Analyse RMN quantitative ³¹P des lignines et des tanins

Cette procédure, qui a été récemment publiée dans Nature Protocols^1, a été citée plus de 3 000 fois dans la littérature archivistique et est devenue une mesure de routine pour la caractérisation de la lignine et du tanin, car elle fournit des informations structurelles essentielles, rapides et reproductibles.

Lignine et tanins
Lorsque la chimie verte a été introduite par Paul T. Anastas et John C. Werner^2,3,elle a radicalement changé la conception générale de la chimie. En particulier, l’importance d’utiliser des matériaux durables au lieu de matières premières fossiles, telles que le pétrole et le charbon, comme point de départ est soulignée comme un aspect crucial^2,3. Parmi les différents types de biomasse, la lignine est le biopolymère aromatique le plus abondant et peut être considérée comme une source potentielle de produits industriels et de produits à forte valeur ajoutée⁴.

La lignine est le deuxième constituant du bois le plus abondant (la cellulose étant la première et l’hémicellulose la troisième). Sa teneur en plantes varie selon le type de plante : par exemple les feuillus caractérisés par une quantité de lignine plus faible que les résineux (20 % ± 4 % vs 28 % ± 4 %). De plus, la distribution de la lignine dans les tissus végétaux n’est pas homogène: la teneur en lignine la plus élevée peut être trouvée dans la paroi cellulaire^5,6. La lignine est un matériau polyphénolique obtenu industriellement comme sous-produit de l’industrie du papier/cellulose⁷. Il est récupéré à partir du processus de mise en pâte du bois, dans lequel les copeaux de bois sont principalement traités en présence de conditions d’ions OH^- et / ou OH + HS^- pour séparer la cellulose de l’hémicellulose et de la lignine (procédés Soude et / ou Kraft)^8,9.

Les premières tentatives d’étude de la lignine ont été faites par Payen et Schultze, respectivement, en 1838 et 1865¹⁰. En 1977, Adler a résumé toutes les connaissances pertinentes disponibles de cette époque¹¹. Il est actuellement reconnu que les éléments constitutifs de la lignine sont trois unités phényl-propanoïdes : lesalcools p-coumaryl, coniféryle et sinapylique. Ces monomères, grâce à un procédé de polymérisation radicalique, donnent naissance à des unités p-hydroxyphényle, giacyle et sinapyle qui finissent par constituer largement la lignine(Figure 1)12. L’absence de structure primaire dans les lignines implique une difficulté inhérente à sa caractérisation structurelle. En conséquence, l’évaluation de la distribution du poids moléculaire a toujours été quelque peu controversée. La lignine de bois broyée, la lignine isolée dans des conditions douces qui se rapprochent principalement de la protolignine^10,est composée d’oligomères¹³ qui interagissent fortement via des processus d’agrégation supramoléculaires^14,15.

Figure 1: Un modèle représentatif de la lignine résineux dans lequel les différents types de liaisons sont mis en évidence. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Les lignines sont généralement classées en fonction : (a) du type de bois dont elles sont dérivées (p. ex. feuillus et résineux), (b) du procédé utilisé pour l’isoler. Les types de lignine industrielle les plus cruciaux sont Kraft, Lignosulfonates et Organosolv.

La structure de la lignine dépend fortement de son origine et de sa chimie de traitement. Plus précisément, lorsque la structure plutôt complexe et irrégulière de la lignine est aggravée par sa diversité naturelle et les chimies de traitement complexes, un matériau d’extrême variabilité, diversité et hétérogénéité émerge, limitant son utilisation à des applications de faible valeur¹⁶. Alors que les lignines de résineux contiennent principalement des unités de giacyle (G) avec des quantités négligeables de groupes p-hydroxyphényle (lignine G), les lignines de feuillus sont composées de sous-unités de giacyle et de syringyle (lignine GS) dans des proportions variables et les lignines d’herbe sont constituées de sous-unités de giacyle, de syringyle et de p-hydroxyphényle (lignine GSH). L’approche extractive utilisée pour l’isolement affecte considérablement la structure de la lignine¹⁷émergente. La figure 2 illustre trois structures de lignine, qui diffèrent selon l’approche d’isolement utilisée. Certaines considérations concernant l’effet de la méthode d’extraction pourraient être soulignées. Tout d’abord, la lignine Kraft est une lignine désalkylée, très fragmentée et condensée, tandis que la lignine Organosolv a une structure similaire à la lignine de bois fraisée (isolée en utilisant l’approche de Bjorkman)^18,19,20. Enfin, les lignosulfonates se caractérisent par un degré élevé de sulfonation, en fonction de l’intensité et des conditions du processus de sulfonation extractive.

Figure 2: Structures représentatives des lignines techniques. Dans cette figure, les différences entre les différents types de lignine peuvent être vues. (A) La lignine Kraft résineux est fortement condensée, (B) les lignosulfonates sont caractérisés par des groupes sulfoniques sur des carbones saturés, et (C) la lignine organosolv a une structure similaire à celle de la lignine de bois broyée. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Semblables aux lignines, les tanins sont des composés polyphénoliques que l’on trouve dans les plantes. Une revue récente et mise à jour sur les approches et les applications extractives des tanins a récemment été publiée par Das et al.²¹. L’importance des tanins dans la vie quotidienne peut être soulignée à l’aide de deux exemples : ils confèrent du goût et de la couleur aux vins²²; de plus, leur structure polyphénolique offre des caractéristiques antioxydantes et les rend idéales pour une application dans l’industrie du tannage²³. Les tanins sont divisés en deux classes: hydrolysables et non hydrolysables. Les tanins hydrolysables peuvent être considérés comme un polymère d’esters d’acide gallique, di-gallique et ellagique (Figure 3). Ces esters résultent de l’estérification des acides phénoliques avec des molécules de sucre (par exemple, le glucose, la rhamnose et l’arabinose).

Figure 3: Tanins hydrolysables typiques : acide tannique, vescalgin. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Les tanins non hydrolysables, également connus sous le nom de tanins condensés, sont des polymères et des oligomères dérivés du flavan-3-ols. Parmi les flavan-3-ols, les catéchines et la gallocatéchine sont les plus fréquentes. Ce sont des composés cristallins incolores (Figure 4). La polymérisation crée un polymère caractérisé par une structure hélicoïdale. Les groupes hydroxy aromatiques sont dirigés vers l’extérieur de l’hélice, tandis que les oxygènes pyranes sont à l’intérieur.

Figure 4: Structures de la proantocyanidine : R =H, OH, OCH₃. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Caractérisation des lignines et des tanins par RMN
Deux types d’informations sont cruciaux dans la caractérisation de la lignine ou du tanin : (a) la structure chimique (par exemple, la teneur en groupe hydroxy, la nature et la fréquence des liaisons interunitaires) et (b) le poids moléculaire et la polydispersité. Depuis les premières études sur la lignine, différentes techniques ont été utilisées pour atteindre ces objectifs, et deux classes de méthodes ont émergé: les méthodes chimiques et physiques.

En chimie de la lignine, les méthodes chimiques, telles que l’oxydation alcaline du nitrobenzène, la dérivatisation suivie d’un clivage réducteur, l’oxydation du permanganate et la thioacidolyse, ont été historiquement largement^{utilisées 24},^25,26^,27,28,29. Cependant, même si les protocoles analytiques ont été mis en œuvre et optimisés, ils sont chronométrés, laborieux et nécessitent des compétences expérimentales étendues³⁰. Alternativement, dès le début de l’analyse instrumentale, des méthodes physiques ont été utilisées pour effectuer des caractérisations de lignine et de tanin³¹. Ces techniques permettent de surmonter les problèmes des méthodes classiques, ce qui facilite la caractérisation de la structure de la lignine.

La résonance magnétique nucléaire (RMN) permet d’obtenir des informations sur la structure de la lignine et la composition chimique parmi les techniques instrumentales. En particulier, les données des spectres RMN monographiques quantitatifs ¹H et des spectres RMN ^{quantitatifs 13}C peuvent fournir des informations sur différents types de liaisons interunitaires de lignine^32,33,34,35. Malheureusement, les spectres monodimensionnels souffrent du chevauchement des signaux, ce qui peut sérieusement compromettre les efforts d’intégration des signaux. Les versions quantitatives de HSQC (Heteronuclear Single Quantum Coherence), Q-HSQC (Quantitative - Heteronuclear Single Quantum Coherence), ont été utilisées pour mieux comprendre la structure de la lignine, fournissant des informations utiles sur les liens internes. Cependant, ils ne peuvent pas être pleinement utilisés pour déterminer quantitativement les différentes unités de^{bâtiments 13}, 36^,37.

Pour surmonter les problèmes associés à la RMN monodimensionnelle et bidimensionnelle, la dérivatisation du substrat a été envisagée. Parmi les avantages de cette approche, il y a le fait que des étiquettes spécifiques peuvent être introduites au sein de la macromolécule complexe et qu’aucune interférence spectrale ne résulte du solvant dans lequel les substrats marqués sont dissous¹. Verkade a été le pionnier dans ce domaine, effectuant une analyse ^{RMN 31}P des dérivés du phosphore, des dérivés du charbon et des composés apparentés³⁸. Dans sa publication, un criblage de différents réactifs contenant du phosphore (phospholanes) a été effectué, et le changement chimique d’autres composés marqués a été enregistré. L’équipe d’Argyropoulos a introduit pour la première fois la dérivatisation pour l’analyse quantitative et qualitative des groupes hydroxy dans la lignine en 1991. Après avoir étudié la dérivatisation de composés modèles de lignine à l’aide de réactifs contenant du phosphore, son groupe a ouvert la voie à l’une des techniques les plus utilisées quotidiennement en chimie de la lignine, l’analyse RMN ³¹P^{39,40,41,42,43}. Parmi les différents phospholanes examinés, Argyropoulos est arrivé à l’utilisation du 2-chloro-4,4,5,5-tétraméthyl-1,3-2-dioxaphospholane (TMDP) comme étant le plus approprié pour effectuer une analyse de lignine⁴⁴. Le TMDP réagit sélectivement avec les groupes hydroxy provoquant la formation quantitative de dérivés contenant du phosphore caractérisés par des décalages chimiques spécifiques ^{de RMN 31}P (Figure 5).

Figure 5: Chimie de la lignine et de la phosphytation des tanins. Le étiquetage des groupes H lignine et tanin labile est réalisé par réaction in situ. Les polyphénols marqués sont caractérisés par des bandes ^{RMN 31}P spécifiques correspondant aux différents types de groupes hydroxy. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

La dérivatisation de l’échantillon est effectuée dans un mélange pyridine/chloroforme (1,6:1); ce choix résulte d’une évaluation précise. La pyridine présente deux avantages. Tout d’abord, la sélection d’un solvant caractérisé par un paramètre hildebrand d’environ 22,1 MPa^1/2 simplifie et amplifie la solubilisation de la lignine^45. Par conséquent, l’ajout de pyridine en tant que solvant, dont le paramètre de Hildebrand est égal à 21,7, est donc optimal. Deuxièmement, la réaction du TMDP avec les groupes hydroxy s’accompagne de la formation d’acide chlorhydrique (HCl) en tant que sous-produit avec des implications négatives concomitantes pour la formation facile de dérivés de lignine-phospholane. Pour cette raison, le HCl résultant doit être neutralisé. Lorsqu’elle est présente en excès significatif, la basicité de la pyridine, par rapport au TMDP, permet la neutralisation du HCl (via la formation de chlorhydrate de pyridine).

L’utilisation du système de solvant binaire pyridine/chloroforme deutéré recommandé est basée sur trois raisons. Tout d’abord, il favorise la dissolution de l’échantillon. Deuxièmement, comme le chlorhydrate de pyridine est soluble dans le chloroforme, il peut empêcher les précipitations et la détérioration du spectre final. Troisièmement, le chloroforme deutéré est choisi pour son signal singlet unique, permettant le verrouillage du spectromètre RMN pendant le processus d’acquisition. La dérivatisation de l’échantillon est effectuée en présence d’un étalon interne. De cette façon, lorsque l’échantillon et l’étalon sont dérivés, la comparaison des intégrales des pics de l’échantillon et de l’étalon permet de quantifier la quantité pour chaque type de groupe hydroxy présent. Divers composés ont été considérés comme des normes internes. Ces composés sont caractérisés par un seul groupe hydroxy par molécule, offrant un seul signal net dans le spectre RMN ³¹P après dérivatisation. Le choix de la norme doit être fait avec soin. Son signal ne doit pas se chevaucher avec ceux de l’échantillon dérivé. Le cholestérol était largement utilisé au début. Cependant, un chevauchement partiel avec les signaux provenant du groupe hydroxy aliphatique limite son utilisation. Pour l’analyse de routine, les solutions étalons internes de N-hydroxy-5-norbornène-2,3-dicarboximide (NHND) sont préférées. Cependant, en raison de l’instabilité du NHND, ses solutions standard ne peuvent être stockées que pendant quelques jours⁴⁶.

L’organigramme suivant(figure 6)décrit l’ensemble du protocole expérimental pour effectuer une analyse RMN ³¹P des lignines et des tanins.

Figure 6: Procédure pour l’analyse RMN ³¹P des lignines et des tanins. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

1. Prétraitement de l’échantillon

1. Sécher une aliquote (environ 100 mg) de l’analyte (échantillon de lignine ou de tanin) pendant la nuit dans un four à vide réglé à 40 °C.
   REMARQUE: Une attention particulière est nécessaire sur le choix de la température car des températures supérieures à 40 ° C peuvent modifier chimiquement la structure sensible des polyphénols examinés.
2. Après séchage, transférer rapidement l’échantillon dans un dessiccateur de sulfate de calcium anhydre jusqu’à ce qu’il atteigne la température ambiante. Cette étape est obligatoire pour éviter que l’échantillon n’absorbe l’humidité de l’environnement.

2. Préparation de la solution de solvant

1. Préparer un mélange de solvant pyridine/chloroforme deutéré dans un flacon d’échantillon de 20 mL en mélangeant de la pyridine anhydre et du chloroforme deutéré dans un rapport de 1,6/1 (v/v).
   ATTENTION : Faites attention lorsque vous manipulez la pyridine et le chloroforme deutéré. Ces composés sont inflammables, nocifs et toxiques. Préparez et utilisez la solution dans une hotte bien ventilée à l’aide de gants appropriés.
2. Ajouter 5 à 8 g de tamis moléculaires 5A activés bien lavés et séchés dans des granulés de 3,2 mm pour éliminer les traces d’eau. De plus, l’utilisation d’un capuchon de septum est fortement recommandée pour éviter le contact avec l’air et la contamination par l’humidité du système de solvant. Conservez la solution préparée dans l’obscurité.

3. Préparation interne de la solution étalon (SI)

1. Dans une fiole d’Erlenmeyer de 2 mL, préparer une solution de 0,1 M d’acétylacétonate de chrome (III) (environ 10 mg) et d’étalon interne (environ 35,8 mg de NHND ou 77,3 mg de cholestérol) dans la solution de solvant préalablement préparée.
   ATTENTION : L’acétylacétonate de chrome (III) est nocif; lors de sa manipulation, portez des gants appropriés.
2. Enregistrez le poids exact du SI ajouté dans la solution SI.
3. Transférer la solution IS dans un flacon équipé d’un bouchon scellé contenant des tamis moléculaires activés (voir point 2.2) et la conserver dans l’obscurité à 40 °C.

4. Préparation de la solution d’échantillon RMN

1. Peser avec précision ~ 30 mg d’échantillon dans un flacon de 2 mL équipé d’une barre d’agitation. Scellez le flacon avec un capuchon de septum.
2. Ajouter 0,5 mL de la solution du système de solvant au flacon d’échantillon.
3. Transférer 100 μL de la solution IS dans le flacon d’échantillon via une micropipette. Remuer magnétiquement la dispersion résultante (500 tr/min) jusqu’à ce que toute la lignine ou le tanin soit dissous, ce qui donne une solution claire.
   REMARQUE: Étant donné que la solubilisation complète de l’échantillon est impérative, cette étape peut prendre jusqu’à 12 h.
4. Transférer 0,1 mL de TMDP dans la solution échantillon. Placer l’échantillon sous une agitation magnétique vigoureuse. Gardez l’échantillon de solution scellé. Utilisez le TMDP dans une hotte bien ventilée tout en portant des gants appropriés.
   ATTENTION : Le TMDP et ses vapeurs sont corrosifs, nocifs et interagissent rapidement avec l’eau.
   REMARQUE: La formation d’un précipité jaune est due à des traces d’eau dans l’échantillon ou dans la solution de pyridine / chloroforme. Dans un tel cas, la procédure doit être répétée en veillant à éviter toute contamination par l’humidité possible.
5. Transférer la solution d’échantillon dans un tube RMN à l’aide d’une pipette Pasteur.

5. Analyse RMN

1. Chargez le tube dans l’instrument RMN. Le spectromètre utilisé pour effectuer cette analyse a besoin d’une sonde à large bande.
2. Fixer les paramètres expérimentaux selon le réglage indiqué dans le tableau 1¹.

Tableau 1 : Paramètres expérimentaux pour enregistrer ³¹spectres RMN de lignines ou de tanins dérivés.

3. Réglez la fréquence du spectromètre en utilisant la fréquence de résonance du chloroforme deutéré, calez l’échantillon et réglez le spectromètre. Ensuite, commencez l’acquisition.

6. Traitement et analyse du spectre

1. Traiter les données brutes ^{RMN 31}P par un logiciel standard approprié selon les étapes suivantes.
   1. Effectuer une transformation de Fourier.
   2. Ajuster la phase par correction manuelle de phase (Traitement | Correction de phase | Correction manuelle).
   3. Corriger la ligne de base manuellement, en définissant soigneusement les points zéro (Traitement | | de référence Correction de la ligne de base multipoint).
2. Étalonnage du signal.
   1. Réglez le signal pour l’eau phosphitélée à la valeur de décalage chimique de 132,2 ppm (Analyse | | de référence Référence).
      REMARQUE: La présence d’un signal aigu de ³¹P à 175 ppm est due à l’excès de TMDP. Sa présence assure la dérivatisation complète de l’échantillon. Si ce pic est absent, il faut revoir l’ensemble de la procédure en fournissant un échantillon complet et un séchage au solvant et en ajoutant plus de TMDP. Une fois que cela est garanti, le spectre est zoomé dans la gamme spectrale de 132 à environ 150 ppm(Figure 7).

Figure 7: Vérifier la présence d’un excès de TMDP : s’il est visible, la dérivatisation de l’échantillon est terminée. Les spectres peuvent ensuite être analysés. Pour ce faire, zoomez dans la plage spectrale comprise entre 155 et 132 ppm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

3. Intégration
   1. Normalisez l’intégration en réglant la norme interne sur 1.0 (cliquez sur le Peak | Modifier les | intégrales Normalisé: 1.00). Effectuer l’intégration du spectre en fonction des changements chimiques indiqués dans les tableaux suivants. Utilisez le tableau 2 pour les lignines et le tableau 3 pour les tanins.

Tableau 2 : ³¹changements chimiques de RMN P pour les groupes OH phosphités de la lignine.

Tableau 3 : Décalage chimique ^{RMN 31}P pour les groupes OH phosphités tanins.

REMARQUE: À l’aide d’un logiciel de traitement spectral standard, il est possible de définir des régions prédéfinies du décalage chimique à intégrer. Cette opportunité est avantageuse lorsque plusieurs spectres doivent être traités.

7. Quantification des groupes fonctionnels

1. Calculer la concentration de la solution IS.
   
2. Calculez la quantité équivalente du signal spécifique :
   
   

Le protocole décrit peut être appliqué à la fois pour l’analyse des lignines et des tanins. En chimie de la lignine, cette méthode est fondamentale car elle permet la détection et la quantification des différents types de groupes hydroxy. La figure 8A-D montre des exemples de spectres RMN 31P de lignines et de tanins acquis avec des spectromètres fonctionnant à différentes fréquences. Le spectre illustré à la figure 8A a été enregistré à l’aide d’un spectromètre RMN de 300 MHz, tandis que la figure 8D a été enregistrée à l’aide d’un instrument RMN de 700 MHz.

Figure 8: Spectre RMN quantitatif 31P de (A) lignine kraft résineux (spectre enregistré avec un spectromètre de 300 MHz sur 30,8 mg de lignine), (B) acide lignosulfonique résineux (spectre enregistré avec un spectromètre de 300 MHz sur 30,1 mg de lignine après conservation du lignosulfonate en acide lignosulfonique), (C) Tanin d’acacia (spectre enregistré avec un spectromètre de 300 MHz sur un échantillon de 30,3 mg) et (D) lignine kraft de résineux (spectre enregistré avec un spectromètre de 700 MHz sur 7,2 mg de lignine). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Ces spectres ont été soigneusement enregistrés et traités manuellement. Les signaux typiques des groupes hydroxyles aliphatiques (150-145 ppm), aromatiques (145-137 ppm) et carboxyliques (136-134 ppm) sont très bien résolus et, en tant que tels, facilement intégrés. Si la fenêtre spectrale est ouverte (de 95 à 190 ppm, figure 8),trois pics forts et nets (175, 144 et 132 ppm) sont apparents. Ceux-ci sont dus à l’excès de TMDP, l’étalon interne (cholestérol ou NHND), et le TMDP hydroxylé (causé par des traces d’eau), respectivement.

Contrairement au kraft et à la lignine organosolv, les lignosulfonates sont insolubles dans le mélange pyridine/chloroforme. Pour obtenir un spectre RMN fiable de 31P, la solubilité est obligatoire. Pour surmonter ce problème, les lignosulfonates peuvent être convertis en acides lignosulfoniques correspondants avant la dérivatisation. Le traitement des solutions de lignosulfonate avec des acides forts (c’est-à-dire de l’acide sulfurique) ou des résines échangeuses d’acides (par exemple, Dowex 1H, un échangeur de cations acides forts) entraîne la conversion de tous les groupes sulfonates sous leurs formes acides. Les produits résultants peuvent être retirés de la solution acide à l’aide de résines adsorbantes sélectives (XAD-7, un adsorbant polaire utilisé pour isoler des composés caractérisés par des poids moléculaires allant jusqu’à 60 000 u.m.a) analysés à l’aide de ce protocole. La figure 8B montre le spectre RMN quantitatif 31P d’un acide lignosulfonique dérivé du TMDP. Même dans ce cas, les différents signaux des groupes hydroxy sont évidents. La figure 8C montre un spectre RMN quantitatif typique de 31P d’un échantillon de tanin dérivé à l’aide de TMDP. Un signal caractéristique des différentes unités aliphatiques OH (anneau C), pyrogallol et catéchol de l’anneau B et des unités de l’anneau A sont bien visibles.

Claudia Crestini et Dimitris S Argyropoulos veillent à ce que tous les auteurs (C.C., N.P., et D.S.A.) n’aient pas de conflits d’intérêts.