Cet article décrit les procédures utilisées pour évaluer la toxicité du rayonnement UV et des toxines chimiques sur une lignée cellulaire primaire et immortalisée.
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Article de méthode
Détermination de la toxicité du rayonnement UV et des produits chimiques sur les cellules épithéliales cornéennes humaines primaires et immortalisées
Dans cet article
Résumé
Résumé
Cet article décrit les méthodes de mesure de la toxicité du rayonnement ultraviolet (UV) et des toxines oculaires sur des cultures de cellules épithéliales cornéennes humaines primaires (CSHCp) et immortalisées (CSHCi). Les cellules ont été exposées au rayonnement UV et à des doses toxiques de chlorure de benzalkonium (BAK), de peroxyde d’hydrogène (H2O2) et de dodécylsulfate de sodium (SDS). L’activité métabolique a été mesurée à l’aide d’un test métabolique. La libération de cytokines inflammatoires a été mesurée à l’aide d’un test multiplex interleukine (IL)-1β, IL-6, IL-8 et facteur de nécrose tumorale alpha (TNF-α), et la viabilité des cellules a été évaluée à l’aide de colorants fluorescents.
Les effets néfastes des UV sur l’activité métabolique cellulaire et la libération de cytokines se sont produits à 5 minutes d’exposition aux UV pour l’HCi et à 20 minutes pour les HCECp. Des pourcentages similaires de baisse de l’activité métabolique de l’iHCEC et du pHCEC se sont produits après l’exposition au BAK, H2O2 ou SDS, et les changements les plus significatifs dans la libération de cytokines se sont produits pour l’IL-6 et l’IL-8. La microscopie des cellules exposées à des CSHCi et aux CSHCp Baka a montré la mort cellulaire à 0,005 % d’exposition au BAK, bien que le degré de coloration à l’éthidium soit plus élevé dans les CSEi que dans les CSHCp. En utilisant de multiples méthodes d’évaluation des effets toxiques à l’aide de la microscopie, des évaluations de l’activité métabolique et de la production de cytokines, la toxicité du rayonnement UV et des toxines chimiques a pu être déterminée pour les lignées cellulaires primaires et immortalisées.
Introduction
Des études toxicologiques in vitro sont effectuées pour prédire les effets toxiques des produits chimiques et d’autres agents qui peuvent causer des dommages aux cellules. Dans l’évaluation de la toxicité pour la cornée, les cellules épithéliales cornéennes humaines (CSHC) ont été utilisées dans des modèles pour évaluer ces effets 1,2,3,4. Ces modèles évaluent généralement les effets physiologiques tels que les changements dans l’activité métabolique de la cellule, la prolifération cellulaire et d’autres fonctions cellulaires telles....
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Protocole
1. Culture des HCECs et des iHCEC
- Cultiver les CSECs et les CSEi dans un milieu épithélial oculaire humain (HOEM) avec les suppléments suivants : 6 mM de L-glutamine, 0,002 % de supplément de milieu cellulaire O (table des matières), 1,0 μM d’épinéphrine, 0,4 % de supplément de milieu cellulaire P (tableau des matériaux), 5 μg/mL d’insuline rh, 5 μg/mL d’apotransférrine et 100 ng/mL d’hémisuccinate d’hydrocortisone dans des flacons de culture enrobés de collagène-1 (18 mL dans une fiole de culture de 75 cm2).
- Changez le milieu dans les flacons tous les 2-3 jours en retirant le milieu après que les cellul....
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Résultats
Taille de la cellule
Les HCEC primaires et immortalisés ont été visualisés avec trois colorants fluorescents, qui reflètent trois stades différents de viabilité cellulaire. Les cellules vivantes sont vertes (calcéine-AM), les cellules mortes sont rouges (homodimère-1 d’éthidium) et les cellules apoptotiques sont jaunes (couleur ajustée par ordinateur V-annexine pour une meilleure visualisation du signal de fluorescence). Les cellules vivantes contiennent des estérases dans le cytoplasme cellulaire et .......
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Discussion
Les différences potentielles dans l’utilisation de deux types de HCEC ont été évaluées. Les cellules ont été placées dans le même milieu (HOEM) à des concentrations identiques de cellules, puis exposées à de courtes et longues périodes de rayonnement UV et à trois toxines oculaires. Les doses de rayonnement UV et de produits chimiques ont été sélectionnées en fonction de leurs effets physiologiques, qui étaient suffisamment dommageables pour les cellules pour produire des réponses intermédiaires pouvant être comparées. D.......
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Déclarations de divulgation
L’auteur, Lyndon W. Jones, au cours des 3 dernières années, par l’intermédiaire de CORE, a reçu un soutien à la recherche ou des honoraires de conférencier des sociétés suivantes: Alcon, Allergan, Allied Innovations, Aurinia Pharma, BHVI, CooperVision, GL Chemtec, i-Med Pharma, J & J Vision, Lubris, Menicon, Nature’s Way, Novartis, Ophtecs, Ote Pharma, PS Therapy, Santen, Shire, SightGlass SightSage et Visioneering. Lyndon Jones est également consultant et/ou siège à un conseil consultatif pour Alcon, CooperVision, J&J Vision, Novartis et Ophtecs. Les autres auteurs n’ont rien à divulguer.
Remerciements
Les auteurs n’ont reçu aucun financement pour ce travail.
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| 75 cm2 Flacon ventilé | Corning | 354485 | Il s’agit de la marque BioCoat, plaque |
| 96 puits | costar | 3370 | |
| alamarBlue | Fisher Scientific | dal 1025 | |
| Annexin Staining solution | Invitrogen, Burlington, ON, Canada | ||
| Annexin V | Invitrogen, Burlington, ON, Microscope Canada | ||
| Axiovert 100 avec un microscope confocal à balayage laser Zeiss Système 510 | Carl Zeiss Inc., Allemagne | ||
| Corning 48 Plaques de puits | Corning | 354505 | Il s’agit de la marque BioCoat, |
| Cytation 5 | BioTek | CYT5MPV | Peut lire la fluorescence de 280 à 700 nm (pour le dosage 540/590) |
| Hycone | sérique de veau fœtal | SH30396.03 | |
| lamelles à fond de verre | MatTek Corporation, Ashland, MA, États-Unis | ||
| Cellules épithéliales cornéennes humaines | l’Université d’Ottawa | N/A | SV40 Cellules épithéliales cornéennes humaines immortalisées par le Dr M. Griffith (Institut de recherche sur l’œil d’Ottawa, Ottawa, Canada) et ont été caractérisées Griffith M, Osborne R, Munger R, Xiong X, Doillon CJ, Laycock NL, Hakim M, Song Y, Watsky MA. Équivalents cornéens humains fonctionnels construits à partir de lignées cellulaires. Science. 1999;286:2169-72. |
| Média d’épithélium oculaire humain (HOEM) avec les suppléments suivants : | Millipore, Billerica, MA, États-Unis | SCMC001 | milieu de base Epigro complété par 6 mM de L-Glutamine, 0,002 % d’EpiFactor O (supplément de milieu cellulaire O dans l’article) , 1,0 &mu ; M Épinéphrine, 0,4 % d’EpiFactor P (supplément de milieu cellulaire P dans l’article), 5 &mu ; g/mL d’insuline, 5 &mu ; g/mL d’Apo-Transferrin et 100 ng/mL d’hydrocortisone Hemisuccinate dans des flacons de culture enrobés de Collagène-1 (BioCoat, Corning, Tewksbury, MA, États-Unis). |
| Calcien et homodimère d’éthidium morts vivants | Invitrogen, Burlington, ON, Canada | ||
| MesoScale Discovery (MSD) QuickPlex SQ 120 instrument | Rockville, MD, USA | ||
| MSD Human Proinflammatory Panel II (4-Plex) V-Plex assay | Rockville, MD, USA | ||
| Pénicilline Streptomycine | Gibco | 15140-122 | Concentration 100x donc ajouter 1 mL à chaque 99 mL de milieu |
| Cellules épithéliales cornéennes primaires | Millipore, Billerica, MA, États-Unis | SCCE016 | |
| Lecteur de plaques multipuits à fluorescence SpectraMax | Molecular Devices, Sunnyvale, CA, États-Unis | ||
| TrypLE Express (solution de dissociation cellulaire) | Fisher Scientific | 12605036 |
Références
- McCanna, D. J., Harrington, K. L., Driot, J. Y., Ward, K. W., Tchao, R. Use of a human corneal epithelial cell line for screening the safety of contact lens care solutions in vitro. Eye & Contact Lens. 34 (1), 6-12 (2008).
- Xu, M., Sivak, J. G., McCanna, D. J.
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Réimpressions et autorisations
