, suivie de l’élue de colorant libre dans la deuxième bande, respectivement. Recueillir la protéine éluée dans 1 mL de tampon TAM10 (20 mM tris-HCl (pH 7,5), 10 mM Mg (OAc)2,30 mM NH4Cl, 70 mM KCl, 0,5 mM EDTA et 7 mM BME (2-mercaptoéthanol)).
  4. Reconstituer le ribosome avec L27. Mélanger la protéine L27 étiquetée avec une quantité égale de ribosome IW312 dans un tampon TAM10 et incuber à 37 °C pendant 1 h. Retirer la protéine libre par ultracentrifugation du coussin de saccharose (100 000 x g,pendant la nuit) pour permettre au ribosome de former une pastille de couleur bleue au fond du tube.
  5. Étiquetez l’ARNtPhe selon le rapport publié précédemment22. Tout d’abord, incuber l’ARNt (10 A260 dans 1 mL d’eau) avec 100 μL de NaBH4 (stock de 100 mM, en ajoutant goutte à goutte) à 0 °C pendant 1 h. Libérer les ARNt du NaBH4 non réagi grâce à une précipitation d’éthanol trois fois en ajoutant 1/10 volume de 3 M KAc (pH 5,0) et 2,5 fois le volume d’éthanol. Incuber l’ARNt réduit avec 1 μL de solution de colorant Cy3-NHS (1 mg dans 10 μL de DMSO) dans un volume minimum (~20 μL) de 0,1 M de formate de sodium (pH 3,7). Après 2 h d’incubation à 37 °C, séparez l’ARNt du colorant non réagi via une petite colonne G25 Sephadex, puis retirez le colorant libre par précipitation d’éthanol à deux reprises.

2. Préparation des complexes de ribosomes

  1. Exprimer et purifier les protéines marquées His des synthétases IF1, IF2, IF3, EF-G, EF-Tu, EF-Ts et ARNt en utilisant les méthodes standard15.
  2. Préparer le mélange d’amorçage en ajoutant les ingrédients suivants dans le tampon TAM10 à 37 °C pendant 15 min : 1 μM du ribosome étiqueté ; 1,5 μM chacun des IF1, IF2 et IF3; ARNm biotinylé de 2 μM (CODANT MF pour les deux premiers acides aminés); 4 μM d’ARNt fMet-tmet chargéfMet; et 1 mM GTP.
  3. Préparer le mélange EF-Tu_G en mélangeant les ingrédients suivants dans un tampon TAM10 à 37 °C pendant 15 min : 4 μM EF-Tu, 0,4 μM EF-Ts, 2 μM EF-G, 4 mM GTP, 4 mM PEP et 0,02 mg/mL de pyruvate kinase.
  4. Préparez le mélange EF-Tu_NoG similaire à l’étape 2.3 sans EF-G.
  5. Préparer le mélange de Phe en mélangeant les ingrédients suivants dans de l’eau sans nucléase à 37 °C pendant 15 min : 100 mM de Tris (pH 7,5), 20 mM de MgAc2, 1 mM d’EDTA, 4 mM d’ATP, 7 mM de BME, 2 mM de synthétase spécifique à la phénylalanine, 2 A260/mL d’ARNtmarqué Pheet 50 μM de phénylalanine.
  6. Préparer le complexe de pré-translocation (PRE) en mélangeant les mélanges d’initiation, d’EF-Tu_NoG et de Phe dans un rapport de 1:2:2, à 37 °C pendant 2 min. Après incubation, purifier le PRE par 1,1 M d’ultracentrifugation de coussin de saccharose pendant la nuit à 100 000 x g.
  7. Préparer le complexe post-translocation (POST) en mélangeant les mélanges d’initiation, d’EF-Tu_WG et de Phe dans un rapport de 1:2:2, à 37 °C pendant 10 min. Après incubation, purifier le POST par 1,1 M d’ultracentrifugation en coussin de saccharose pendant la nuit à 100 000 x g.

3. Préparation des lames d’échantillons

  1. Nettoyez les lames de verre du microscope (75 mm x 25 mm) contenant six paires de trous (1 mm de diamètre). Chaque paire forme une entrée-sortie de la chambre d’échantillonnage. Assurez-vous que la distance entre chaque trou d’entrée-sortie est de 13 mm et que la distance centre-centre entre deux canaux est de 6 mm. Placez six diapositives dans un creuset en verre.
  2. Remplissez le creuset avec de l’acétone et soniquez-les pendant 5 min. Décantez l’acétone et rincez les lames trois fois à l’eau ultrapure. Remplissez à nouveau le creuset avec de l’eau et 1 mL de 10 M KOH. Sonicate pendant 20 min.
  3. Rincez les lames trois fois à l’eau ultrapure. Remplissez à nouveau le creuset avec de l’éthanol et du sonicate pendant 5 min. Décanter complètement le solvant. Laissez sécher les glissières dans la hotte.
  4. Nettoyez les couvercles en verre du microscope (#1,5 épaisseur, 24 x 40 mm). Effectuez les étapes de nettoyage décrites aux étapes 3.1 à 3.3.
  5. Cuire les glissières et les couvercles nettoyés à 300 °C pendant 3 h. Conservez-les dans la fournaise pendant la nuit pour les refroidir.
  6. Enduire le couvercle avec de l’aminosilane. Dans le creuset contenant des couvercles, verser un mélange de méthanol (100 mL de méthanol, 5 mL d’eau, 0,5 mL de HAc et 1 mL d’aminosilane). Réchauffez le creuset au bain-marie pendant 10 min, soniquez-le pendant 10 min, puis réchauffez le creuset au bain-marie pendant encore 10 min. Décanter le mélange de méthanol, bien rincer le couvercle dans trois creusets d’eau propre. Purgez les surfaces avec un flux d’azote sec à travers une aiguille.
  7. Enduisez les couvercles de biotine-PEG dans une hotte laminaire propre.
    1. Pour fabriquer la solution de PEG, utilisez 98 mg de PEG et 2-3 mg de biotine-PEG dans 200 μL de solution naHCO3 de 100 mM.
    2. Posez un couvercle à plat sur une surface. Déposer délicatement 60 μL de solution de PEG sur le bord supérieur. Ensuite, posez un autre couvercle sur celui-ci, en laissant l’effet capillaire répartir la solution entre les deux couvercles. Assurez-vous qu’aucune bulle ne se forme.
    3. Répétez l’étape 3.7.2 pour deux autres paires de couvercles. Enduisez six morceaux de couvertures avec de la biotine. Si plus de couvercles sont nécessaires, ajustez la quantité de PEG et de Biotine PEG en conséquence pour faire plus de solution PEG.
    4. Conservez ces couvercles dans une boîte à embouts vide remplie d’eau et incubez pendant 3 h dans l’obscurité.
    5. Après 3 h, séparer les couvercles, rincer à l’eau dans trois creusets consécutifs et purger avec un jet d’azote sec. Placez les couvercles enduits sur un support en céramique. Marquez la surface avec un revêtement.
  8. Assembler les chambres d’échantillonnage19.
    1. Tirez les pointes de pipette pointues à travers les trous des glissières en verre jusqu’à ce qu’elles s’ajustent bien. Grattez les extrémités pointues jusqu’à ce qu’elles épuisent complètement à la surface du verre. Coupez l’autre extrémité de la pointe à environ 5 mm pour le chargement de l’échantillon.
    2. Coupez un ruban adhésif double face avec le motif de canal dessus (25 x 40 mm).
    3. Collez le ruban adhésif double face sur les glissières de verre du côté plat.
    4. Collez le couvercle enduit sur le ruban adhésif double face. Appuyez dessus pour faire un joint étanche de la chambre d’échantillonnage. Assurez-vous que le côté enduit est tourné vers l’intérieur.

4. Imagerie FRET à molécule unique

  1. Allumez l’ordinateur.
  2. Allumez l’interrupteur du microscope.
  3. Démarrez l’interface de contrôle laser et allumez le laser. Appuyez sur le bouton d’activation du boîtier de commande laser pour réchauffer le laser.
  4. Allumez les caméras.
  5. Démarrez le logiciel associé au microscope. Cliquez sur l’obturateur supérieur Désactivé et cliquez sur la lampe Allumée.
  6. Préparer le tampon TAM10_WT en ajoutant 10 μL de 5 % de Tween-20 dans 1 mL de tampon TAM10.
  7. Préparer la solution de désoxy en pesant 3 mg de glucose oxydase dans un petit tube de microcentrifugation. Ajouter 45 μL de catalase. Vortex doucement pour dissoudre le solide. Tourner à 20 000 x g dans une microcentrifugeuse pendant 1 min. Prenez le surnageant.
  8. Préparer une solution de glucose à 30% dans de l’eau et une solution de Trolox à 200 mM dans du DMSO.
  9. Préparer 0,5 mg/mL de solution de streptavidine dans de l’eau sans nucléase.
  10. Ajoutez une goutte d’huile d’imagerie à l’objectif du TIRF.
  11. Mettez les chambres d’échantillonnage sur l’objectif.
  12. Remplissez la chambre avec 10 μL de solution de streptavidine. Attendez 1 min.
  13. Lavez la chambre avec 30 mL de tampon TAM10_WT et collectez la solution de ruisselement avec un papier filtre plié. Attendez 1 min.
  14. Diluer les complexes de ribosomes (PRE ou POST) à une concentration de 10-50 nM avec TAM10_WT tampon.
  15. Chargez 20 μL de l’échantillon de ribosome dans le canal. Attendez 2 min.
  16. Fabriquer le tampon d’imagerie (50 μL de tampon TAM10 plus 0,5 μL de solutions de désoxy, de glucose et de Trolox). Mélangez bien le tampon.
  17. Rincer la chambre avec 30 μL de tampon d’imagerie.
  18. Réglez la caméra pour acquérir 100 ms / cadre, 16 bits, 4 x 4 binning.
  19. Cliquez sur l’obturateur supérieur activé et sur la lampe éteinte.
  20. Démarrez l’acquisition de la caméra. Répartissez les images dans trois fenêtres représentant deux caméras individuelles et la superposition.
  21. Cliquez sur Mise au point automatique. Affinez-vous pour trouver le meilleur objectif.
  22. Cliquez sur une méthode. Définissez les points de champ, le stockage de fichiers et le numéro de boucle.
  23. Cliquez sur Exécuter.
    REMARQUE : Une nouvelle fenêtre apparaît avec l’imagerie en temps réel. La progression de la série chronologique et de la série de champ de vision est affichée en haut de la fenêtre.
  24. Une fois l’acquisition de l’image terminée, fermez la fenêtre contextuelle.
  25. Ouvrez le fichier ND (fichier acquis).
  26. Cliquez sur ROI / éditeur de ROI simple. Choisissez l’option Cercle.
  27. Sélectionnez le retour sur investissement sur l’image. Cliquez sur Terminer lorsqu’il est terminé.
  28. Cliquez sur Mesure / Mesure du temps pour afficher les données sous forme de graphique ou de feuille de calcul.
  29. Ouvrez l’onglet Exporter. Définissez les paramètres d’exportation.
  30. Cliquez sur Exporter pour enregistrer les intensités.

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Résultats

Le smFRET avait le ribosome marqué à la position médiane du trafic d’ARNt, pour distinguer la translocation de l’ARNt du site A vers le site P (Figure 1)15. La distance entre le résidu de étiquetage L27 et l’ARNt du site A ou P est de 52 ou 61 Å, respectivement, ce qui correspond à une efficacité FRET de 0,47 et 0,65. Après la collecte de l’image, les intensités de fluorescence des canaux donneur et accepteur ont été récupérées et tracées en accéléré

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Discussion

SmFRET est sensible aux signaux d’arrière-plan. Tout d’abord, il est nécessaire de recouvrir la chambre d’échantillonnage d’une interpolation à 0,05%, puis d’être ajouté en même temps que la solution de ribosome pour bloquer la liaison non spécifique du ribosome à la surface. Pour voir la fluorescence de l’émission de cy5 de l’accepteur, le cocktail piégeur d’oxygène (solutions de désoxy, de glucose et de Trolox) est essentiel. Sans cette solution, le blanchiment est trop rapide dans le canal accepteur pour obtenir des i...

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Déclarations de divulgation

Y. Wang ne déclare aucun conflit d’intérêts.

Remerciements

Ce travail est soutenu par les National Institutes of Health des États-Unis (R01GM111452) et la Welch Foundation (E-1721).

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
AminosilaneLaysanbioMPEG-SIL-5000
Biotin-PEGLaysanbioBiotin-PEG-SVA-5000
BL21(DE3)pLysS cellulesNovagen71403
Catalasemillipore sigmaC3515
CS150FNX Micro Ultracentrifugenuaire
Cy3/C5-maleimideApexBioA8138/A8140
ECLIPSE Ti2 Microscope inverséNikon
EdgeGARD Capot à flux laminaireBaker
Glucose oxydasemillipore sigmaG2133
Histrap HP (Colonne de sépharose préemballée)Cytiva17524701
Housse de microscopeVWR48393-230
Lames de microscope en verreVWR470235-792
ORCA-Flash4.0 V3caméra Hamamatsu
PEG (5,000)LaysanbioMPEG-SVA-5000
pET-21b (+) plasmideNovagen69741
SonicateurVWRCPX-952-518R
TCEPApexbioB6055
TroloxMillipore Sigma238813

Références

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Réimpressions et autorisations

Mots-clés

FRET mol cule uniquedynamique du ribosomemouvement de l ARNtmicroscopie TIRFpurification par ultracentrifugationmarquage de la prot ine L27inhibition par antibiotiquesimagerie en acc l r
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