Extraction du cofacteur _F420 pour l’analyse de la longueur de la queue du polyglutamate à partir de cultures pures méthanogènes et d’échantillons environnementaux

_F420 est un cofacteur répandu mais souvent négligé, qui fonctionne comme un transporteur d’hydrure à deux électrons obligatoire dans les processus métaboliques primaires et secondaires des archées et des bactéries1,2. _F420 est une 5-déazaflavine et structurellement similaire aux flavines, ses propriétés chimiques et biologiques étant plus comparables à celles du NAD⁺ ou du NADP⁺. En raison de la substitution de l’azote par du carbone à la position 5 du cycle isoalloxazine, il s’agit d’un puissant réducteur, présentant ainsi un faible potentiel redox standard de -340 ^mV1,3. _F420 comprend un cycle de 5-déazaflavine et un liant 2-phospho-L-lactate (_F420-0). Une queue d’oligoglutamate contenant n+1 monomères de glutamate peut être attachée à la molécule (_F420-n+1)⁴.

Pendant longtemps, le cofacteur _F420 a été uniquement associé aux archées et aux actinobactéries. Cela a été largement renversé. Des analyses récentes ont révélé que le _F420 est réparti entre divers organismes anaérobies et aérobies des phyla Proteobacteria, Chloroflexi, et potentiellement Firmicutes habitant une myriade d’habitats comme les sols, les lacs et l’intestin ^humain1,5. En 2019, Braga et ^al.6, ont montré que la protéobactérie Paraburkholderia rhizoxinica produit un dérivé unique de _F420, contenant un 3-phosphoglycérate au lieu d’une queue de 2-phospholactate, qui pourrait être répandu dans divers habitats. Dans le domaine Archaea, _F420 a été trouvé dans plusieurs lignées, y compris methanogenic7, methanotrophic8,9 et sulfate-reducing ^orders10, et est censé être produit dans Thaumarchaeota11. _F420 est surtout connu comme une coenzyme redox essentielle dans la méthanogenèse hydrogénotrophe et méthylotrophique. La forme réduite de _F420 (_F420H2) fonctionne comme un donneur d’électrons pour la réduction de la méthylènetétrahydrométhanoptérine (méthylène-H4MPT, Mer) et du méthényl-H4MPT12,13. Il peut également être utilisé comme transporteur d’électrons dans les voies de transport d’électrons indépendantes de _H2 de méthanogènes contenant des ^{cytochromes12,14}. De plus, la forme oxydée de _F420 a une fluorescence bleu-vert caractéristique lors de l’excitation à 420 nm, ce qui facilite la détection microscopique des méthanogènes (Figure 1). En raison de son faible potentiel redox, _F420 facilite (i) la réduction exogène d’un large spectre de composés organiques autrement récalcitrants ou toxiques, (ii) la synthèse d’antibiotiques tétracycline et de lincosamide ou de phytotoxines chez les streptomycètes (phylum Actinobacteria), et (iii) la résistance au stress oxydatif ou nitrosatif ou à d’autres conditions défavorables chez les mycobactéries (phylum Actinobacteria)^1,5,15, 16,17,18,19,20,21,22. Par conséquent, les oxydoréductases dépendantes de la _F420 sont des biocatalyseurs prometteurs à des fins industrielles et pharmaceutiques ainsi que pour la bioremédiation des environnements ^{contaminés1,23}. Malgré ces découvertes récentes, les rôles exacts du cofacteur _F420 sont encore marginalement connus chez les Actinobactéries ou d’autres phyla bactériens.

Il existe au moins trois voies pour la biosynthèse _F4202,6,24. Au début, la voie de biosynthèse est divisée en une biosynthèse de la 5-déazaflavine et une branche du métabolisme du 2-phospholactate. La partie réactive de la molécule _F420 est synthétisée via la _FO-synthase en utilisant les substrats tyrosine et 5-amino-6-ribitylamino-2,4(1H, 3H)-pyrimidinedione. Le résultat est le niveau de riboflavine chromophore _FO. Dans la branche du métabolisme du lactate actuellement acceptée, le L-lactate est phosphorylé en 2-phospho-L-lactate par une L-lactate kinase (CofB); Le 2-phospho-L-lactate, à son tour, est guanylé en L-lactyl-2-diphospho-5'-guanosine par la 2-phospho-L-lactate guanylyltransférase (CofC). Dans l’étape suivante, la L-lactyl-2-diphospho-5'-guanosine est liée à la _FO par une 2-phospho-L-lactate transférase (CofD) pour former _F420-02. Enfin, l’enzyme _F420-0:ɣ-glutamyl ligase (CofE) ligate les monomères du glutamate en _F420-0, formant le cofacteur ^final6 en nombre ^{variable23,25}. Différents organismes présentent des modèles différents dans le nombre de résidus de glutamate attachés, avec des queues plus courtes trouvées pour les méthanogènes que dans les mycobactéries2,25,26. Généralement, les méthanogènes montrent des longueurs de queue de deux à trois, avec jusqu’à cinq dans le méthanogène acétoclastique, Methanosarcina sp., tandis que les longueurs de queue trouvées dans Mycobacterium sp. variaient de cinq à sept résidus de glutamate2,25,26,27. Cependant, des résultats récents ont montré que la _F420 à longue chaîne se lie aux oxydoréductases dépendantes de la _F420 avec une affinité plus élevée que la _F420 à chaîne courte; de plus, la _F420 à longue chaîne liée augmente l’affinité du substrat mais diminue le taux de renouvellement des enzymes ^{respectives23}.

La détection du cofacteur _F420 est souvent basée sur sa fluorescence. Ainsi, ses dérivés oligo-glutamate ont été séparés à l’aide de la phase inversée (RP)-^HPLC27,28. Récemment, Ney et al. ont utilisé l’hydroxyde de tétrabutylammonium comme réactif d’appariement d’ions pour la queue de glutamate chargée négativement afin d’améliorer la séparation sur RP-HLPC avec ^succès5. Nous présentons ici une méthode pour la préparation d’échantillons, la lyse ultérieure, l’extraction, la purification, la séparation et la quantification du cofacteur _F420 non seulement à partir de cultures pures, mais également à partir de différents échantillons environnementaux (sols et boues de digesteur).

REMARQUE: L’extraction et l’analyse du cofacteur _F420 est un processus en trois étapes comprenant la lyse de l’échantillon, la pré-purification du cofacteur via l’extraction en phase solide (SPE) et la détection des cofacteurs via IP-RP-HPLC (IP-RP-HPLC) avec détection de fluorescence. Avant de commencer, préparez les matériaux et les réactifs comme indiqué dans le tableau 1.

1. Lyse de l’échantillon

1. Ajouter jusqu’à 5 g d’échantillon aux tubes appropriés (p. ex., tubes coniques de 50 mL).
2. Ajouter 5 mL du tampon de lyse (2x solution mère, tableau 1) aux échantillons.
3. Porter à un volume final de 10 mL avec de l’eau distillée pour atteindre une concentration finale de 0,5 g·^mL-1.
4. Vortex les échantillons dilués pendant 20 s.
5. Autoclave pendant 30 min à 121 °C.
6. Pour les échantillons secs comme le sol forestier, porter à un volume final de 20 mL avec de l’eau distillée après autoclavage et vortex l’échantillon dilué.
   ATTENTION : L’augmentation de la température pendant l’autoclavage peut provoquer l’éclatement des tubes.

2. Pré-purification du cofacteur F ₄₂₀ par extraction en phase solide (SPE)

REMARQUE: Toutes les étapes de SPE sont effectuées à température ambiante

1. Refroidir les échantillons à la température ambiante.
2. Centrifuger les échantillons autoclavés pendant 5 min à 11 000 x g.
3. Préparer des colonnes SPE de 5 mL remplies de 100 mg de sorbant polymère à anions faibles en mode mixte.
4. Conditionner l’échangeur d’anions avec 3 mL de méthanol (solution conditionnelle, tableau 1).
5. Équilibrer l’échangeur d’anions avec 3 mL d’eau distillée (solution d’équilibration, tableau 1).
6. Chargez jusqu’à 9,0 mL du surnageant du lysat centrifugé sur la colonne SPE.
7. Laver les impuretés avec 5 mL d’acétate d’ammonium de 25 mM (solution de lavage SPE 1, tableau 1).
8. Laver les impuretés avec 5 mL de méthanol (solution de lavage SPE 2, tableau 1).
9. Éluez le cofacteur _F420 dans 1,0 mL de tampon d’élution (tableau 1).
   REMARQUE: Préparez un tampon d’élution frais. En raison du vide appliqué et de la pression de vapeur élevée du tampon d’élution, les volumes d’élution peuvent différer d’un échantillon à l’autre. Afin de garantir le même volume final dans tous les échantillons, il est recommandé de peser les récipients de collecte avant et après l’élution et de calculer le volume d’élution effectif. Équilibrez les différences par l’ajout d’un tampon d’élution.

3. Détection du cofacteur _F420

1. Réglez le four à 40 °C et le détecteur de fluorescence à 420 nm de longueur d’onde d’extinction et à 470 nm de longueur d’onde d’émission. Réaliser la séparation via le mode gradient en utilisant les phases mobiles A et B (Tableau 1): 0-3 min: 26% B; 3-24 min: 26%-50% B; 24-25 min: 50% B; 25-27 min: 50%-26% B; 27-35 min: 26% B à un débit de 0,75 mL·^min-1.
   REMARQUE : Garantir l’équilibrage des conditions de la colonne avant l’injection des échantillons en rinçant la colonne au moins avec 3 volumes de colonne de 74 % de phase mobile A et de 26 % de phase B mobile (tableau 1).
   1. Filtrer les échantillons élués du SPE dans des flacons HPLC à l’aide d’un filtre PTFE d’une taille de pores de 0,22 μm.
      REMARQUE: Les filtres en PTFE avec une taille de pore de 0,22 μm sont recommandés.
   2. Injecter 50 μL de l’échantillon élué sur le système HPLC pour analyser la composition et la concentration du cofacteur _F420 .
      REMARQUE: Comme aucune norme quantitative n’est utilisée dans ce protocole, les échantillons et les variantes doivent être comparés par zone de crête.

Des cultures pures de Methanosarcina thermophila et de Methanoculleus thermophilus, deux archées méthanogènes thermophiles, ont été cultivées dans des milieux appropriés comme décrit précédemment29,30. Pour Methanosarcina thermophila, le méthanol a été utilisé comme source d’énergie, tandis que Methanoculleus thermophilus a été cultivé sur H2/CO2. La croissance a été vérifiée par une évaluation microscopique, tandis que l’activité a été examinée par mesure du méthane (CH4) par chromatographie en phase gazeuse comme décrit précédemment31. Des cultures pures ont été utilisées pour l’extraction du cofacteur F420 selon le protocole présenté. En outre, des échantillons environnementaux comprenant des échantillons provenant de boues de réacteurs au biogaz mésophiles (station d’épuration des eaux usées, Zirl, Autriche; pour plus de détails sur les paramètres des boues, veuillez vous référer à32), une prairie utilisée à des fins agricoles (Innsbruck, Autriche) et des sols forestiers (Lans, Autriche) ont été prélevés à l’automne 2020 pour l’extraction et l’analyse du cofacteur F420.

La croissance des cultures pures a été vérifiée par microscopie (Figure 1), le CH4 produit étant analysé par chromatographie en phase gazeuse pendant 14 jours d’incubation (données non présentées). L’efficacité de l’extraction du cofacteur F420 à partir de cultures pures a été testée en appliquant différentes stratégies de désintégration: battement à l’aide de battements céramiques de 0,5 à 1,0 mm, traitement par ultrasons et désintégration pression-température à l’aide d’une pression de 121 ° C et 1,2 bar (autoclavage). L’efficacité maximale de l’extraction est devenue apparente en utilisant un traitement pression-température en appliquant un tampon tel que décrit dans la section du protocole et a donc été appliquée pour toutes les expériences ultérieures (figure 2). Les tests d’efficacité d’extraction ont été effectués par addition standard de différents volumes d’une culture de Methanoculleus thermophilus en bonne croissance. En outre, la comparaison de différents échantillons et variantes était basée sur la zone de crête des chromatogrammes.

Par la suite, les extraits cellulaires ont été soumis à une procédure d’extraction en phase solide (SPE). À cette fin, différents échangeurs d’ions ont été testés. Il s’est avéré qu’un sorbant polymère à mode mixte d’anion faible produisait la plus grande quantité de cofacteur F420 après l’élution. En outre, différents tampons d’élution et solutions de lavage ont été testés et ont montré les meilleurs résultats pour l’acétate d’ammonium de 25 mM comme tampon de lavage et un mélange de NH3 dans le méthanol comme tampon d’élution. Le méthanol de l’étape d’élution pourrait être échangé après l’élution avec de l’eau via un traitement sous vide-température.

L’analyse HPLC du cofacteur F420 a été testée avec différentes colonnes C18 avec les meilleurs résultats pour la configuration du système obtenus au cours de l’étude présentée avec une colonne NX C18. Une norme contenant une distribution connue de dérivés de F420 avec une longueur de queue de glutamate variable a été utilisée à des fins de référence. Cette norme a été aimablement fournie par le professeur Colin Jackson de l’Université nationale australienne. L’analyse de la longueur de la queue du glutamate a révélé des différences dans la concentration globale du cofacteur F420 et la distribution de la longueur de la queue F420 des cultures pures méthanogènes et des échantillons environnementaux (figure 3).

Tableau 1 : Composition tampon et phase mobile pour l’extraction en phase solide (SPE) et l’analyse HPLC. 

Figure 1 : Culture pure méthanogène fluorescente. Visualisation de Methanosarcina thermophila par microscopie à contraste de phase (A) et par microscopie à fluorescence (B) lorsque le cofacteur F420 est excité par la lumière UV (excitation à 395-440 nm et émission à 475-495 nm). Barre d’échelle : 10 μm. Veuillez cliquer ici pour afficher une version agrandie de cette figure.

Figure 2 : Ajout standard. Zone de crête du cofacteur F420 récupéré après SPE à partir de 1,0 g de matrice enrichie avec différents volumes de cultures de M. thermophilus. La matrice a été modifiée avec 0 μL, 250 μL, 500 μL, 750 μL et 1000 μL de culture et soumise à différentes stratégies de désintégration: battement, traitement par ultrasons et désintégration pression-température (autoclavage). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 3 : Distribution de la longueur de la queue du glutamate. Distribution de la longueur de la queue du cofacteur F420 des cultures pures et des échantillons environnementaux. De haut en bas : prairie (sol), forêt (sol), réacteur mésophile au biogaz, culture pure de M. thermophilus et culture pure de M. thermophila. L’absorbance relative a été calculée par normalisation sur le pic le plus élevé du chromatogramme montré. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Les auteurs n’ont rien à divulguer.