Isolement de l’extrait nucléaire actif de Caenorhabditis elegans et reconstitution pour la transcription in vitro

Phillip Wibisono; Jingru Sun

doi:10.3791/62723

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Article de méthode

Isolement de l’extrait nucléaire actif de Caenorhabditis elegans et reconstitution pour la transcription in vitro

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DOI :

10.3791/62723

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11 août 2021

Phillip Wibisono¹ , Jingru Sun¹

¹Department of Translational Medicine and Physiology, Elson S. Floyd College of Medicine, Washington State University

Dans cet article

Résumé

Nous décrivons ici un protocole détaillé pour isoler l’extrait nucléaire actif de C. elegans au stade larvaire 4 et visualiser l’activité de transcription dans un système in vitro .

Résumé

Caenorhabditis elegans est un système modèle important pour la recherche biologique depuis son introduction en 1963. Cependant, C. elegans n’a pas été pleinement utilisé dans l’étude biochimique des réactions biologiques utilisant ses extraits nucléaires tels que la transcription in vitro et la réplication de l’ADN. Un obstacle important à l’utilisation de C. elegans dans les études biochimiques est de perturber l’épaisse cuticule externe du nématode sans sacrifier l’activité de l’extrait nucléaire. Bien que plusieurs méthodes soient utilisées pour casser la cuticule, telles que l’homogénéisation ou la sonication de Dounce, elles conduisent souvent à une instabilité des protéines. Il n’existe pas de protocole établi pour isoler les protéines nucléaires actives de la larve ou de C. elegans adulte pour les réactions in vitro . Ici, le protocole décrit en détail l’homogénéisation de C. elegans larvaire de stade 4 à l’aide d’un homogénéisateur Balch. L’homogénéisateur Balch utilise la pression pour forcer lentement les animaux à traverser un espace étroit brisant la cuticule dans le processus. La conception uniforme et l’usinage précis de l’homogénéisateur Balch permettent un meulage cohérent des animaux entre les expériences. Le fractionnement de l’homogénat obtenu à partir de l’homogénéisateur Balch donne un extrait nucléaire fonctionnellement actif qui peut être utilisé dans une méthode in vitro pour tester l’activité de transcription de C. elegans.

Introduction

Le petit nématode libre Caenorhabditis elegans est un organisme modèle simple mais puissant pour répondre à un large éventail de questions biologiques. Depuis son introduction en 1963, les nématodes ont été inestimables pour répondre aux questions de neurobiologie, de métabolisme, de vieillissement, de développement, d’immunité et de ^génétique1. Certaines des nombreuses caractéristiques de l’animal qui en font un organisme modèle idéal comprennent le temps de génération court, l’efficacité de l’interférence ARN, le corps transparent et les cartes complètes de sa lignée cellulaire et de son système nerveux.

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