Croissance, purification et titrage du virus oncolytique de l’herpès simplex

Summary

Dans ce manuscrit, nous décrivons une méthode simple de croissance, de purification, et de titrage du virus oncolytique de simplex d’herpès pour l’usage préclinique.

Abstract

Les virus oncolytiques (OV), tels que le virus oncolytique de l’herpès simplex (oHSV), sont une stratégie de traitement en croissance rapide dans le domaine de l’immunothérapie du cancer. Les VQ, y compris le VSS O, se répliquent sélectivement dans les cellules cancéreuses et les tuent (épargnant les cellules saines/normales) tout en induisant une immunité antitumorale. En raison de ces propriétés uniques, les stratégies de traitement basées sur le vHS OHS sont de plus en plus utilisées pour le traitement du cancer, précliniquement et cliniquement, y compris le talimogene laherparevec (T-Vec) approuvé par la FDA. La croissance, la purification et le titrage sont trois techniques de laboratoire essentielles pour tout OV, y compris les VHSO, avant qu’ils ne puissent être utilisés pour des études expérimentales. Cet article décrit une méthode simple étape par étape pour amplifier l’oHSV en cellules de Vero. À mesure que les vhso se multiplient, ils produisent un effet cytopathique (CPE) dans les cellules vero. Une fois que 90-100% des cellules infectées montrent un CPE, elles sont doucement récoltées, traitées avec de la benzonase et du chlorure de magnésium (MgCl_2),filtrées, et soumises à la purification utilisant la méthode de saccharose-gradient. Après purification, le nombre d’oHSV infectieux (désigné comme unités formant plaque ou PPU) est déterminé par un « test de plaque » dans les cellules Vero. Le protocole décrit ici peut être employé pour préparer le stock d’oHSV de haut-titre pour des études in vitro dans la culture cellulaire et les expériences in vivo d’animal.

Introduction

Les virus oncolytiques (VE) sont une forme émergente et unique d’immunothérapie du cancer. Les OV se répliquent sélectivement dans les cellules tumorales et les lysent (épargnant les cellules normales/saines)¹ tout en induisant une immunité antitumorale². Le virus oncolytique de l’herpès simplex (oHSV) est l’un des virus les plus étudiés parmi tous les OVs. Il est le plus avancé dans la clinique, talimogene laherparepvec (T-VEC) étant le premier et le seul OV à recevoir l’approbation de la FDA aux États-Unis pour le traitement du mélanome avancé³. En plus du T-VEC, de nombreux autres oHSVs génétiq....

Protocol

1) Croissance de l’oHSV

NOTA : Assurer l’approbation du comité de biosécurité de l’établissement avant de travailler avec le VSSO. Cette étude a été menée dans le cadre du Protocole N° 18007 approuvé par le CIB. Maintenir les précautions BSL2 : blanchir toutes les pipettes, pointes, tubes et autres matières qui entrent en contact avec le virus. Vaporisez les gants avec 70% d’alcool isopropylique avant que les mains ne quittent la hotte de culture cellulaire BSL2. Lavez-vous toujours soigneusement les mains à l’eau savonneuse après avoir travaillé avec un virus.

1. Le jour -1, ensemencer des cellules Vero à faible passage dans des fio....

Results

Un bref aperçu de l’ensemble du protocole est représenté à la figure 1,qui représente les étapes critiques impliquées dans la croissance, la purification et le titrage de l’oHSV. Les CPE dans les cellules Vero peuvent être détectées dès 4 h après l’infection par le VHS¹⁹. La figure 2 montre l’ŒP dans les cellules Vero à trois moments différents suivant l’infection par le VHSO. Le niveau du CPE augmente au fil du temps. Dans ce protocole, .......

Discussion

Le protocole commence par la croissance de l’oHSV dans les cellules Vero à faible passage. La confluence de la monocouche de cellules Vero devrait être d’environ 80% au moment de l’inoculation du virus, car les cellules envahies par la prolifération peuvent développer des structures fibreuses serrées qui peuvent réduire l’entrée de l’oHSV dans les cellules vero²⁰. Une fois que 90-100% CPE est observé, le surnageant de culture est retiré, les cellules sont récoltées, remises en suspension dans VB /.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Tubes à centrifuger		Sigma
15 mL Tubes à centrifuger en polypropylène	Falcon	352097
50 mL	Falcon	352098
Plaques de culture cellulaire à 6 puits	Falcon	353046
Benzonase Nucléase	Sigma	E8263-25KU
Racleur	Fisher Scientific	179693
Diméthyl sulfoxyde	Sigma	D2650-100ML
Dulbecco' s Eagle Medium	modifié Corning	MT-10-013-CV
Dulbecco' s Phosphate Tamponné Saline	Corning	MT-21-031-CV
Sérum de veau fœtal	Hyclone	SH3007003
Giemsa Stain	Sigma	G3032
Glutaraldéhyde	Fisher Scientific	50-262-23
Glycérol	Sigma	G5516
Hank’s Balanced Salt Solution (HBSS)	Corning	MT-21-021-CV
à haute teneur en glucose Dulbecco' s Saline	Sigma	D4031
Immunoglobuline humaine	Gamastan	NDC 13533-335-12
Chlorure de magnésium	Fisher Chemical	M33-500
Filtre de stérilisation, 250 mL	Nalgene, Fisher Scientific	09-740-25E
Filtre de stérilisation des supports, 500 mL	Nalgene, Fisher Scientific	09-740-25C
Solution rouge neutre	Sigma	N4638
Paraformaldéhyde	Fisher scientific	; 15710S
Culbuteur à plaques	Fisher	88861043
Ferricyanure de potassium	Sigma	P8131
Ferrocyanure de potassium	Sigma	P9387
Chlorure de sodium	Fisher Chemical	S271-3
Sorvall ST 16R Centrifugeuse	ThermoFisher Scientific	75004381
Sorvall ST 21R Centrifugeuse	ThermoFisher Scientific	75002446
Tubes de microcentrifugation stériles avec bouchons à vis	Fisher Scientific	02-681-371
Saccharose	Fisher Scientific	BP220-1
Filtre à seringue, 0,45 PVDF	MilliporeSigma	SLHV033RS
Filtre à seringue, 0,8 MCE	MilliporeSigma	SLAA033SS
Filtre à seringue, 5 & micro ; m PVDF	MilliporeSigma	SLSV025LS
T150 flacon de culture	Falcon	355001
Tris-HCl	MP Biomedicals LLC	816116
Bain-marie à ultrasons	Branson	CPX-952-116R
X-gal	Corning	46-101-RF