Mesure du pH, de la chimie redox et de la capacité dégradative des macropinosomes à l’aide de la microscopie ratiométrique à double fluorophore

Liam Wilkinson; Johnathan Canton

doi:10.3791/62733

Article de méthode

Mesure du pH, de la chimie redox et de la capacité dégradative des macropinosomes à l’aide de la microscopie ratiométrique à double fluorophore

1.8K vues

⸱

DOI :

10.3791/62733

⸱

19 août 2021

Liam Wilkinson¹^,² , Johnathan Canton²^,³

¹Department of Biochemistry & Microbiology, Faculty of Science, University of Victoria, ²Department of Comparative Biology and Experimental Medicine, Faculty of Veterinary Science, University of Calgary, ³Calvin, Joan and Phoebe Snyder Institute for Chronic Diseases, University of Calgary

Dans cet article

Résumé

Nous décrivons des protocoles pour mesurer le pH, les événements oxydatifs et la digestion des protéines dans les macropinosomes individuels dans les cellules vivantes. L’accent est mis sur la microscopie ratiométrique à double fluorophore et les avantages qu’elle offre par rapport aux techniques basées sur la population.

Résumé

Ces dernières années, le domaine de la macropinocytose s’est développé rapidement. La macropinocytose est apparue comme un mécanisme central par lequel les cellules immunitaires innées maintiennent l’homéostasie et l’immunité de l’organisme. Simultanément, et contrairement à son rôle homéostatique, il peut également conduire à diverses pathologies, y compris le cancer et les infections virales. Contrairement à d’autres modes d’endocytose, les outils développés pour étudier la maturation des macropinosomes restent sous-développés. Ici, le protocole décrit des outils nouvellement développés pour étudier l’environnement redox dans la lumière des macropinosomes précoces et en cours de maturation. Les méthodologies d’utilisation de la microscopie à fluorescence ratiométrique pour évaluer le pH, la production d’espèces réactives de l’oxygène et la capacité de dégradation dans la lumière des macropinosomes individuels dans les cellules vivantes sont décrites. Les mesures d’organites uniques offrent l’avantage de révéler l’hétérogénéité spatio-temporelle, qui est souvent perdue avec les approches basées sur la population. L’accent est mis sur les principes de base de la microscopie ratiométrique à double fluorophore, y compris la sélection des sondes, l’instrumentation, l’étalonnage et les méthodes unicellulaires par rapport aux méthodes basées sur la population.

Introduction

La macropinocytose fait référence à l’absorption de grandes quantités de liquide extracellulaire dans des organites cytoplasmiques liés à la membrane appelés macropinosomes¹^,². C’est un processus hautement conservé effectué par des organismes unicellulaires libres, tels que l’amibe Dictyostelium spp. ³, ainsi que les anthozoaires⁴ et les métazoaires². Dans la plupart des cellules, la macropinocytose est un événement induit. La ligature des récepteurs de la surface cellulaire induit la saillie d’extensions de membrane plasmique ent....