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Article de méthode

La résonance magnétique nucléaire pure shift : un nouvel outil pour la métabolomique végétale

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DOI :

10.3791/62719

⸱

31 juillet 2021

 ,  , 
1Departamento de Ciencias - Química, CERMN, Pontificia Universidad Católica del Perú

Dans cet article

Résumé

Cet article présente l’utilisation de PSYCHE et SAPPHIRE-PSYCHE dans le profilage métabolique des plantes et comprend des procédures détaillées pour la préparation des échantillons et l’enregistrement optimal des spectres RMN Pure Shift. Des exemples à travers lesquels le gain de résolution obtenu par le découplage homonucléaire permet une compréhension plus complète du système sont discutés.

Résumé

La résonance magnétique nucléaire (RMN) est l’un des outils les plus puissants utilisés en métabolomique. Il s’agit d’une méthode très précise et reproductible qui fournit non seulement des données quantitatives, mais permet également l’identification structurelle des métabolites présents dans des mélanges complexes.

Le profilage métabolique par RMN 1H s’est avéré utile dans l’étude de divers types de scénarios végétaux, notamment l’évaluation des conditions de culture, les traitements de récolte et post-récolte, le phénotypage métabolique, les voies métaboliques, la régulation des gènes, l’identification de biomarqueurs, la chimiotaxomie, le contrôle de la qualité, l’appellation d’origine, entre autres. Cependant, le chevauchement des signaux du grand nombre de résonances avec des multiplicités de couplage J élargies complique l’analyse des spectres et leur interprétation, et représente une limitation pour le profilage RMN 1H classique.

Au cours de la dernière décennie, de nouvelles techniques de découplage homonucléaire RMN à large bande, par lesquelles les signaux multiplets s’effondrent en lignes de résonance uniques - communément appelées méthodes Pure Shift - ont été développées pour surmonter le problème de résolution des spectres inhérent aux spectres classiques RMN 1H.

Ici, un protocole étape par étape de la préparation de l’extrait de plante et de la procédure d’enregistrement des spectres optimaux de Pure Shift PSYCHE et SAPPHIRE-PSYCHE dans trois matrices végétales différentes - feuilles de vanille , tubercules de pomme de terre (S. tuberosum) et groseilles à maquereau du Cap (P. peruviana) - est présenté. L’effet du gain de résolution dans l’identification métabolique, l’analyse de corrélation et les analyses multivariées, par rapport aux spectres classiques, est discuté.

Introduction

L’ensemble complet des métabolites qui composent un organisme - substrats, intermédiaires et produits finaux des processus biologiques - a été inventé en 1998 avec le terme métabolome. Il est bien connu que le métabolome est étroitement lié au phénotype, et il présente un intérêt particulier chez les plantes car il reflète l’interaction directe entre le génotype et l’environnement 1,2. Par conséquent, la caractérisation du profil métabolomique est devenue d’une importance primordiale chez les plantes. Grâce à l’identification et à la quantification de biomarqueurs (métabolites clés) et de schémas métaboliques, la discrimination entre les espèces, les cultivars, les stades de développement, les maladies pathogènes ou les conditions environnementales (changements quotidiens et saisonniers, sols, stress hydrique, stress mécanique, traitements de récolte et post-récolte), entre autres, a été rendue possible 3,4,5.

La spectrométrie de masse (MS) et la spectroscopie par résonance magnétique nucléaire (RMN) sont les plateformes analytiques les plus utilisées à cet effet. Contrairement aux méthodologies MS, la RMN est une technique hautement reproductible, non biaisée, quantitative, précise et non destructive qui nécessite une préparation minimale de l’échantillon, ce qui la rend adaptée aux études métabolomiques. Cependant, par rapport aux méthodes MS, la faible sensibilité inhérente est une limitation. Au cours des dernières années et grâce à l’utilisation d’aimants à haut champ, de sondes cryogéniques, de dispositifs à micro-bobines et de méthodes de polarisation nucléaire dynamique (DNP), la sensibilité de la RMN a été considérablement améliorée. Dans le cas de cette dernière approche, par exemple, le gain de sensibilité était de l’ordre de deux à trois ordres de grandeur 6,7. À ce jour, près de 20 % des études métabolomiques publiées sont basées sur la RMN et leur nombre augmente de7.

Même si la RMN des protons est l’expérience la plus populaire et la plus sensible pour l’empreinte métabolomique RMN, elle présente certains inconvénients. Tout d’abord, tous les signaux RMN 1H détectés dans l’échantillon sont distribués dans une petite fenêtre correspondant à la fenêtre de décalage chimique des protons, ce qui entraîne des spectres encombrés. Deuxièmement, le couplage scalaire homonucléaire divise les signaux en plusieurs composantes (multiplicité du signal), répartissant le signal proton sur une gamme de fréquences plus large, compliquant encore la lecture des spectres en augmentant l’encombrement et le chevauchement des signaux. De plus, la métabolomique RMN est utilisée dans l’analyse de mélanges contenant généralement de 50 à 300 molécules à une concentration observable par RMN, générant des spectres complexes composés de 200 à 2000 pics.

La RMN de protons de découplage homonucléaire, également connue sous le nom de Pure Shift, est une méthode qui induit l’effondrement d’un signal multiplet en un seul pic. Il s’agit d’un excellent outil pour augmenter la résolution du signal dans les spectres encombrés 8,9,10 et représente donc un outil pratique pour la métabolomique des plantes11.

Au cours de la dernière décennie, de nouvelles séquences d’impulsions Pure Shift, augmentant à la fois la sensibilité et les performances de découplage, ont émergé. Leur champ d’application s’est également élargi, de l’élucidation de la structure moléculaire12,13 à la fluxomique14, à l’affectation de mélange 15,16,17, aux mesures de diffusion translationnelle 18, à la discrimination énantiomérique19, à la distribution d’unités dans les copolymères20, entre autres.

Historiquement, les expériences Broadband Pure Shift souffrent d’une faible sensibilité et de méthodes de traitement compliquées, ce qui limite leur portée dans l’évaluation des extraits biologiques8. En 2014, Foroozandeh et al. ont publié une nouvelle expérience Pure Shift, PSYCHE (Pure Shift Yielded by Chirp Excitation), basée sur une séquence d’impulsions anti-z-COSY qui a donné un excellent découplage homonucléaire et des valeurs de sensibilité améliorées21. Cependant, comme PSYCHE est une expérience d’interférogramme 2D où des morceaux de données dans le domaine temporel sont acquis, il souffre d’artefacts de bande latérale périodiques qui résultent de distorsions de modulation de couplage J sur les bords du morceau. Dans les mélanges complexes, ces artefacts produisent des signaux plus importants que ceux associés aux métabolites présents à de très faibles concentrations, ce qui entrave l’analyse11. Il existe deux méthodes pour éliminer ces artefacts : TSE-PHYCHE22 et une modification plus récente de l’expérience PSYCHE appelée SAPPHIRE-PSYCHE (Sideband Averaging by Periodic PHase Incrementation of Residual J Evolution)23.

En 2019, nous avons démontré pour la première fois11 que la méthode SAPPHIRE-PSYCHE Pure Shift, qui élimine les artefacts sans pénalité de sensibilité presque sans pénalité de sensibilité23, pouvait être utilisée pour l’analyse de mélanges biologiques complexes, tels que les extraits de fruits de Physalis peruviana, communément appelés groseilles à maquereau du Cap11. Nous avons montré que ces méthodes augmentent les performances des analyses de données métabolomiques telles que l’assignation métabolique, l’analyse de corrélation et l’analyse des coefficients multivariés11. Depuis lors, plusieurs études métabolomiques Pure Shift sur différentes matrices biologiques, telles que les coraux mous24, les plantes d’hypericum25, le miel26,27, le thé27, l’huile de menthe poivrée26 et les noix28 ont été abordées, démontrant son importance en tant que nouvel outil d’analyse métabolomique. Paradoxalement, la grande majorité de ces études ont utilisé la séquence d’impulsions PSYCHE standard et facile à mettre en œuvre, disponible dans n’importe quelle bibliothèque de spectromètres, au lieu de la séquence d’impulsions SAPPHIRE-PSYCHE, qui s’est avérée plus performante. Cependant, cela nécessite une meilleure compréhension de la séquence d’impulsions pour une bonne configuration.

Cet article a pour but d’aider les nouveaux utilisateurs à appliquer les méthodes Pure Shift dans l’étude des plantes, en particulier les feuilles de Vanilla sp (V. planifolia et V. pompona)29, les tubercules de pomme de terre (S. tuberosum)30 et les groseilles à maquereau du Cap (P. peruviana)31. La préparation des échantillons, la mise en place expérimentale de la RMN, l’acquisition et l’analyse des données sont décrites en détail. De plus, le protocole comprend des notes clés pour aider les chercheurs, nouveaux dans le domaine, à mettre correctement en place les expériences PSYCHE et SAPPHIRE-PSYCHE dans le profilage métabolomique des plantes.

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Protocole

1. Préparation de l’échantillon

  1. Groseilles du Cap
    1. Placez 100-200 g de fruits frais dans un vase mixeur. Conserver à 4 °C pendant 30 min, puis homogénéiser dans un mélangeur de laboratoire.
    2. Transférez immédiatement le jus dans des tubes en plastique de 50 ml, congelez-les dans de l’azote liquide et lyophilisez-les à sec pendant 4 à 5 jours.
    3. Broyez le matériau lyophilisé en une poudre fine à l’aide d’un broyeur électrique.
      REMARQUE : La manipulation du matériau sec doit être effectuée rapidement car la poudre est très hygroscopique.
    4. Pesez 1 g de matériau broyé et ajoutez 10 ml d’eau ultrapure. Vortex pendant 1 min.
    5. Sonicate pendant 20 min à 10 °C, puis centrifuger à 23 000 × g pendant 20 min à 10 °C.
    6. Récupérez le surnageant et filtrez-le à travers un filtre à seringue en polytétrafluoroéthylène (PTFE) de 13 mm de 0,45 μm.
    7. Lyophiliser 1 mL de l’extrait filtré jusqu’à ce qu’il soit sec, puis remettre en suspension le solide obtenu dans 0,9 mL de tampon d’oxalate de sodium de 200 mM pH 4. Tourbillon.
    8. Lyophiliser l’échantillon obtenu jusqu’à ce qu’il soit sec et le dissoudre dans 0,9 mL d’oxyde de deutérium contenant 5 mM de sel sodique acide 3-(triméthylsilyl)propionique-2,2,3,3-d4 (TMSP-d4).
    9. Remplissez le tube RMN avec 0,6 mL de l’échantillon à l’aide d’une micropipette.
  2. Feuilles de vanille
    1. Récupérez les feuilles, nettoyez-les avec du papier de soie humide et congelez-les entières dans de l’azote liquide.
    2. Casser les feuilles en petits morceaux et lyophiliser pendant 4 jours jusqu’à ce qu’elles soient sèches.
    3. Broyez la matière sèche en une poudre fine à l’aide d’un broyeur électrique.
    4. Peser 50 mg de matériau broyé et ajouter 0,75 mL de tampon phosphate pH 6,0 dans de l’oxyde de deutérium contenant 0,1 % de TMSP (p/p) et 0,75 mL de méthanol-d4. Vortex pendant 1 min.
    5. Sonicate pendant 20 min à 25 °C.
    6. Centrifugeuse à 13 000 × g pendant 10 min à 25 °C.
    7. Récupérez le surnageant (~1,3-1,4 mL) et filtrez-le à travers un filtre à seringue en PTFE de 13 mm et 0,45 μm.
    8. Remplissez le tube RMN avec 0,6 mL de l’échantillon filtré à l’aide d’une micropipette.
  3. Tubercules de pomme de terre
    1. Pelez et coupez en tranches 4 à 8 tubercules. Placez immédiatement environ 125 g de matériau dans des sacs à fond plat et congelez-les dans de l’azote liquide.
      REMARQUE : Pour éviter l’oxydation lors de la manipulation, gardez la pomme de terre humide.
    2. Lyophiliser pendant 4 à 6 jours jusqu’à séchage complet.
    3. Broyez la matière sèche en une poudre fine à l’aide d’un broyeur électrique.
    4. Peser 160 mg de tubercule moulu et ajouter 1,6 mL d’eau déminéralisée. Vortex pendant 1 min.
    5. Sonicate pendant 45 min à 10 °C.
    6. Centrifugeuse à 23 000 x g pendant 20 min à 10 °C.
    7. Récupérer le surnageant (~1,5 -1,6 mL) et l’évaporer jusqu’à ce qu’il soit sec dans un concentrateur centrifuge sous vide réfrigéré pendant 16 h, à 10 °C.
    8. Ajouter au solide obtenu (20-25 mg) 0,9 mL de tampon d’oxalate de sodium 100 mM pH 4, vortex, et évaporer pendant 16 heures à 10 °C.
    9. Dissoudre le solide obtenu dans 0,9 mL d’oxyde de deutérium contenant 3 mM de TMSP.
    10. Centrifuger à 23 000 x g pendant 5 min à 10 °C et filtrer le surnageant directement dans le tube RMN à travers un filtre à seringue en PTFE de 13 mm 0,45 μm.
      REMARQUE : Dans ce cas, une filtration directe dans le tube RMN a été effectuée pour réduire les étapes de préparation de plus de 1000 échantillons.

2. Acquisition et traitement des données RMN

  1. Configuration initiale de la RMN
    1. Transférez les échantillons dans le spectromètre RMN.
    2. Réglez et faites correspondre la tête de sonde.
    3. Verrouillez et calez l’échantillon.
    4. Calibrez l’impulsion dure à 90°. Étalonnez l’impulsion de 90° à l’aide de l’une des procédures standard.
    5. Exécutez un spectre RMN de protons 1D standard.
  2. Expérience PSYCHÉ
    1. Sélectionnez la séquence d’impulsions reset_psyche_1d dans la bibliothèque Bruker Topspin (Figure S1). Utilisez les paramètres standard suivants : largeur spectrale de 5 kHz (SW2), au moins 1 ou 2 secondes de délai de récupération de relaxation (D1), 16 balayages fictifs (DS), 64 ou 128 points de données complexes par bloc (L31) et 64 ou 128 balayages (NS) (Figure S1).
      REMARQUE : L31 est le nombre de points numériques complexes acquis dans chaque bloc Pure Shift, il est préférable de le régler à une puissance de 2. 21
    2. Réglez l’excitation souhaitée de l’angle de retournement de l’impulsion CHIRP (CNST61) et 10 kHz pour la bande passante d’impulsion CHIRP (CNST60) (Figure S2).
      NOTE : L’expérience PSYCHE est basée sur un schéma anti-z-COSY ; par conséquent, l’angle de retournement de l’impulsion CHIRP doit être petit pour éviter les artefacts de recouplage (Figure 1). L’intensité absolue augmente avec l’angle de retournement de l’excitation. Les artefacts périodiques sont également améliorés, se propageant dans le spectre et augmentant le « bruit » (Figure 1). Le « bruit » devient une combinaison de bruit standard et d’artefacts de cliquetis. Un bon compromis entre la sensibilité et les faibles artefacts de recouplage consiste à définir CNST61 = 20°. 19,22
    3. Réglez la longueur d’impulsion dure (P1) sur la valeur précédemment calibrée et la longueur d’impulsion de forme PSYCHE sur 30 ms (P49) (Figure S2).
      REMARQUE : Il est très important de calibrer la valeur d’impulsion dure car les puissances d’impulsion de forme seront automatiquement calculées à partir de cette valeur.
    4. Choisissez l’impulsion de forme Crp_psyche.20 (SPNAM 37) pour l’élément PSYCHE (Figure S2).
    5. Réglez l’intensité du gradient de champ d’impulsion appliqué pendant l’élément PSYCHE (GPZ0). Choisissez RECT.1 pour l’impulsion de forme de gradient (GPNAM 0) (Figure S2).
      REMARQUE : Un faible gradient de champ magnétique est appliqué pendant l’élément PSYCHE, normalement, entre 1% et 4% de l’intensité maximale du gradient, selon la sonde.
    6. Définissez le nombre de blocs à acquérir afin de reconstruire le FID Pure Shift (TD1) (Figure S3).
      REMARQUE : PSYCHE est acquis comme une expérience pseudo-2D où TD1 est le nombre de blocs d’interférogramme Pure Shift. La résolution spectrale dépend de la taille de la fenêtre spectrale (SW1) et du nombre total de points acquis, qui est TD1*2*L31. En règle générale, 16 ou 32 blocs avec 64 ou 128 points complexes par bloc fourniront une résolution numérique suffisante. Comme PSYCHE est enregistré sous forme d’interférogramme, un nombre plus élevé de blocs augmente la résolution numérique, mais aussi le temps d’acquisition total19. Les accouplements J homonucléaires évoluent au cours de chaque bloc, ce qui donne un modèle de modulation J oscillant21,23. Après la transformée de Fourier, cela génère des artefacts de bande latérale périodiques qui dépendent de la longueur du bloc (Figure 2). Pour réduire les artefacts, la durée du bloc doit être courte, généralement inférieure à 16 ms (durée du bloc = 2*in0 : Figure S1). Si la durée du bloc est élevée, réduisez L31.
    7. Traitez les données avec le programme AU Proc_reset de Bruker et la transformée de Fourier.
      REMARQUE : Nous recommandons de transformer le spectre en utilisant le remplissage du zéro et une apodisation en cloche sinusoïdale (Figure S4).
  3. Expérience SAPPHIRE-PSYCHE
    1. Sélectionnez la séquence d’impulsions SAPPHIRE-PSYCHE et réglez les paramètres de la séquence d’impulsions. Les paramètres standard seraient les suivants : largeur spectrale de 5 kHz (SW3), au moins 1 ou 2 secondes de retard de relaxation (D1), 16 balayages fictifs (DS), 8 ou 16 balayages par incrément (NS) et D2 à 14 ms (Figure S5).
      REMARQUE : Cette séquence n’est pas dans le répertoire de Bruker, cependant, la séquence et les programmes de traitement peuvent être obtenus sur le site Web du Manchester NMR Methodology Group, (https://www.nmr.chemistry.manchester.ac.uk/?q=node/426)23. Le retard D2 garantit que la relaxation T2 reste constante à chaque incrément de modulation J. D2 doit être supérieur à 1/4*SW1+p16+2*d16. 23
    2. Réglez l’excitation souhaitée de l’angle de retournement de l’impulsion CHIRP (CNST20) et 10 kHz pour la largeur de bande d’impulsion CHIRP (CNST21) (Figure S6).
      REMARQUE : Comme dans l’expérience PSYCHE régulière, l’angle de retournement de l’impulsion CHIRP doit être court pour éviter les artefacts de recouplage. CNST20 = 20° est un bon compromis entre la sensibilité et les faibles artefacts de recouplage 21,23,25.
    3. Réglez la longueur d’impulsion dure (P1) sur la valeur précédemment calibrée et la longueur d’impulsion de forme PSYCHE sur 30 ms (P40) (Figure S6).
      REMARQUE : Il est important de calibrer la valeur de l’impulsion dure car les puissances d’impulsion de forme seront automatiquement calculées à partir de celle-ci.
    4. Choisissez l’impulsion de forme PSYCHE_Saltire_10kHz_30m pour l’élément PSYCHE (Figure S6).
    5. Réglez l’intensité du gradient de champ d’impulsion appliqué pendant l’élément PSYCHE (GPZ10). Choisissez RECT.1 pour l’impulsion de forme de gradient (GPNAM 10) (Figure S7).
      REMARQUE : Un faible gradient de champ magnétique est appliqué pendant l’élément PSYCHE, normalement, entre 1% et 4% de l’intensité maximale du gradient, valeur qui dépend de la sonde.
    6. Réglez le nombre d’incréments de modulation SAPPHIRE J dans F2 (TD2) (Figure S7).
      REMARQUE : normalement, 8 incréments assurent une excellente suppression des artefacts de bande latérale (Figure 2 et 3). Le nombre total de numérisations du FID final Pure Shift est NS*TD2. 23
    7. Réglez les fenêtres spectrales F1 et F2 (SW1 et SW2) (Figure S5).
      REMARQUE : SW2=SW3/(2*TD2) et SW3/SW1 = TD2*N, où TD2 et N sont des entiers pairs23. L’expérience SAPPHIRE-PSYCHE est acquise sous la forme d’une pseudo 3D où F2 code l’artefact de couplage J modulation de phase et F1 l’acquisition de l’interférogramme Pure Shift20. Étant donné que SAPPHIRE-PSYCHE supprime les bandes latérales de modulation J , la durée du bloc Pure Shift de l’interférogramme peut être plus longue que celle de PSYCHE normale (durée du bloc Pure Shift = 1/SW1), généralement entre 20 et 40 ms (Figure 2). Cependant, une acquisition de données de blocs plus longue conduit à des évolutions de couplage J plus élevées, ce qui nécessiterait plus d’incréments de modulation de phase de couplage J pour supprimer les bandes latérales plus fortes atteintes de23.
    8. Définissez le nombre de blocs Pure Shift (TD1) (Figure S7).
      REMARQUE : Étant donné que SAPPHIRE-PSYCHE doit compenser la modulation de phase de couplage J du premier bloc, un bloc supplémentaire doit être acquis. En règle générale, 17 (16+1) ou 33 (32+1) blocs donnent une résolution numérique suffisantede 23.
    9. Traiter les données en exécutant les programmes pm_pshift et pm_fidadd AU suivis de la transformée de Fourier23.
      REMARQUE : Nous recommandons de transformer le spectre en utilisant le remplissage du zéro et une apodisation en cloche sinusoïdale (Figure S4).

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Résultats

Analyse du spectre RMN
Les expériences PSYCHE augmentent la résolution des spectres en regroupant les résonances couplées en singlets21, ce qui réduit les chevauchements et facilite l’attribution et l’analyse des données. La RMN Pure Shift peut être appliquée sur des extraits de plantes. Nous démontrons ici son utilisation dans trois matrices différentes : les feuilles de vanille, les tubercules de pomme de terre et les fruits de Physalis peruviana . L’amélioration de ...

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Discussion

L’identification structurale et la quantification des métabolites sont des enjeux clés dans la caractérisation du métabolome, données qui, lorsqu’elles sont soumises à des analyses multivariées, permettent de mieux comprendre le système biologique étudié. La préparation des échantillons et l’acquisition des données sont des aspects critiques qui doivent être optimisés afin de fournir des résultats fiables.

Dans cet article, nous décrivons et illustrons la prép...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts à déclarer.

Remerciements

Cette étude a été financée par le Consejo Nacional de Ciencia, Tecnología e Innovación Tecnológica (CONCYTEC) - Programa Atracción de Investigadores Cienciactiva - Contract # 008-2017-FONDECYT.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Série 77500 Freezone 4,5 Litres de paillasseLabconco77500
Bruker Avance III 500 MHz équipé d’une sonde cryogénique TCI à gradient Z de 5 mmBruker Corporation
Concentrateurs centrifuges réfrigérés Centrivap Labconco 7310000 SérieLabconco7310000
Oxyde de deutériumSigma-Aldrich151882
Broyeur MKM6003BoschMKM6003
Licuadora Blender 8011S modèle Hgb2wts3WaringHgb2wts3
Methanol-d4Sigma-Aldrich151947

Références

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