Method Article

Génération, maintenance et caractérisation d’organoïdes intestinaux et coliques dérivés de cellules souches pluripotentes humaines

DOI:

10.3791/62721

⸱

July 9th, 2021

 ,  ,  , 
1Department of Regenerative Medicine and Cell Biology, Medical University of South Carolina

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ici, des méthodes détaillées pour générer, maintenir et caractériser des organoïdes de l’intestin grêle et du côlon dérivés de cellules souches pluripotentes humaines sont décrites. Ces méthodes sont conçues pour améliorer la reproductibilité, étendre l’évolutivité et réduire le temps de travail nécessaire au placage et au passage des organoïdes.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La spécification régionale intestinale décrit un processus par lequel une morphologie et une fonction uniques sont transmises à des zones définies du tractus gastro-intestinal (GI) en développement. La spécification régionale dans l’intestin est déterminée par de multiples voies de développement, y compris la voie des protéines morphogénétiques osseuses (BMP). Sur la base de spécifications régionales normales, une méthode permettant de générer des organoïdes du côlon humain (HCO) à partir de cellules souches pluripotentes humaines (hPSC), qui comprennent des cellules souches embryonnaires humaines (hES) et des cellules souches pluripotentes induites (iPSC), a été développée. Une induction de trois jours de la signalisation BMP permet de structurer suffisamment les cultures de tubes moyens/postérieurs en HCO spéciaux exprimant la protéine de liaison à la séquence 2 riche en AT (SATB2) contenant tous les principaux types de cellules épithéliales présentes dans le côlon humain ainsi que des cellules mésenchymateuses en co-développement. L’omission de BMP (ou l’ajout de l’inhibiteur de BMP NOGGIN) au cours de cette période critique a entraîné la formation d’organoïdes intestinaux humains (HIO). Les HIO et les HCO ressemblent morphologiquement et moléculairement au développement de l’intestin grêle et du côlon humains, respectivement. Malgré l’utilité des DOI et des OCS pour l’étude du développement intestinal humain, il est difficile de les générer et de les ORS. Le présent document présente des méthodes de production, de maintien et de caractérisation des DOI et des OSC. En outre, les étapes critiques du protocole et les recommandations de dépannage sont fournies.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

L’étude du développement du côlon humain est difficile en raison des restrictions sur l’utilisation du tissu fœtal humain. Les modèles animaux ont été inestimables et historiquement utilisés pour les approches génétiques chez la souris afin d’étudier le développement intestinal. Cependant, les différences entre le développement intestinal de la souris et de l’homme limitent l’applicabilité des souris en tant que système modèle. Par exemple, bien que la formation de cryptes dans l’intestin grêle et le côlon des souris se produise après la naissance, les humains naissent avec des cryptes entièrement formées1. De plus, l’intestin grêle et le côlon humains contiennent des types de cellules que l’on ne trouve pas chez la souris, y compris les cellules entéroendocrines exprimant la motiline (MLN) dans l’intestin grêle2 et les cellules caliciformes exprimant la mucine 5B (MUC5B) dans le côlon 3,4. Pour cette raison, il est important d’avoir un système de culture cellulaire qui modélise avec précision les événements moléculaires dynamiques qui définissent les premiers stades du développement du côlon. Par conséquent, le fait de diriger les hPSC pour générer des cellules ayant des caractéristiques du côlon fournit un modèle puissant pour l’étude du développement du côlon humain.

Des protocoles ont été développés pour faciliter la formation reproductible5, synchrone et efficace d’organoïdes6 semblables à l’intestin et d’organoïdes7 semblables au côlon à partir de CSPh. Ces protocoles utilisent une procédure de différenciation par étapes qui imite le développement de l’intestin et du côlon fœtaux (Figure 1). Tout d’abord, l’endoderme définitif est généré à partir de cellules souches pluripotentes humaines par traitement avec de l’Activine A, un mimétique nodal. L’exposition de l’endoderme définitif à des niveaux élevés de WNT et de facteur de croissance des fibroblastes (FGF) induit la morphogenèse en sphéroïdes du tube CDX2+ de l’intestin moyen/postérieur. Les sphéroïdes de l’intestin moyen et de l’intestin postérieur sont ensuite intégrés dans une matrice extracellulaire (MEC) et structurés en HIO ou en HCO par une manipulation transitoire de la signalisation BMP. L’inhibition de la signalisation BMP à l’aide de NOGGIN ou de l’ajout d’un milieu de croissance seul entraîne la formation de HIO, qui ressemblent à l’intestin grêle proximal humain.

En activant la signalisation BMP à l’aide de BMP2, les sphéroïdes de l’intestin moyen/postérieur sont structurés en HCO, qui conservent la structuration dans l’épithélium et le mésenchyme7. Les HCO contiennent des cellules caliciformes enrichies du côlon, exprimant MUC5B, et sont capables de générer des cellules entéroendocrines spécifiques de l’insuline 5 (INSL5) spécifiques du côlon. Le mésenchyme isolé des HCO exprime l’homéobox A13 (HOXA13) et HOXD13, qui sont également exprimés dans le mésenchyme primaire du côlonhumain 8. Il est important de se rappeler que l’étape de structuration se produit pendant les jours 7 à 10 du protocole de différenciation. Cette période de trois jours est suffisante pour induire la formation du côlon qui se maintient après une culture in vitro prolongée.

Les protocoles décrits ci-dessous s’adressent aux chercheurs qui connaissent bien la culture de CSPh sans nourrisseur. Pour les chercheurs qui ne sont pas familiers avec ce type de culture de hPSC, une formation sur les hPSC telle que celles proposées par Stem Cell Technologies ou le Pluripotent Stem Cell Facility (PSCF) de l’hôpital pour enfants de Cincinnati est recommandée. La qualité des hPSC de départ est critique et peut affecter toutes les étapes en aval. Le protocole qui suit commencerait avec des hPSC qui ont été cultivées pendant 4 jours et qui sont prêtes à se diviser.

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Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Génération d’organoïdes intestinaux et côliques humains

  1. Préparation de plaques revêtues d’ECM
    1. Ajouter 50 ml de milieu DMEM froid dans un tube conique de 50 ml.
    2. Retirez une aliquote de 4x hESC qualifiée ECM (voir le tableau des matériaux) du congélateur à -80 °C et décongelez-la sur de la glace.
      REMARQUE : Reportez-vous au certificat d’analyse du produit pour déterminer le volume d’ECM qualifié ESC nécessaire pour préparer une crosse 4x.
    3. Si l’ECM qualifié hESC n’est pas complètement décongelé, prélever 750 μL de DMEM dans le tube conique de 50 mL et le mélanger avec l’ECM.
    4. Transférez le mélange ECM qualifié DMEM/hESC dans le tube conique de 50 mL avec DMEM et mélangez bien. Ajouter 0,5 mL par puits dans chacune des 4 plaques de culture cellulaire de 24 puits.
    5. Secouez les plaques pour répartir uniformément l’ECM dans tout le puits afin de vous assurer que toute la surface est couverte. À l’aide d’un parafilm, scellez les plaques recouvertes d’ECM et laissez-les à température ambiante dans une enceinte de biosécurité pendant au moins 1 h. Stockez les plaques revêtues d’ECM à 4 °C jusqu’à 2 semaines ou jusqu’à ce que vous en ayez besoin.
  2. Placage unicellulaire des hPSC
    1. Placez une plaque à 24 puits recouverte d’ECM à l’intérieur d’une enceinte de biosécurité pendant 30 minutes pour lui permettre d’atteindre la température ambiante.
    2. Placez le milieu complet mTeSR1, la solution de détachement cellulaire et le DMEM avancé dans un bain-marie à 37 °C et laissez-les se réchauffer pendant 30 min.
    3. Vérifiez que les hPSC sont confluents à au moins 85 % avec une différenciation minimale. Retirez toutes les cellules différenciées si nécessaire.
    4. Préparez le milieu de placage dans un tube conique de 50 mL comme suit : 13 mL de mTeSR1 et 13 μL de 10 mM Y-27632 inhibiteur de la protéine kinase associée à la Rho (ROCK).
      REMARQUE : L’Y-27632 inhibe l’anoikis et augmente la survie des cellules individuelles.
    5. Pour prélever des cellules à partir d’une plaque à 6 puits, aspirez le milieu de 3 à 4 puits et lavez-le une fois avec 2 ml de DMEM avancé par puits.
    6. Aspirez le DMEM avancé et distribuez 1 mL de la solution de dissociation cellulaire dans chaque puits. Incuber la plaque pendant 5 à 7 min à l’intérieur d’un incubateur à 5 % de CO2, 37 °C. Vérifiez au microscope que les cellules sont en suspension.
    7. Dissociez les amas de cellules restants en pipetant de haut en bas 4 à 5 fois à l’aide d’une pipette de 5 ml.
    8. Ajoutez 2 ml de DMEM avancé dans chaque puits, pipetez doucement de haut en bas 4 à 5 fois et transférez dans un tube conique de 15 ml. Faites tourner les cellules à 300 × g pendant 3 min à température ambiante.
    9. Aspirez le milieu du tube sans aspirer la pastille cellulaire et ajoutez 6 ml du milieu préparé de mTeSR1 plus l’inhibiteur de ROCK. Remettez doucement les cellules en suspension en pipetant de haut en bas 3 à 4 fois, puis transférez la suspension dans le reste du milieu inhibiteur de mTeSR1/ROCK à l’intérieur du tube de 50 ml. Remettez vigoureusement en suspension 4 à 5 fois et comptez les cellules à l’aide d’un hémacytomètre.
    10. Aspirez l’ECM de la plaque à 24 puits juste avant de plaquer les cellules. Remettez les cellules en suspension en pipetant de haut en bas 2 à 3 fois et distribuez 0,5 ml de la suspension cellulaire dans chaque puits.
      REMARQUE : La densité de placage optimale doit être déterminée par l’expérimentateur. Ici, le nombre optimal de cellules est de 80 000 à 200 000 cellules par puits.
    11. Basculez doucement la plaque 3 fois dans le sens des aiguilles d’une montre, 3 fois dans le sens inverse des aiguilles d’une montre, 3 fois vers l’avant et vers l’arrière et 3 fois d’un côté à l’autre pour disperser uniformément les cellules.
    12. Transférez la plaque dans un incubateur à 37 °C, 5 % de CO2 et incubez pendant 24 h.
      REMARQUE : Ne dérangez pas la plaque pendant les premières heures pour assurer une bonne dispersion des cellules dans les puits.
    13. Après 24 h (figure 2A), aspirer le milieu usé, ajouter 0,5 mL par puits de mTeSR1, incuber à nouveau à 37 °C, 5 % de CO2 pendant 24 h (figure 2B), puis passer à l’étape suivante.
  3. Différenciation de l’endoderme définitif (DE) des hPSC
    1. Dans un tube conique de 15 ml, ajouter 13 ml de milieu Activin Day 1 (voir le tableau des matières), 13 μL d’Activin A à 100 μg/mL et 1,95 μL de BMP4 à 100 μg/mL. Réchauffez le milieu dans un bain-marie à 37 °C.
    2. Aspirez le milieu mTeSR1 de la plaque à 24 puits et ajoutez 0,5 mL de milieu Activin Day 1 par puits. Placez la plaque dans un incubateur à 37 °C, 5 % CO2 et incubez pendant 24 h. Vérifiez les cellules après 24 h.
      REMARQUE : Une mort cellulaire étendue devrait être apparente, comme illustré à la figure 2C. Bien que la monocouche apparaisse clairsemée, les colonies de cellules se sont développées.
    3. Préparez le milieu complet Activin Jour 2 en ajoutant 12,5 μL de 100 μg/mL d’Activin A dans 12,5 ml de milieu Activin Jour 2 dans un tube conique de 15 ml. Placez le tube dans un bain-marie à 37 °C.
    4. Sortez la plaque de différenciation à 24 puits de l’incubateur de CO2 et retirez le milieu usé. Versez 0,5 mL de milieu Activin Day 2 préchauffé par puits et remettez la plaque à l’intérieur de l’incubateur de CO2 pendant 24 h.
      REMARQUE : Des précautions doivent être prises lors de la distribution du fluide. Ne distribuez pas le fluide directement au centre du puits, car cela détacherait les cellules de la monocouche. Répartissez soigneusement le fluide sur le côté du puits. Le lendemain, une monocouche de cellules se forme avec une mort cellulaire négligeable. Les cellules devraient maintenant être confluentes de ~90 à 95 % (Figure 2D).
    5. Préparez le milieu complet Activin Jour 3 en ajoutant 12,5 μL de 100 μg/mL d’Activin A dans 12,5 mL de milieu Activin Jour 3 dans un tube conique de 15 mL. Placez le tube dans un bain-marie à 37 °C.
    6. Retirer le milieu épuisé et distribuer 0,5 mL de milieu Activin Day 3 par puits.
      REMARQUE : Des précautions doivent être prises lors de la distribution du fluide. Ne distribuez pas le fluide directement au centre du puits car cela détacherait les cellules de la monocouche. Répartissez soigneusement le fluide sur le côté du puits. Le lendemain, la monocouche devrait atteindre sa pleine confluence avec peu ou pas de mort cellulaire à ce stade. N’essayez pas de générer des sphéroïdes de l’intestin moyen si la monocouche n’est pas confluente 24 h après l’ajout du milieu Activin Day 3. Reportez-vous à la figure 2E pour la morphologie idéale de la monocouche DE avant de procéder à la génération de sphéroïdes de l’intestin moyen.
    7. Effectuer une coloration par immunofluorescence (IF) de la monocouche pour l’expression de la protéine de la boîte de fourche A2 (FOXA2) et du facteur de transcription de la boîte 17 de la région Y déterminant le sexe (SRY) (SOX17) lors de l’optimisation de la différenciation DE.
  4. Différenciation de l’ED, en sphéroïdes de l’intestin moyen postérieur
    1. Dans un tube conique de 50 ml, ajoutez 25 ml de milieu d’induction de l’intestin moyen postérieur avec FGF4 (sans CHIR99021) et placez-le dans un bain-marie à 37 °C pendant 30 min.
    2. Pour préparer le milieu d’induction complet de l’intestin moyen, ajoutez 7,5 μL de CHIR99021 une fois que le milieu est chaud.
    3. Retirer le milieu usé, distribuer 0,5 mL de milieu d’induction de l’intestin postérieur moyen par puits et incuber à 37 °C, 5 % de CO2 pendant 24 h.
    4. Une fois que la condensation des cellules à l’intérieur de la monocouche s’est produite le lendemain (figure 3A), remplacez le milieu épuisé par un milieu d’induction frais de l’intestin postérieur moyen et replacez la plaque dans un incubateur à 37 °C à 5 % de CO2 pendant 24 h.
      REMARQUE : Les structures tubulaires seront perceptibles après 48 h d’induction de l’intestin postérieur, comme le montre la figure 3B. Les sphéroïdes de l’intestin postérieur commenceront à bourgeonner de la monocouche le jour 3, comme le montre la figure 3C.
    5. Pour éviter de jeter les sphéroïdes flottants lors du changement de milieu, transférez l’ancien milieu dans un tube de 15 ml et centrifugez-le à 300 × g pendant 1 min. Remettre les sphéroïdes en suspension dans 12,5 mL de milieu d’induction frais pour l’intestin moyen, ajouter 0,5 mL par puits dans la même plaque à 24 puits et incuber à 37 °C, 5 % de CO2 pendant 24 h.
    6. Au 4e jour de l’induction de l’intestin postérieur (figure 3D), récolter les sphéroïdes flottants dans les puits de la plaque en recueillant le milieu dans un tube de 15 mL, suivi d’une centrifugation à 300 × g pendant 1 min. Passez à l’étape suivante pour l’intégration des sphéroïdes de l’intestin moyen postérieur dans la MEC.
  5. Placage et structuration des sphéroïdes de l’intestin moyen et postérieur dans la MEC
    1. Décongeler la matrice de la membrane basale ECM à 4 °C pendant la nuit avant l’enrobage.
      REMARQUE : Cet ECM est différent de l’ECM qualifié hESC. L’ECM doit être placé sur de la glace, et le volume approprié d’ECM peut être aliquote dans des tubes de microcentrifugation pré-refroidis de 1,5 mL sur de la glace. Le tableau 1 contient des informations sur le volume ECM. Assurez-vous que le volume de la MEC est d’au moins 75 % dans la gouttelette dans laquelle les sphéroïdes seront intégrés.
    2. Réchauffez une plaque de 24 puits dans un incubateur à 37 °C.
    3. Prélever les sphéroïdes flottants de tous les 24 puits à l’aide d’une pipette de 1000 μL et les transférer dans un tube conique de 15 mL. Faites tourner les sphéroïdes à 300 × g pendant 1 min à température ambiante. Aspirez la majeure partie du milieu mais laissez le volume nécessaire au placage (tableau 1).
    4. Préparez les pointes de pipette de 1000 μL et 200 μL en coupant leurs extrémités. Sortez l’assiette préchauffée à 24 puits.
    5. Mélangez les sphéroïdes flottants, transférez le volume approprié dans le tube ECM placé sur de la glace, puis remettez en suspension les sphéroïdes et l’ECM en pipetant pour bien les mélanger.
    6. Prélever 65 μL du mélange de sphéroïdes et d’ECM avec les pointes de pipette coupées de 200 μL et charger au centre de chaque puits dans la plaque à 24 puits. Pour vous assurer qu’une bonne gouttelette ECM se forme, soulevez la pipette doucement et lentement pendant que le mélange est distribué.
      REMARQUE : Plaquez 30-100 sphéroïdes par puits.
    7. Transférez délicatement la plaque dans un incubateur à 37 °C, 5 % de CO2 et incubez pendant 5 min.
    8. Retournez la plaque et incubez pendant 15 à 25 minutes, ce qui aidera les gouttelettes ECM à maintenir une structure en forme de dôme.
    9. Pendant l’incubation, préparez le milieu requis et réchauffez-le. Une fois que l’ECM est solidifié, ajouter 0,5 mL de milieu de structuration HIO ou HCO dans chaque puits et incuber à 37 °C, 5 % de CO2. Voir la figure 3E pour une image des sphéroïdes en ECM.
    10. Cultivez les sphéroïdes dans le milieu de culture pendant 3 jours.
    11. Après 3 jours, remplacer le milieu de croissance HIO ou HCO par un milieu de croissance normal et incuber à 37 °C, 5 % de CO2.
      REMARQUE : Les organoïdes à ce stade (jour 10) sont des organoïdes à un stade précoce. En fonction de l’objectif du projet, certains organoïdes à un stade précoce peuvent être utilisés pour l’analyse précoce des motifs, comme détaillé à la section 2.
  6. Excroissance et passage d’organoïdes intestinaux et côliques humains
    1. Après le 10e jour, changez le milieu de culture tous les 3 jours.
      REMARQUE : Selon la densité de placage et la croissance des organoïdes, des changements de milieu plus fréquents peuvent être nécessaires. Les changements de milieu doivent être effectués avant que le rouge de phénol (indicateur de pH) dans le milieu ne devienne jaune.
    2. Incuber les organoïdes jusqu’au jour 21 (Figure 3F).
      REMARQUE : Le traitement BMP2 entraînera une réduction du nombre d’organoïdes (~3 fois moins que les HIO) qui poussent à partir des sphéroïdes. Par conséquent, un plus grand nombre de sphéroïdes doit être plaqué pour la génération de HCOs.
  7. Séparation des organoïdes au jour 21
    1. Inspectez les organoïdes.
      REMARQUE : Les organoïdes doivent être divisés le jour 21 car l’ECM est presque dégradé au jour 21 en raison de la croissance et de l’expansion des organoïdes.
    2. Préparez les pointes de pipette de 1000 μL et 200 μL en coupant leurs extrémités.
    3. Réchauffez une plaque Nunc de 24 puits dans un incubateur à 37 °C.
    4. Aliquote le volume approprié de MEC dans les tubes prérefroidis de 1,5 mL (tableau 1).
    5. Grattez doucement la gouttelette ECM avec les organoïdes avec une pointe de pipette de 1000 μL et pipetez le mélange de haut en bas plusieurs fois pour briser l’ECM.
    6. Transférez le mélange dans une boîte de Pétri de 60 mm et vérifiez les organoïdes au microscope. Si nécessaire, séparez les organoïdes les uns des autres à l’aide d’une pince stérile. Assurez-vous que la séparation n’endommage pas l’épithélium des organoïdes.
    7. Transvaser les organoïdes dans un tube conique de 15 mL et centrifuger à 300 × g pendant 30 s. Aspirer le surnageant et laisser ~1 mL de milieu dans le tube.
      REMARQUE : Le volume du milieu peut être modifié en fonction de l’objectif de l’expérience. Si plus d’organoïdes sont nécessaires par gouttelette ECM, le volume moyen peut être diminué. Cependant, si moins d’organoïdes sont nécessaires, le volume moyen peut être augmenté.
    8. Mélangez bien les organoïdes, transférez le volume approprié dans le tube ECM posé sur de la glace, puis remettez en suspension les organoïdes et l’ECM en pipetant pour bien les mélanger.
    9. Ajoutez 65 μL du mélange de sphéroïdes et d’ECM au centre de chaque puits de la plaque de 24 puits à l’aide des pointes de pipette coupées de 200 μL.
      REMARQUE : Il est essentiel de prélever d’abord les organoïdes, puis l’ECM pendant le pipetage. Ainsi, lors de la distribution du mélange, les organoïdes se trouvent au sommet de la gouttelette ECM.
    10. Placez la plaque dans un incubateur à 37 °C, 5 % de CO2 pendant 5 min.
    11. Retournez la plaque pendant encore 15 à 25 minutes pour aider les gouttelettes ECM à maintenir une structure en forme de dôme.
    12. Ajouter 0,5 mL de milieu de croissance HIO/HCO dans chaque puits et incuber à 37 °C, 5 % CO2.
      REMARQUE : Le milieu de croissance est le même pour les HIO et les HCO après la structuration.
    13. Changez de support tous les 2-3 jours jusqu’au jour 35 (Figure 3G).

2. Vérification de la structuration des organoïdes par réaction en chaîne par polymérase quantitative à transcription inverse (RT-qPCR)

  1. Avant de prélever l’ARN, préparez 1x tampon de lyse de l’ARN en suivant les instructions du fabricant.
  2. Jeter le milieu usé et ajouter 350 μL de tampon de lyse dans chaque puits de la plaque à 24 puits. Lyser les organoïdes en pipetant de haut en bas à l’aide d’une pipette de 1 ml. Pour une meilleure lyse, agiter brièvement à vitesse maximale pendant 5 s.
  3. Conservez tous les échantillons à -80 °C jusqu’à ce qu’ils soient prêts pour l’extraction de l’ARN. Une fois prêts, sortez les échantillons d’ARN du congélateur à -80 °C et décongelez-les sur de la glace pendant 10 min. Agiter vigoureusement les tubes à température ambiante pendant 10 à 15 minutes pour assurer une lyse complète des échantillons.
  4. Placez à nouveau les échantillons sur de la glace et procédez à l’extraction de l’ARN selon les instructions du fabricant. Transférez les échantillons d’ARN dans un congélateur à -80 °C si vous n’êtes pas prêt à passer à l’étape suivante.
  5. Effectuez l’extraction d’ARN, le traitement de l’ADNe, la synthèse d’ADNc et la RT-qPCR à l’aide d’une méthodologie standard. Voir le tableau 2 pour une liste des noms et des séquences d’amorces.

3. Vérification de la structuration des organoïdes par immunofluorescence

  1. Collecte et fixation d’organoïdes
    1. Aspirer le milieu HIO ou HCO des puits appropriés et ajouter 1 mL de solution saline tamponnée au phosphate (PBS) glacée dans chaque puits. Dissociez les organoïdes de l’ECM à l’aide d’une pointe de pipette coupée de 200 μL. Pipette de haut en bas pour dissocier les gros morceaux d’ECM des organoïdes.
    2. Transférez les organoïdes dans un tube conique de 15 mL et remplissez le reste du tube de PBS glacé et mélangez doucement en inversant le tube. Laisser les organoïdes se déposer par gravité et aspirer le PBS.
      REMARQUE : Si les organoïdes ne se déposent pas par gravité, centrifuger à 300 × g pendant 1 min.
    3. Aspirez le PBS et ajoutez 1 mL de solution glacée de dégradation de l’ECM. Gardez le tube sur de la glace pendant 10 à 15 minutes sur une plate-forme rotative en secouant doucement.
      REMARQUE : Inclinez le tube à un angle de 45° pour permettre un bon mélange des organoïdes et de la solution de récupération cellulaire. Après 10-15 min, les organoïdes devraient se déposer au fond du tube, indiquant la digestion complète de l’ECM.
    4. Ajouter du PBS froid dans le tube jusqu’à 15 ml ; Bien mélanger en retournant le tube plusieurs fois. Lorsque les organoïdes se déposent au fond du tube, aspirez le PBS et ajoutez 1 mL de paraformaldéhyde à 4 % pré-refroidi pour fixer les organoïdes. Incuber les organoïdes avec 4 % de paraformaldéhyde sur de la glace pendant 1 h.
    5. Remplissez le reste du tube avec du PBS glacé et placez-le horizontalement sur une plate-forme à bascule à 4 °C pendant la nuit. Le lendemain, jeter le paraformaldéhyde/PBS dans le contenant à déchets spécifié et laver une fois avec 15 ml de PBS glacé, comme décrit à l’étape 3.1.2.
    6. Aspirez le PBS et remplissez le tube avec 30 % de saccharose dans du PBS. Placez le tube horizontalement sur une plate-forme basculante à 4 °C pendant la nuit.
    7. Le lendemain, intégrez les organoïdes dans un modèle de base de 7 mm x 7 mm x 5 mm avec un milieu OCT et congelez-les à l’aide d’un bain de glace carbonique et d’éthanol.
    8. Séchez les blocs avec des lingettes de laboratoire, enveloppez-les dans une serviette en papier et conservez-les dans un congélateur à -80 °C pendant la nuit. Le lendemain, découpez des coupes de 5 μm sur des lames de microscope à l’aide d’un cryostat. Stockez les lames à -80 °C.
  2. Coloration par immunofluorescence des organoïdes
    1. Traitez les lames à partir du congélateur à -80 °C et effectuez la coloration IF en utilisant les protocoles standard.
    2. Appliquez des lamelles sur les lames et séchez-les à température ambiante, à l’abri de la lumière pendant au moins 2 h ou toute la nuit avant l’imagerie.
    3. Imagez les lames à l’aide d’un objectif 25x d’un microscope confocal.

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Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La génération réussie de sphéroïdes au cours de la phase d’induction de l’intestin moyen et postérieur est révélatrice d’un modèle réussi. Effectuer une coloration IF pour CDX2 sur des sphéroïdes flottants et sur la monocouche pour confirmer que le motif est correct. Bien que la coloration au stade définitif de l’endoderme (DE) puisse indiquer l’efficacité de l’induction DE, la génération de sphéroïdes n’est pas possible sans une induction efficace de DE. Pour tester l’efficacité de l’induction DE, effectuez une colorati...

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La différenciation des CSP en DOI et en OSS est un processus complexe qui nécessite des contrôles de qualité à chaque étape. Les hPSC de départ doivent avoir une différenciation minimale avant d’initier la différenciation en DE. L’optimisation de la densité des hPSC plaqués pour la différenciation DE est essentielle au succès du protocole. Pour garantir la qualité de la différenciation DE, effectuez une FI pour FOXA2 et SOX17 afin de déterminer l’efficacité de la différenciation DE. La d...

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Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts à divulguer.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Le laboratoire Múnera est financé par le NIH/NCI 5U54CA210962-02 South Carolina Cancer Disparities Research Center (SC CADRE), NIH/NIGMS P20 GM130457-01A1 COBRE in Digestive and Liver Disease, et NIH/NIDDK 1P30 DK123704-01 MUSC Digestive Disease Research Core Center.

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Solution d’albumine sérique bovine à 1 % (BSA)N/AN/AN/A
Tube Corning de 15 mLFaucon21008-918N/A
30 % SaccharoseN/AN/AFabriqué en PBS.
5 % Sérum d’âne normalLaboratoire d’immunorecherche Jackson017-000-121N/A
Tube Corning de 50 mLFaucon21008-951N/A
AccutaseThermo ScientificA1110501Solution de décollement cellulaire ; aliquote 5 mL d’Accutase dans des tubes de 10 mL totalisant 20 tubes et stocker à -20 ° ; C jusqu’à 6 mois. Placer à 4 ° ; C toute la nuit avant utilisation.
Activine ASystèmes de guidage de cellulesGFH6-100x10Reconstituer la poudre lyophilisée à 100 & micro ; g/mL dans du PBS stérile contenant 0,1 % d’albumine sérique bovine (BSA). Aliquote 38 & micro ; L d’Activine A dans des tubes de microcentrifugation pré-réfrigérés et stockés à -80 ° ; C (Les tubes expirent 12 mois à compter de la date de réception).
Activin Jour 1 moyen (RPMI 1640)CorningMT10041CVUtilisez des acides aminés non essentiels (NEAA, Corning 11140050) et conservez-les à 4 °C. Milieu de base du jour 1 : 500 mL de RPMI 1640 et 500 mL de NEAA. Lors de la préparation d’Activin Day 1 medium, ajouter 13 mL de base day 1 medium, 13 & micro ; l d’Activine A (100 & micro ; g/mL), et 2 & micro ; l de BMP4 (100 µ ; g/mL). Le milieu de base est stable jusqu’à 3 semaines, mais doit être utilisé immédiatement après l’ajout de facteurs de croissance.
Milieu Activin Day 2 (RPMI 1640, 0,2 % FBS vol/vol)HycloneSH30070.03TUtiliser des acides aminés non essentiels (Corning 11140050) et conserver à 4 ° ;C. Milieu de base du jour 2 : 500 mL de RPMI 1640, 500 mL de NEAA et 1 mL de sérum à 0,2 %. Lors de la préparation d’Activin Day 2 medium, ajouter 12,5 mL de medium de base Day 2 et 12,5 & micro ; L d’Activine A (100 & micro ; g/mL). Le milieu de base est stable jusqu’à 3 semaines, mais doit être utilisé immédiatement après l’ajout de facteurs de croissance.
Activin Day 3 medium (RPMI 1640, 2 % FBS vol/vol)HycloneSH30070.03TUtilisez des acides aminés non essentiels (Corning 11140050) et conservez-les à 4 °C. Milieu de base du jour 3 : 500 ml de RPMI 1640, 500 ml de NEAA et 10 ml de sérum à 2 %. Lors de la préparation d’Activin Day 3 medium, ajouter 12,5 mL de base Day 3 et 12.5 µ ; L d’Activine A (100 & micro ; g/mL). Le milieu de base est stable jusqu’à 3 semaines, mais doit être utilisé immédiatement après l’ajout de facteurs de croissance.
Alexa Fluor 488 Âne anti-ChèvreThermo ScientificA11055Dilution 1:500 (anticorps secondaire)
Alexa Fluor 488 Âne anti-LapinThermo ScientificN° A21206Dilution 1:500 (anticorps secondaire)
Alexa Fluor 546 Âne anti-SourisThermo ScientificA10036Dilution 1:500 (anticorps secondaire)
Alexa Fluor 647 Âne anti-SourisThermo ScientificN° A31571Dilution 1:500 (anticorps secondaire)
Moule de basePêcheur22-363-552N/A
Moyen intestinal de base (DMEM avancé)Gibco12491015  ; Lors de la préparation du milieu intestinal de base, ajoutez 500 ml de DMEM, 500 ml de N2 (Gibco 17-502-048), 500 ml de B27 (Gibco), 500 ml de L-glutamine pour obtenir 2 mM de L-glutamine (Corning A2916801), 5 ml de pénicilline-streptomycine à 100 U/mL (Gibco 15-140-122) et 7,5 ml de 1 M HEPES pour obtenir 15 mM HEPES.  ; Le milieu de base est stable jusqu’à 3 semaines, mais doit être utilisé immédiatement après l’ajout de facteurs de croissance.
Système de détection PCR en temps réel Biorad CFX96 TouchBioradN/AD’autres systèmes qRT-PCR peuvent être utilisés.
Solution de récupération cellulaireCorning354253Solution de dégradation de l’ECM
CHIR99021Reprocell4000410Reconstituer en ajoutant 2,15 mL de DMSO à 10 mM. Préparez 50 & micro ; L aliquotes et conserver à -20 °C. Conserver la poudre à 4 ° ; C, à l’abri de la lumière.
Médium de motif CTRL HION/AN/AMilieu intestinal de base et 100 ng/mL d’EGF.
DAPISigma-AldrichD9542Dilution 1:100 (anticorps secondaire)
DE monocoucheN/AN/ALa monocouche a été générée dans les étapes précédentes (Section 4.4).
DispaseGibco17105041Remettre en suspension la poudre lyophilisée dans du DMEM avancé (Gibco MT15090CV) à une concentration finale de 1 mg/mL. Filtrez la solution pour la stérilisation par aspiration à l’aide d’un tube de stérilisation à filtre Millipore. Faire 10 mL d’aliquotes (1 mg/mL) et conserver à -20 ° ; C jusqu’à 6 mois. Placer à 4 ° ; C toute la nuit avant utilisation.
FEMThermo Scientific236-EG-01MLors de la préparation de 100 ng/mL d’EGF reconstituer 500 µ ; g/mL dans du PBS stérile. Ajoutez ensuite 2 ml de PBS stérile à 1 mg d’EGF et faites 500 µ ; g/mL de solution EGF. Aliquote 100 & micro ; L d’EGF dans 20 tubes.
Fisherbrand Boîtes de Pétri 6 cm avec couvercle transparentPêcheurFB0875713AN/A
Fisherbrand Élévateur de cellulesPêcheur08-100-240N/A
Fisherbrand Flacons filetés en verre transparent de classe B avec bouchons attachésPêcheurN° 03-338BN/A
Fisherbrand Pipette jetable en verre borosilicaté PasteurPêcheurTél. : 13-678-2D0N/A
Fluoromount G Slide Mounting MediumVWR100241-874N/A
DMEM avancé GibcoGibco12-491-023N/A
Anti-E-Cadhérine de chèvreR& Systèmes DAF648Dilution 1:400 (anticorps primaire)
Chèvre anti-SOX17R& Systèmes DAF1924Dilution 1:500 (anticorps primaire)
Médium de structuration HCON/AN/AMilieu intestinal de base, 100 ng/mL d’EGF et 100 ng/mL de BMP2. Lors de la préparation de BMP2, ajouter 1 mL de 4 mM stériles de HCl 0,1 % BSA dans les flacons de BMP2 (100 & micro ; g). Aliquote 25 et micro ; L de solution BMP4 dans 4 tubes. Le milieu de base est stable jusqu’à 3 semaines, mais doit être utilisé immédiatement après l’ajout de facteurs de croissance.
HémocytomètreSigma-AldrichZ359629N/A
Cellules souches pluripotentes humaines (hPSC)Installation de cellules souches pluripotentesN/ACellules ensemencées dans une plaque à 24 puits revêtue de Matrigel (Thermo Scientific 73520-906).
Solution glacée de paraformaldéhyde à 4 % (PFA)N/AN/AN/A
Saline tamponnée au phosphate glacée (PBS)N/AN/ALe pH doit être de 7,4.
Stylo barrière hydrophobe ImmEdgeLaboratoires Vecteurs101098-065N/A
Cellules souches pluripotentes induites (CSPi)Établissement de cellules souches pluripotentes (Centre médical de l’hôpital pour enfants de Cincinnati)N/AD’autres lignées hESC ou iPSC peuvent être utilisées, mais le protocole doit être optimisé pour chaque lignée cellulaire.
Microtome LeicaN/AN/AN/A
LSM 880Microscope confocal
Matrigel Matrice de membrane basaleCorning354234N/A
Matrigel hESC-qualified MatrixCorning354277Préparez 4 aliquotes de Matrigel, ce qui correspond à des volumes suffisants pour faire suffisamment de Matrigel dilué pour 4 plats à 6 puits.
Milieu d’induction de l’intestin postérieur (RPMI 1640)CorningMT10041CVAcides aminés non essentiels (Corning 11140050), 2 % FBS vol/vol (Hyclone SH30070.03T), 3 & micro ; M CHIR99021 et 500 ng/mL FGF4. Le milieu de base est stable jusqu’à 3 semaines, mais doit être utilisé immédiatement après l’ajout de facteurs de croissance.
Sphéroïdes de l’intestin moyen postérieurN/AN/AN/A
MilliporeSigma Steriflip Unités de filtration sous vide stériles jetablesMilliporeSigmaSCGP00525N/A
Souris anti-CDX2BioGenexRéférence : MU392-UCDilution 1:300 (anticorps primaire)
Souris anti-FOXA2Abnova/NovusH00003170-M01Dilution de 1:500
Milieu de croissance complet mTeSR1Technologies des cellules souches85870Ajouter 100 mL de supplément mTeSR (85870) dans un milieu mTeSR de 400 mL (85870) et aliquote dans des tubes de 50 mL tout en évitant la contamination. Stocker à 4° ; C jusqu’à l’utilisation.
Solution claire de Murray (également connue sous le nom de BABB)Murray’sN/A1:2 benzoate de benzyle et alcool benzylique.
Médium à motifs NOG HION/AN/AMilieu intestinal de base, 100 ng/mL d’EGF et 100 ng/mL de NOGGIN (Dispense 25 µ ; g de NOGGIN en 250 µ ; l PBS stérile avec 0,1 % de BSA).
ARN NucleoSpinTakara740955.25D’autres kits d’isolement de l’ARN peuvent être utilisés.
Boîte de culture de tissus de surface Nunclon delta 24 puits (Nunc)Thermo Scientific73521-004N/A
Boîte de culture tissulaire de surface Nunclon delta 24 puits recouverte de MatrigelThermo Scientific73521-004N/A
Boîte de culture tissulaire de surface Nunclon delta 6 puits (Nunc)Thermo Scientific73520-906N/A
Boîte de culture de tissus de surface Nunclon delta 6 puits recouverte de  ; Matrigel.Thermo Scientific73520-906N/A
Milieu d’excroissance pour les DOI, les DOI CTRL et les OSCN/AN/AMilieu intestinal basique et 100 ng/mL d’EGF (concentration finale)
Tampon phosphate salin, 0,5 % de triton X (PBS-T)N/AN/AN/A
AmorcesIntegrated DNA Technologies, Inc. (IDT)N/ALes amorces sont énumérées dans le tableau 2 du protocole.
Lapin anti-CDX2Cell MarqueEPR22764YDilution 1:100 (anticorps primaire)
Lapin anti-SATB2Cell MarqueEP281Dilution 1:100 (anticorps primaire)
Protéine BMP-4 humaine recombinanteR& Systèmes DRéférence 314-BP-010Reconstituer la poudre lyophilisée à 100 & micro ; g/mL dans du HCl stérile de 4 mM contenant 0,1 % d’albumine sérique bovine (BSA). Ajouter 4,17 mL de solution de HCl à 45,83 mL d’eau moléculaire, pour un total de 50 mL de 1 M de HCl. Ajoutez ensuite 200 µ ; L de 1 M HCl à 49,8 mL d’eau de qualité moléculaire totalisant 50 mL de 4 mM HCl. Ajoutez ensuite 0,05 g de BSA à 50 mL de HCl 4 mM et filtrez pour rendre stérile. Aliquote stérile 4 mM HCl 0,1 % BSA à 33 tube de microcentrifugation totalisant et stockant à -20 ° ;C. Ajouter 100 µ ; l de HCl stérile 4 mM de BSA à 0,1 % dans les flacons BMP4 (10 & micro ; g) faire une solution BMP4 à 100 & micro ; g/mL.
Protéine FGF-4 humaine recombinanteR& Systèmes D235-F4-01MReconstituer à 100 µ ; g/mL dans du PBS stérile contenant 0,1 % d’albumine sérique bovine. Ajouter 0,05 g de BSA dans 50 mL de PBS pour obtenir 0,1 % de BSA. Filtre 0.22 & micro ; M BSA pour stériliser le BSA. Aliquote 10 mL de BSA à 0,1 % dans 5 tubes. Ajouter 1 mg de FGF-4 dans 10 mL de BSA stérile à 0,1 %. Aliquote 250 & micro ; L dans 40 tubes de microcentrifugation prérefroidis et stocker à -80 °C.
Inhibiteur de ROCK Y-27632Tocris1254La concentration finale est de 10 mM (10 mmol/L). Remettre en suspension dans le DMSO à 10 mM et stériliser par filtre. Ajouter 3 ml de PBS stérile dans chaque flacon. Aliqout 100 & micro ; L d’inhibiteur de ROCK dans 30 tubes et à stocker à -20 ° ;C.
Kit de synthèse d’ADNc SuperScript VILOThermo Scientific11-754-250N/A
Lames de microscope SuperFrost Plus
Composé Tissue Tek O.C.TVWR25608-930N/A

References

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