Isolement de l’extrait nucléaire actif de Caenorhabditis elegans et reconstitution pour la transcription in vitro

Résumé

Nous décrivons ici un protocole détaillé pour isoler l’extrait nucléaire actif de C. elegans au stade larvaire 4 et visualiser l’activité de transcription dans un système in vitro .

Résumé

Caenorhabditis elegans est un système modèle important pour la recherche biologique depuis son introduction en 1963. Cependant, C. elegans n’a pas été pleinement utilisé dans l’étude biochimique des réactions biologiques utilisant ses extraits nucléaires tels que la transcription in vitro et la réplication de l’ADN. Un obstacle important à l’utilisation de C. elegans dans les études biochimiques est de perturber l’épaisse cuticule externe du nématode sans sacrifier l’activité de l’extrait nucléaire. Bien que plusieurs méthodes soient utilisées pour casser la cuticule, telles que l’homogénéisation ou la sonication de Dounce, elles conduisent souvent à une instabilité des protéines. Il n’existe pas de protocole établi pour isoler les protéines nucléaires actives de la larve ou de C. elegans adulte pour les réactions in vitro . Ici, le protocole décrit en détail l’homogénéisation de C. elegans larvaire de stade 4 à l’aide d’un homogénéisateur Balch. L’homogénéisateur Balch utilise la pression pour forcer lentement les animaux à traverser un espace étroit brisant la cuticule dans le processus. La conception uniforme et l’usinage précis de l’homogénéisateur Balch permettent un meulage cohérent des animaux entre les expériences. Le fractionnement de l’homogénat obtenu à partir de l’homogénéisateur Balch donne un extrait nucléaire fonctionnellement actif qui peut être utilisé dans une méthode in vitro pour tester l’activité de transcription de C. elegans.

Introduction

Le petit nématode libre Caenorhabditis elegans est un organisme modèle simple mais puissant pour répondre à un large éventail de questions biologiques. Depuis son introduction en 1963, les nématodes ont été inestimables pour répondre aux questions de neurobiologie, de métabolisme, de vieillissement, de développement, d’immunité et de ^génétique1. Certaines des nombreuses caractéristiques de l’animal qui en font un organisme modèle idéal comprennent le temps de génération court, l’efficacité de l’interférence ARN, le corps transparent et les cartes complètes de sa lignée cellulaire et de son système nerveux.

Bien que les contributions du nématode à la science soient vastes, elles ont été sous-utilisées pour élucider le système de transcription eucaryote, la plupart de notre compréhension de ces mécanismes provenant d’études utilisant l’extrait nucléaire de levure, de mouche des fruits et de culture cellulaire de ^mammifères2. Le plus grand obstacle qui dissuade les chercheurs d’extraire de l’extrait nucléaire fonctionnel est la cuticule externe dure du nématode. Cet exosquelette comprend des collagènes réticulés, des cuticlines, des glycoprotéines et des lipides, ce qui rend C. elegans du stade larvaire à l’âge adulte résistant à l’extraction des protéines par des forces chimiques ou ^mécaniques3. Un système de transcription in vitro utilisant l’extrait nucléaire de C. elegans a déjà été développé mais n’a pas été largement adopté en raison de la portée limitée du système, et l’utilisation de l’homogénéisateur Dounce pour la préparation de l’extrait pourrait entraîner une instabilité des protéines4,5.

Contrairement au protocole précédent pour l’isolation des extraits nucléaires qui utilisait un homogénéisateur Dounce pour casser C. elegans, ce protocole utilise un homogénéisateur Balch. L’homogénéisateur Balch se compose de deux composants principaux: une bille en carbure de tungstène et un bloc en acier inoxydable avec un canal percé d’une extrémité à l’autre. L’homogénéisateur Balch est chargé avec la bille de carbure de tungstène et bouché de chaque côté pour sceller la chambre de broyage. Les seringues peuvent être chargées sur les deux orifices verticaux menant à la chambre de broyage. Lorsque le matériau est passé d’une seringue à l’autre à travers la chambre de broyage, la pression des seringues force le matériau à travers un espace étroit entre la bille et la paroi de la chambre. Cette pression lente et constante brise le matériau jusqu’à ce qu’il atteigne une taille constante capable de traverser facilement l’espace étroit. Forcer C. elegans à traverser l’étroit espace via une pression constante mais douce brise les animaux, libérant leur contenu dans le tampon environnant. Changer la taille des billes resserre encore l’écart, brisant les cellules nouvellement libérées et libérant les noyaux dans le tampon. De multiples cas de centrifugation séparent les noyaux du reste des débris cellulaires, ce qui permet la collecte d’un extrait nucléaire propre. L’homogénéisateur Balch est préféré à l’homogénéisateur Dounce pour plusieurs raisons : le système peut traiter un grand nombre d’animaux, ce qui permet d’extraire une grande quantité de protéines actives en une seule tentative ; l’usinage précis des billes et du bloc d’acier permet un meulage cohérent entre plusieurs échantillons; le bloc d’acier lourd agit comme un dissipateur de chaleur, éloignant uniformément la chaleur de la chambre de broyage, empêchant ainsi la dénaturation.

Après isolement, l’activité transcriptionnelle de l’extrait nucléaire doit être vérifiée avant d’être utilisée dans des expériences biochimiques. Traditionnellement, l’activité de transcription était mesurée à l’aide de nucléotides radiomarqués pour suivre et visualiser l’ARN nouvellement synthétisé. Cependant, l’étiquetage radioactif peut être fastidieux car il nécessite des précautions lors de l’utilisation et de l’élimination6. Les progrès technologiques permettent aux chercheurs d’aujourd’hui d’utiliser des méthodes beaucoup moins nocives ou gênantes pour mesurer même de petites quantités d’ARN à l’aide de techniques telles que la PCR quantitative en temps réel (qRT-PCR)⁷. Ici, le protocole décrit une méthode pour isoler l’extrait nucléaire actif du stade larvaire 4 (L4) C. elegans et visualiser l’activité de transcription dans un système in vitro.

Protocole

1. Préparations médiatiques

1. Préparez des plaques de gélose stériles en lysogénie (LB) et des milieux liquides en suivant les instructions du fabricant.
2. Streak Escherichia coli (E. coli) souche OP50 sur une plaque de gélose LB. Incuber les bactéries à 37 °C pendant la nuit.
3. Conserver la plaque de stries e. coli OP50 à 4 °C après l’incubation. La plaque E. coli OP50 peut être conservée en toute sécurité à 4 °C pendant 2 semaines si elle est enveloppée dans un parafilm pour éviter la perte d’humidité.
4. Préparer 2 L de milieux de croissance des nématodes (NGM) à l’aide de la recette du tableau 1.
   REMARQUE: Nystatin est facultatif. La nystatine aide à empêcher la moisissure et d’autres contaminants fongiques de se développer sur les plaques NGM. Les grandes plaques de 150 mm de diamètre ont plus de chances d’attraper des spores fongiques lorsque le couvercle est retiré pour verser et ensemencer E. coli OP50. Nystatin peut être acheté prémélangé dans une solution stérile auprès de vendeurs à 10 000 unités / mL ou peut être acheté sous forme de poudre stérile et mélangé avec de l’eau stérile. La nystatine ne peut pas être autoclavée, ni stérilisée efficacement. L’attention portée à la technique aseptique est cruciale lors du mélange d’une solution de nystatine en laboratoire. Autoclave 1 M _CaCl2, 1 M _KPO4 pH 6,0 et 1 M MgSO4 à 121 °C pendant 15 min. Filtrer le cholestérol à travers un filtre de 0,22 μm après avoir été dissous dans de l’éthanol à 95%.
5. Après avoir ajouté les réactifs au support, versez du NGM dans quarante boîtes de Petri de 150 mm. Chaque plat de 150 mm nécessite 50 mL pour être rempli. Laissez les plaques NGM refroidir pendant la nuit à température ambiante.
6. Inoculer deux tubes coniques de 50 mL contenant 25 mL de LB stérile avec E. coli OP50 de la plaque de traînée précédente. Incuber le bouillon à 37 °C pendant 24 h dans un incubateur à agitation maintenu à 200 tr/min.
   REMARQUE: Pour plus de cohérence, inoculez les deux tubes avec la même colonie unique à partir de la plaque de traînée. Si cela s’avère difficile, inoculer 5 mL de LB stérile avec une seule colonie dans un tube conique de 50 mL et incuber la culture pendant 16 h à 37 °C dans un incubateur à agitation maintenu à 200 tr/min la veille de la préparation des plaques NGM. Conserver la culture liquide fraîche à 4 °C jusqu’à deux jours. Inoculer les deux 25 mL de bouillon avec 25 μL de culture liquide et incuber dans les mêmes conditions que celles mentionnées ci-dessus.
7. Plantez des plaques de NGM fraîches avec 1 mL de culture liquide fraîche d’E. coli OP50 et étalez-les uniformément à l’aide d’un épandeur stérilisé à la flamme sur la surface de la plaque de manière aseptique pour créer une grande pelouse bactérienne qui recouvre la majorité de la plaque, en prenant soin de ne pas propager les bactéries d’un bord à l’autre. Laissez l’E. coli OP50 pousser à température ambiante pendant 72 à 96 h ou jusqu’à ce qu’une pelouse visiblement épaisse apparaisse.
   REMARQUE: Après 24 h, déplacez les plaques de NGM fraîchement ensemencées dans un récipient couvert pour réduire la perte d’humidité et prolonger la durée de vie des plaques.

2. Préparations animales et synchronisation de l’eau de Javel

1. Transférer 5 C. elegans adultes gravides de type sauvage bien nourris dans chacune des 10 assiettes de NGM fraîches ensemencées avec E. coli OP50, pour un total de 50 animaux.
2. Laissez les animaux pondre des œufs. Laissez la progéniture croître à 20 °C jusqu’à ce qu’elle atteigne le stade adulte gravide.
3. Utilisez 15 mL de tampon M9 (tableau 2) pour recueillir les nouveaux adultes gravides de type sauvage bien nourris dans les dix plaques d’entretien et transférer les animaux dans un tube conique étiqueté de 15 mL.
4. Centrifugez les animaux à 1 000 x g pendant 3 min pour granuler tous les animaux au fond du tube.
5. Dans un tube conique séparé étiqueté de 15 mL, mélanger 2 mL d’eau de Javel avec 5 mL de NaOH 1 N pour la synchronisation de l’eau de Javel. Vortex la solution à bien mélanger.
   REMARQUE: Utilisez la solution d’eau de Javel + NaOH le jour même où elle est préparée pour être efficace.
6. Retirez doucement le surnageant des animaux centrifugés à l’aide d’une pipette stérile de 10 mL. Essayez d’enlever autant de tampon M9 que possible pour améliorer la rupture des animaux.
7. Ajouter 500 μL de la solution d’eau de Javel + NaOH à la pastille animale et démarrer une minuterie pendant 4 min.
8. Soit à la main, soit à l’aide d’une bascule, secouez doucement le tube pour casser complètement la pastille animale et laissez les animaux se déplacer librement dans la solution d’eau de Javel + NaOH. Continuez à balancer le tube pendant toute la durée de 4 minutes.
   REMARQUE: La quantité d’eau de Javel + solution de NaOH nécessaire peut varier en fonction de la taille de la pastille animale synchronisée. Optimisez cette technique au préalable avec des quantités variables d’animaux et de solution d’eau de Javel + NaOH.
9. Après 4 min, vérifiez l’efficacité de rupture sous un microscope à dissection. Assurez-vous que la majorité des animaux adultes gravides sont brisés et que leur contenu interne est libéré, y compris les œufs.
10. Si les animaux ne sont pas fendus, vortex brièvement le tube à la vitesse maximale, puis vérifiez à nouveau au microscope.
    REMARQUE: Bien que les œufs soient résistants à la solution d’eau de Javel + NaOH, ils ne sont pas imperméables. Les œufs ne doivent pas être exposés à la solution d’eau de Javel + NaOH plus longtemps que nécessaire. Le blocage trop longtemps pendant l’étape de rupture de l’animal peut entraîner des problèmes de développement pour la progéniture.
11. Ajouter 10 mL du tampon M9 à la solution animale brisée.
12. Centrifuger les œufs et les restes à 1 000 x g pendant 3 min.
13. Pipettez le surnageant, en veillant à ne pas toucher la nouvelle pastille contenant tous les œufs au fond du tube.
14. Ajouter encore 10 mL de tampon M9 et centrifuger à nouveau pendant 3 min à 1 000 x g.
15. Répétez les étapes 2.13-2.14 deux fois de plus pour vous assurer qu’il ne reste aucune solution d’eau de Javel + NaOH.
16. Après le troisième lavage du tampon M9, retirer le surnageant et ajouter 10 mL du tampon basal S (tableau 2).
17. Inverser le tube pour casser la pastille au fond pour suspendre les œufs également dans le tampon.
18. Placez le tube sur une bascule et secouez doucement le tube pendant 22 h à 20 °C pour permettre aux œufs d’éclore et d’atteindre le stade larvaire 1 (L1) d’arrêt.
19. Après 22 h, centrifuger le tube contenant des animaux L1 synchronisés pendant 3 min à 1000 x g.
20. Pipette et jeter le surnageant en laissant environ 1 mL de tampon dans le tube.
21. À l’aide d’une micropipette, dérangez la pastille animale pour obtenir une suspension homogène d’animaux L1 dans le tampon restant.
22. Transférer une seule gouttelette de la suspension homogène d’animaux L1 dans une plaque NGM étiquetée de 150 mm ensemencée avec E. coli OP50.
23. Calculez la densité animale par goutte en comptant visuellement le nombre d’animaux L1 par goutte à l’aide d’un microscope à dissection. Une plaque NGM de 150 mm avec une pelouse entièrement développée d’E. coli OP50 peut supporter jusqu’à 500 animaux du stade L1 pour atteindre le stade adulte gravide.
24. Transférer les animaux L1 sur six plaques NGM de 150 mm avec E. coli OP50. Assurez-vous de ne pas surcharger la plaque.
    REMARQUE: S’il n’est pas clair si les animaux auront suffisamment de nourriture pour le développement entre L1 et l’adulte gravide, ajoutez moins d’animaux à chaque assiette et utilisez plus d’assiettes.
25. Laissez les animaux grandir pendant 72 h à 20 °C jusqu’à ce qu’ils atteignent le stade adulte gravide et commencent à pondre.
26. Effectuez une deuxième série de synchronisation de l’eau de Javel sur les animaux adultes gravides de type sauvage synchronisés et bien nourris.
27. Placer les animaux L1 synchronisés sur dix plaques NGM de 150 mm ensemencées avec E. coli OP50, avec environ 1 000 animaux par plaque.
28. Laissez les nouveaux animaux L1 synchronisés grandir pendant 48 h à 20 °C jusqu’à ce qu’ils atteignent le stade L4.
    REMARQUE: L’objectif est d’obtenir une pastille d’environ 700 à 800 μL d’animaux L4. Trop d’animaux peuvent rendre difficile l’utilisation de l’homogénéisateur Balch; cela peut entraîner une tension musculaire lors de l’utilisation de l’homogénéisateur et une fuite possible des seringues en raison de l’augmentation de la pression.

3. Préparation de l’homogénéisateur Balch

1. Préparer les tampons hypotoniques et hypertoniques comme mentionné dans les tableaux 3 et 4.
   REMARQUE: Les tampons hypotoniques et hypertoniques peuvent être préparés à l’avance et stockés en toute sécurité à 4 ° C.
2. Nettoyez l’homogénéisateur Balch en inondant la chambre de broyage avec 70% d’éthanol, puis rincez la chambre à l’eau désionisée pour éliminer l’excès d’éthanol.
   REMARQUE: Évitez d’utiliser des agents caustiques pour nettoyer l’homogénéisateur Balch. Un rinçage complet à l’éthanol et à l’eau désionisée devrait suffire à le nettoyer.
3. Insérez la bille de carbure de tungstène de 7,9820 mm (jeu d’espace de 18 μm) dans la chambre de broyage.
4. Boucher chaque extrémité du canon de l’homogénéisateur Balch et fixer les bouchons avec les vis à pouce fournies.
5. Préparer 5 mL de « tampon hypotonique complet » par échantillon : Ajouter 5 μL de 1 M TNT (concentration finale : 1 mM TNT) et 100 μL d’inhibiteur de protéase 100x, cocktail à usage unique (concentration finale : 2x). Gardez le tampon sur la glace.
6. Préparer 5 mL de « tampon hypertonique complet » par échantillon : Ajouter 5 μL de 1 M TNT (concentration finale : 1 mM TNT) et 100 μL d’inhibiteur de protéase 100x, cocktail à usage unique (concentration finale : 2x). Gardez le tampon sur la glace.
   REMARQUE: Utilisez le tampon hypotonique et hypertonique complet le jour même de la préparation. Ne le conservez pas pour une utilisation ultérieure. Conserver 1 M TNT sous forme d’aliquotes à usage unique à -20 °C. Conserver le cocktail à usage unique inhibiteur de protéase à 4 °C.
7. Remplissez une seringue stérile de 2 mL avec 1 mL de « tampon hypotonique complet » et rincez doucement la chambre de broyage de l’homogénéisateur Balch. Laissez environ 500 μL de « tampon hypotonique complet » dans la chambre.
8. Conservez l’homogénéisateur rincé sur de la glace et laissez-le refroidir pendant 30 min.
   REMARQUE: L’homogénéisateur doit être glacé avant de broyer les animaux. Le processus de broyage peut produire de la chaleur due au frottement et dénaturer les protéines nucléaires. Assurez-vous que l’homogénéisateur métallique est glacé pour éviter que cela ne se produise. Assurez-vous d’éviter que l’eau de la glace environnante ne pénètre dans l’homogénéisateur. Utilisez deux seringues stériles pour boucher les trous de l’homogénéisateur et empêcher tout liquide involontaire de pénétrer dans la chambre de broyage.

4. Collecte d’animaux

REMARQUE : Un guide de référence rapide est fourni, indiquant les principales étapes de la collecte, de la perturbation et du fractionnement des animaux (figure 1).

1. Recueillir les animaux L4 bien nourris avec un tampon M9 dans un tube conique de 15 mL et centrifuger les animaux à 1000 x g pendant 3 min. Retirez le surnageant et continuez à laver la pastille animale jusqu’à ce que le surnageant soit clair.
2. Laver les animaux avec 3 mL de tampon hypotonique à 4 °C et centrifuger à nouveau à 1000 x g pendant 3 min.
   REMARQUE: Lors du lavage final avec le tampon hypotonique à 4 °C, les animaux peuvent coller sur le côté du tube. Ceci est normal et peut entraîner une petite perte d’animaux lors de l’enlèvement du surnageant.
3. Retirez le tampon hypotonique et ajoutez 1 mL de « tampon hypotonique complet » à la pastille animale. Transférer la suspension animale dans une nouvelle seringue stérile de 2 mL.
   REMARQUE: Lors du transfert des animaux à la seringue à l’aide d’une micropipette, pipettez doucement une solution stérile de Tween20 à 0,1% pour recouvrir l’intérieur de la pointe de la pipette afin de réduire le nombre d’animaux perdus en raison de l’adhérence aux parois de la pointe de la pipette.

5. Fractionnement

1. Sur la glace, homogénéisez les animaux en les poussant doucement à travers la chambre de broyage de l’homogénéisateur Balch chargé de la bille de 7,9820 mm et dans une nouvelle seringue stérile. Répétez en poussant les animaux à travers la chambre de broyage pendant 30 cycles complets.
   REMARQUE: Un « cycle complet » est défini comme le mouvement complet de haut en bas du piston d’une seringue.
   Cette étape de meulage utilise une bille de 7,9820 mm (roulement à billes de 18 μm).
2. Après 30 cycles, retirez autant que possible la suspension animale de l’homogénéisateur Balch et rangez la seringue dans un microtube de 1,7 mL.
3. Retirez la bille de 7,9820 mm de la chambre de broyage et nettoyez-la à l’eau désionisée. Sécher et remettre la balle dans son tube étiqueté.
4. Insérez la bille de 7,9880 mm (jeu d’espace de 12 μm) dans la chambre de broyage et refermez l’homogénéisateur.
5. Rincer à nouveau la chambre de broyage avec 1 mL de « tampon hypotonique complet » glacé.
6. Broyer la suspension pendant 25 cycles complets.
7. Après 25 cycles, retirez la suspension animale de l’homogénéisateur Balch, transférez la suspension dans un microtube propre de 1,7 mL et stockez-la sur de la glace.
   REMARQUE: Démontez et nettoyez l’homogénéisateur Balch avec 70% d’éthanol et d’eau désionisée. Assurez-vous de retourner la bille de 7,9880 mm dans son tube approprié.
8. Pelleter les corps et les débris des animaux en centrifugant la suspension à 500 x g, 4 °C pendant 5 min.
9. Pipette 40 μL du surnageant dans un tube étiqueté « fraction d’entrée » et le stocker sur de la glace.
   REMARQUE: Écrivez toutes les étiquettes avec un stylo anti-alcool pour éviter de les enduire plus tard.
10. Transférer le surnageant restant dans un nouveau tube de 1,7 mL, en prenant soin d’éviter de toucher le granulé au fond du tube, puis jeter le granulé.
11. Centrifuger le surnageant pour granuler les noyaux à 4 000 x g, 4 °C pendant 5 min.
12. Transférer le surnageant, en prenant soin de ne pas perturber les noyaux en granulés, dans un nouveau tube de 1,7 mL et étiqueter le tube comme « fraction cytosolique ».
    REMARQUE: Centrifuger la fraction cytosolique à 17 000 x g, 4 °C pendant 30 min pour éliminer tout matériau insoluble restant, et l’utiliser comme témoin négatif pour les transferts occidentaux (en particulier pour les protéines nucléaires).
13. Lavez la pastille de noyau avec 500 μL de « tampon hypotonique complet » et transférez la pastille dans un nouveau tube de 1,7 mL. Centrifuger la pastille en suspension à 4 000 x g, 4 °C pendant 5 min.
14. Jeter le surnageant et ajouter 500 μL de « tampon hypotonique complet » frais à la pastille nucléaire et transférer la suspension dans un nouveau tube de 1,7 mL. Centrifuger à nouveau l’échantillon à 4 000 x g, 4 °C pendant 5 min.
15. Retirer le surnageant et dissoudre la pastille dans 40 μL de « tampon hypertonique complet ». Transférez la nouvelle suspension nucléaire dans un nouveau tube de 1,7 mL, étiquetez le tube comme « fraction nucléaire » et stockez-le sur de la glace.
16. Déterminez la concentration en protéines des trois fractions à l’aide d’un kit de quantification fluorescente.
    REMARQUE: La quantité de protéine nucléaire acquise à partir de cette méthode peut varier de 1 à 2 μg / μL.
17. Aliquoter les fractions nucléaires dans des tubes à usage unique contenant 6 μg de protéine nucléaire et les congeler dans un bain de glace sèche et d’éthanol. Conserver à -80 °C jusqu’à nouvel usage.

6. Essai de transcription

1. Allumez et préchauffez un bloc chauffant à 30 °C.
2. Retirez les éléments suivants du système de transcription in vitro Nulcear Extract : 50 mM _MgCl2, Nuclear Extract 1x Transcription Buffer, 100 mM rATP, 100 mM rCTP, 100 mM rGTP, 100 mM rUTP et le modèle de contrôle positif du promoteur CMV. Dégel sur glace.
   REMARQUE: Amplifier le gabarit d’ADN témoin positif à l’aide d’une polymérase haute fidélité et le stocker sous forme d’aliquotes normalisées à usage unique.
3. Mélanger et centrifuger les GNR décongelés avant de préparer une solution de travail de 10 mM.
   REMARQUE: Ajouter 2 μL de chaque rATP, rCTP, rGTP et rUTP à 12 μL de _H2O pour obtenir 10 mM de chaque rNTP. Cette composition peut être augmentée si nécessaire.
4. Aliquoter le mélange de rNTP dans des tubes à usage unique étiquetés et le conserver à -20 °C pour une utilisation future.
5. Dans un tube frais de 1,5 mL portant la mention « Mastermix », ajouter les réactifs par réaction, comme indiqué dans le tableau 5.
6. Transférer 14 μL du Mastermix dans chaque tube de réaction
7. Ajouter 11 μL moins (volume pour 5 μg de l’extrait nucléaire) de 1x tampon de transcription à chaque tube de réaction.
8. Ajouter 5 μg d’extrait nucléaire à chaque tube de réaction.
9. Tapotez doucement le tube de réaction pour mélanger le contenu à l’intérieur et centrifugez les tubes après le mélange pour vous assurer qu’aucun matériau de réaction n’est collé à la paroi des tubes.
10. Incuber les réactions à 30 °C pendant 30 min.
11. Arrêtez immédiatement la réaction en ajoutant 400 μL de tampon RLT fourni par le kit d’extraction d’ARN.
    REMARQUE: À ce stade, il est prudent de s’arrêter. Les échantillons peuvent être conservés à -80 °C jusqu’à ce qu’ils soient nettoyés avec le kit d’extraction d’ARN.

7. Nettoyage de l’ARN

1. Préparez la solution mère DNase I à l’aide de l’ensemble DNase sans RNase fourni dans le kit d’extraction d’ARN. Dissoudre la DNase I lyophilisée dans 550 μL d’eau sans RNase. Mélanger doucement la solution. Ne pas vortex . Aliquoter la solution de DNase I dans des tubes à usage unique de 10 μL et conserver les aliquotes à -20 °C.
2. Préparez 70 % et 80 % d’éthanol à l’aide d’éthanol de qualité moléculaire et d’eau sans RNase.
3. Déplacez les échantillons et les réactifs vers un espace de travail sans RNase avant de commencer le nettoyage.
4. Ajouter 400 μL d’éthanol à 70 % à chaque échantillon et pipeter doucement pour bien mélanger.
5. Transférer 400 μL de l’échantillon dans une colonne de spin d’extraction d’ARN marquée avec un tube de prélèvement de 2 mL et centrifuger l’échantillon à 8 500 x g pendant 30 s. Jetez le flux.
6. Répétez l’étape 7.5 avec l’échantillon restant et jetez le flux à travers.
7. Ajoutez 350 μL de tampon RW1 (kit d’extraction d’ARN) à chaque colonne. Centrifuger les colonnes à 8 500 x g pendant 30 s. Jetez le flux.
8. Ajouter 70 μL de tampon RDD (kit d’extraction d’ARN) à une seule aliquote de 10 μL de solution mère de DNase I et mélanger doucement. Ne pas vortex.
9. Ajouter le mélange d’incubation de la DNase I (80 μL) directement à la membrane de la colonne de spin. Incuber les colonnes à température ambiante pendant 15 min.
   REMARQUE: Assurez-vous d’ajouter la solution DNase I à la membrane. Évitez de perdre une partie de la solution sur le mur de la colonne ou le joint torique.
10. Après 15 min, ajoutez 350 μL de tampon RW1 aux colonnes. Centrifugeuse pendant 30 s à 8 500 x g. Jetez le flux.
11. Placez les colonnes dans de nouveaux tubes de collecte de 2 mL. Ajoutez 500 μL de tampon RPE (kit d’extraction d’ARN) à la colonne de spin. Centrifugez les colonnes à 8 500 x g pendant 30 s pour laver la membrane. Jetez le flux.
12. Ajouter 500 μL d’éthanol à 80 % à chaque colonne et centrifuger les colonnes à 8 500 x g pendant 30 s. Jetez le flux.
13. Placez les colonnes dans de nouveaux tubes de collecte de 2 mL. En laissant les couvercles des colonnes ouverts, centrifugez les colonnes à 17 900 x g pendant 5 min. Jetez le flux.
14. Placez les colonnes dans des tubes étiquetés de 1,7 mL. Ajouter 17 μL d’eau sans RNase directement au centre de la membrane de la colonne de spin. Laissez les colonnes reposer à température ambiante pendant 1 min. Centrifuger les colonnes à 17 900 x g pendant 1 min.
15. Jetez la colonne et conservez le tube de 1,7 mL avec l’échantillon d’ARN fraîchement purifié.

8. Digestion de l’ADN

1. Préchauffer deux blocs de chaleur à 37 °C et 65 °C.
2. Ajouter 2 μL de tampon de réaction 10x à chaque échantillon.
3. Ajouter 1 μL (1 MBU) de DNase à chaque échantillon.
4. Réglez une pipette à 10 μL et pipetez la nouvelle solution de haut en bas pour mélanger doucement. Ne pas vortex.
5. Incuber les échantillons d’ARN à 37 °C pendant 30 min pour digérer l’ADN restant.
6. Inactiver la DNase en incubant les échantillons sur le bloc thermique à 65 °C pendant 10 min.
   REMARQUE: Il est prudent de s’arrêter à cette étape et de stocker l’ARN à -80 ° C pour effectuer une transcription inverse plus tard.

9. Transcription inverse

1. Lors de la programmation du thermocycleur, ajoutez une étape supplémentaire de 1 h et 37 °C avant l’incubation pour préchauffer le thermocycleur. Exécutez le programme avec l’étape de préchauffage lors de la préparation des échantillons et laissez le thermocycleur atteindre 37 ° C. Lorsque les échantillons pour la transcription inverse sont prêts, sautez l’étape de préchauffage à 37 °C et passez à l’étape d’incubation proprement dite (tableau 6). Si le thermocycleur n’a pas de fonction de saut, ajoutez une étape de 1 min 37 °C avant l’incubation. Laissez le thermocycleur chauffer à la bonne température avant de mettre le système en pause et d’ajouter les échantillons préparés.
2. Préparez une solution de travail de 10 μM d’amorce inverse de transcription dans du _H2O sans RNase et stockez-la sur de la glace.
3. Dégel sur glace, tampon 10x du kit de transcription inverse, mélange dNTP (5 mM chaque dNTP), inhibiteur de RNase et transcriptase inverse.
4. Préparer un Mastermix (par réaction) en ajoutant les constituants mentionnés au tableau 7 dans un tube PCR propre de 0,2 mL.
5. Aliquote 18 μL du Mastermix dans de nouveaux tubes PCR de 0,2 mL pour chaque échantillon.
6. Ajouter 2 μL de l’ARN traité à la DNase pour chaque échantillon dans leurs tubes marqués respectivement.
7. Incuber les échantillons à 37 °C pendant 1 h dans un thermocycleur préchauffé.
8. Déplacez les échantillons à -20 °C pour le stockage après la transcription inverse ou passez directement à l’étape suivante.
   REMARQUE: Il est prudent de s’arrêter à cette étape; stocker l’ADNc à -20 °C pour une utilisation ultérieure.

10. Amplification spécifique du produit

1. Dégel sur glace : ADNc, amorces de transcription avant de 10 μM et amorces de transcription inverse de 10 μM, et prémélange PCR 2x A.
   REMARQUE: Aliquote le prémélange PCR 2x A en plus petits volumes pour réduire le temps de dégel.
2. Créer un Mastermix (par réaction) en ajoutant les constituants mentionnés dans le tableau 8 dans un tube PCR propre de 0,2 mL.
3. Aliquote 24 μL de Mastermix pour chaque échantillon dans des tubes PCR de 0,2 mL étiquetés propres.
4. Ajouter 1 μL d’ADNc de chaque échantillon dans leurs tubes respectifs.
5. Incuber les échantillons dans le thermocycleur en utilisant les conditions de programme mentionnées dans le tableau 9
6. Après l’incubation, conservez les produits PCR à 4 °C ou -20 °C pour un stockage à plus long terme.

11. Analyse des gels

1. Utilisez 1x tampon TAE pour préparer un gel qui contient 2% p / v d’agarose et 1x tache de gel.
2. Exécutez les produits PCR à 50 V et 300 mA pendant 1 h ou jusqu’à ce qu’il y ait une séparation de bande claire.
3. Imagez le gel à l’aide du programme d’exposition automatisé préchargé dans l’imageur de gel.

Résultats

En suivant les étapes décrites devrait donner un extrait nucléaire fonctionnel (Figure 1), un écart dans les étapes de broyage ou de lavage peut entraîner une mauvaise activité ou de faibles rendements. Si l’extrait nucléaire fonctionnel de C. elegans est obtenu, il transcrira la région en aval du promoteur du CMV sur le gabarit d’ADN lorsqu’il sera ajouté au test in vitro décrit précédemment. Le transcrit d’ARN résultant peut être purifié ...

Discussion

C. elegans est un organisme modèle attrayant pour étudier le système de transcription eucaryote en raison de son faible coût d’entretien et de la facilité de manipulation génétique. Ici, un protocole pour l’isolement cohérent de l’extrait nucléaire fonctionnellement actif de L4 C. elegans est décrit. Bien que ce protocole se soit concentré sur la visualisation de l’activité de transcription, l’ADNc produit post-transcriptionnellement peut être quantifié à l’aide de la RT-qPCR pour obtenir une mesure plu...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Consommables et réactifs
0,2 mL Tubes à 8 bandelettes & Bouchons à bande plate, transparent	Genesee Scientific	; 24-706
0,2 mL Tubes PCR individuels	Genesee Scientific	; 24-153G
Microtubes stériles de 1,7 mL	Genesee Scientific	24-282S
Éthanol de qualité moléculaire absolue à 100 %	Fisher Scientific	; BP2818
100 % éthanol, Koptec	Decon Labs	; Pipette sérologique V1001
10 mL	VWR international	; 89130-898
Plaques de Pétri 150 mm	Tritech Research	; T3325
Tubes à centrifuger coniques de 15 mL	Genesee Scientific	; 28-103
Seringues en plastique de 20 mL	Fisher Scientific	14955460
Seringues Norm-Ject de 2 mL	Henke-Sass Wolf GmbH	4020
Gobelet de filtre à vide de 500 mL 0,22 & micro ; Tubes	339652
	50 mL	ThermoFisher Scientific
		89130-902
Pipette sérologique 5 mL	VWR international	; 89130-896
Agar, Criterion	VWR International	; C7432
Agarose	Denville Scientific	; CA3510-6
Marqueur anti-alcool	VWR International	; 52877-310
Bacto peptone	VWR International	; 90000-264
Caenorhabditis elegans	CGC	N2
Dichlorure de calcium	Millipore Sigma	; C4901
Cholestérol	Millipore Sigma	; C8667
Amorces de clonage de temple d’ADN de contrôle, Forward 5'- ctc atg ttt gac agc tta tcg atc cgg gc -3'
Contrôle ADN temple clonage amorces, Forward 5'- aca gga cgg gtg tgg tcg cca tga t -3'
Eau
Dithiothreitol	Invitrogen	; 15508-013
Coloration au gel d’ADN, sans danger pour SYBR	Invitrogen	; S33102
Mélange d’échelle d’ADN, O' règle du gène	Fisher Scientific	; SM1173
Colorant de chargement d’ADN, 6x TriTrack	Fisher Scientific	;
DNase, Baseline-ZERO	Lucigen	;
Glace
Escherichia coli Souche OP50	CGC	OP50
Acide acétique glacial	Fisher Scientific	; A38
Glycérol	Millipore Sigma	; G6279
Système de transcription in vitro d’extrait nucléaire HeLaScribe, HeLaScribe	Promega	; E3110
Hepes Solution, 1 M Gibco	Millipore Sigma	15630080
Acide chlorhydrique 37 %	Millipore Sigma	; P0662
Eau de Javel à l’hypochlorite	Clorox
LB Bouillon	Millipore Sigma	; L3022
Dichlorure de magnésium	Millipore Sigma	; M8266
Sulfate de magnésium	Millipore Sigma	; M7506
Plats de poids moyen	Fisher Scientific	; 02-202-101
lames de microscope, Vista vision	VWR International	16004-368
eau de qualité moléculaire, Hypure	Hyclone Laboratories	;
Nystatine	Millipore Sigma	; Système PCR N1638
, FailSafe avec prémélange A	Lucigen	;
Chlorure de potassium	Millipore Sigma	; P39111
Phosphate de potassium dibasique	Millipore Sigma	; P3786
Phosphate de potassium monobasique	Millipore Sigma	; P0662
Inhibiteur de protéase, Halt cocktail à usage unique 100x	ThermoFisher Scientific	78430
kit de dosage de protéines, Qubit	ThermoFisher Scientific	; Q33211
kit de transcription inverse, Sensiscript	Qiagen	205211
kit d’extraction d’ARN RNeasy micro kit	Qiagen	74004
Inhibiteur de RNase	Applied Biosystems	;
chlorure de sodium	VWR International	; BDH9286-12KG
Hydroxyde de sodium	Millipore Sigma	; 1-09137
Filtre à seringue stérile avec 0,2 & micro ; m Membrane polyéthersulfone	VWR international	28145-501
Sucrose	VWR International	; 200-334-9
amorces de transcription, Forward 5'- gcc ggg cct ctt gcg gga tat -3'
amorces de transcription, Reverse 5'- cgg cca aag cgg tcg gac agt-3'
Tris-Base	Fisher Scientific	; BP152
Tween20	Millipore Sigma	; P2287
Équipement
-20 ° ; C incubateur	ThermoFisher Scientific
20 ° ; C incubateur	ThermoFisher Scientific
37 ° ; C incubateur	Forma Scientific
4 ° ; C réfrigérateur	ThermoFisher Scientific-80
° ; C Congélateur	Eppendorf
Autoclave	Sanyo
Balch Homogénéisateur de cellules, Isobiotec
paillasses Vortexer	Fisher Scientific	2215365
Centrifugeuse, Eppendorf 5418 R	Eppendorf	5401000013
Centrifugeuse, VWR Clinical 50	VWR International	82013-800
Microscope de dissection, Leica M80	Leica Microsystems
, Qubit 2.0	Invitrogen	Q32866
Système d’imagerie gel, iBright FL1500	ThermoFisher Scientific	; A44241
Système de gel	ThermoFisher Scientific
Bloc thermique	VWR International	12621-048
Microcentrifugeuses, Eppendorf 5424	Eppendorf	22620401
PIPETBOY acu 2	Integra	155017
Pipette L-1000 XLS+, Pipet-Lite LTS	Rainin	17014382
Pipette L-10 XLS+, Pipette Pipet-Lite LTS	Rainin	17014388
L-200 XLS+, Pipette Pipet-Lite LTS	Rainin	17014391
L-20 XLS+, Pipet-Lite LTS	Rainin	17014392
Plate-forme basculante	VWR International
Thermocycler, Eppendorf Mastercycler Pro	Eppendorf	950030010