Profilage des polysomes sans générateurs de gradient ni systèmes de fractionnement

Summary

Ce protocole décrit comment générer un profil polysomique sans utiliser de générateurs de gradient automatisés ou de systèmes de fractionnement de gradient.

Abstract

Le fractionnement des polysomes par centrifugation par gradient de densité saccharose est un outil puissant qui peut être utilisé pour créer des profils de ribosomes, identifier des ARNm spécifiques traduits par les ribosomes et analyser les facteurs associés aux polysomes. Bien que les fabricants de gradient automatisés et les systèmes de fractionnement de gradient soient couramment utilisés avec cette technique, ces systèmes sont généralement coûteux et peuvent être prohibitifs pour les laboratoires qui ont des ressources limitées ou qui ne peuvent pas justifier la dépense en raison de leur besoin peu fréquent ou occasionnel d’effectuer cette méthode pour leurs recherches. Ici, un protocole est présenté pour générer de manière reproductible des profils de polysomes en utilisant l’équipement standard disponible dans la plupart des laboratoires de biologie moléculaire sans instruments de fractionnement spécialisés. De plus, une comparaison des profils de polysomes générés avec et sans système de fractionnement par gradient est fournie. Les stratégies visant à optimiser et à produire des profils polysomiques reproductibles sont discutées. Saccharomyces cerevisiae est utilisé comme organisme modèle dans ce protocole. Cependant, ce protocole peut être facilement modifié et adapté pour générer des profils de ribosomes pour de nombreux organismes et types de cellules différents.

Introduction

Les ribosomes sont des complexes de ribonucléoprotéines méga-Dalton qui effectuent le processus fondamental de traduction de l’ARNm en protéines. Les ribosomes sont responsables de la synthèse de toutes les protéines d’une cellule. Les ribosomes eucaryotes comprennent deux sous-unités désignées comme la petite sous-unité ribosomique (40S) et la grande sous-unité ribosomique (60S) en fonction de leurs coefficients de sédimentation. Le ribosome entièrement assemblé est désigné comme le monosome 80S. Les polysomes sont des groupes de ribosomes engagés dans la traduction d’une seule molécule d’ARNm. Le fractionnement des polysomes par centrifugation par gradient de densit....

Protocol

1. Préparation de gradients de saccharose de 7% à 47%

REMARQUE: La plage linéaire du gradient de saccharose peut être modifiée pour obtenir une meilleure séparation en fonction du type de cellule utilisé. Ce protocole est optimisé pour les profils polysomiques de S. cerevisiae.

1. Préparer des solutions mères de saccharose à 7 % et 47 % dans un tampon gradient de saccharose (20 mM Tris-HCl pH 7,4, 60 mM KCl, 10 mM MgCl2 et 1 mM DTT). Filtrer stériliser les solutions de saccharose à travers un filtre de 0,22 μm et conserver à 4 °C.
2. Préparer 14 mL de solutions de saccharose à 17 %, 27 % et 37 % en distribu....

Results

Trois profils de polysomes représentatifs sont présentés à la figure 3. Tous les profils proviennent de la même souche de levure. Un profil polysomique typique aura des pics bien résolus pour les sous-unités ribosomales 40S, 60S et 80S ainsi que pour les polysomes. La crête de chaque sous-unité ribosomique et pic de polysome sera apparente sur chaque profil (Figure 3). Un profil représentatif d’un système automatisé de fractionnement de densité est illustré à

Discussion

Ici, une méthode pour créer des profils polysomiques sans utiliser de systèmes de fractionnement automatisés coûteux a été décrite. L’avantage de cette méthode est qu’elle rend le profilage des polysomes accessible aux laboratoires qui ne disposent pas de systèmes de fractionnement automatisés. Les principaux inconvénients de ce protocole sont le fractionnement manuel fastidieux et la sensibilité réduite par rapport au système de fractionnement de densité dédié.

Ce protocole implique une prépa.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Fractionneur automatique	Brandel
clariostar Lecteur de plaques multimode	BMG Labtech
Cycloheximide	Sigma Aldrich	C7698
Dithiothreitol	Invitrogen	15508-013
Perles de verre, lavées à l’acide	Sigma Aldrich	G8772	425&ndash ; 600 &mu ; m
Héparine	Sigma Aldrich	H4784
Chlorure de magnésium, 1 M	KD Medical	CAC-5290
Aiguille, 22 G, Moyeu métallique	Hamilton Company	7748-08	longueur personnalisée 9 pouces, style de pointe 3
Optima XL-100K Ultracentrifugeuse	Beckman Coulter
centrifuger en polypropylène	Beckman Coulter	331372
Tube à essai en polypropylène Peg Rack	Fisher Scientific	14-810-54A
Chlorure	de potassium Sigma Aldrich	P9541
Qubit 4 Fluoromètre	Thermo Fisher Scientific	Q33228
Qubit RNA HS Assay Kit	Thermo Fisher Scientific	Q32855
Inhibiteur de l’ARNASE	Applied Biosystems	N8080119
Sucrose	Sigma Aldrich	S0389
SW41 Rotor à godet oscillant Paquet	Beckman Coulter	331336
seringue, 3 mL	Coviden	888151394
Tris, 1 M,  ; pH 7,4	KD Medical	RGF-3340
Triton X-100	Sigma Aldrich	X100
UV-Star Microplaque, 96 puits	Greiner Bio-One