Article de méthode

Extraction du cofacteur F420 pour l’analyse de la longueur de la queue du polyglutamate à partir de cultures pures méthanogènes et d’échantillons environnementaux

DOI :

10.3791/62737

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14 octobre 2021

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1Department of Microbiology, Universität Innsbruck, 2Department of Hygiene and Medical Microbiology, Medical University of Innsbruck

Dans cet article

Résumé

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Une méthode d’extraction du cofacteur F420 à partir de cultures pures a été optimisée pour la séparation chromatographique liquide et l’analyse de la longueur de la queue F420 dans des échantillons de culture pure et d’environnement.

Résumé

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Le cofacteur F420 joue un rôle central en tant que porteur d’hydrure dans le métabolisme primaire et secondaire de nombreux taxons bactériens et archéaux. Le cofacteur est surtout connu pour son rôle dans la méthanogenèse, où il facilite les réactions thermodynamiquement difficiles. Comme la longueur de la queue de polyglutamate varie d’un organisme à l’autre, les analyses de profil de longueur pourraient être un outil puissant pour distinguer et caractériser différents groupes et voies dans divers habitats. Ici, le protocole décrit l’extraction et l’optimisation de la détection du cofacteur F420 en appliquant l’extraction en phase solide combinée à une analyse par chromatographie liquide à haute performance indépendante des approches culturelles ou biologiques moléculaires. La méthode a été appliquée pour obtenir des informations supplémentaires sur l’expression du cofacteur F420 à partir de communautés microbiennes dans les sols, les boues anaérobies et les cultures pures et a été évaluée par des expériences de pic. Ainsi, l’étude a réussi à générer différents profils de longueur de queue F420 pour les méthanogènes hydrogénotrophes et acétoclastiques dans des cultures pures méthanogènes contrôlées ainsi qu’à partir d’échantillons environnementaux tels que les boues et les sols de digesteurs anaérobies.

Introduction

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F420 est un cofacteur répandu mais souvent négligé, qui fonctionne comme un transporteur d’hydrure à deux électrons obligatoire dans les processus métaboliques primaires et secondaires des archées et des bactéries1,2. F420 est une 5-déazaflavine et structurellement similaire aux flavines, ses propriétés chimiques et biologiques étant plus comparables à celles du NAD+ ou du NADP+. En raison de la substitution de l’azote par du carbone à la position 5 du cycle isoalloxazine, il s’agit d’un puissant réducteur, présentant ainsi un faible potentiel redox standard de -340 mV1,3. F420 comprend un cycle de 5-déazaflavine et un liant 2-phospho-L-lactate (F420-0). Une queue d’oligoglutamate contenant n+1 monomères de glutamate peut être attachée à la molécule (F420-n+1)4.

Pendant longtemps, le cofacteur F420 a été uniquement associé aux archées et aux actinobactéries. Cela a été largement renversé. Des analyses récentes ont révélé que le F420 est réparti entre divers organismes anaérobies et aérobies des phyla Proteobacteria, Chloroflexi, et potentiellement Firmicutes habitant une myriade d’habitats comme les sols, les lacs et l’intestin humain1,5. En 2019, Braga et al.6, ont montré que la protéobactérie Paraburkholderia rhizoxinica produit un dérivé unique de F420, contenant un 3-phosphoglycérate au lieu d’une queue de 2-phospholactate, qui pourrait être répandu dans divers habitats. Dans le domaine Archaea, F420 a été trouvé dans plusieurs lignées, y compris methanogenic7, methanotrophic8,9 et sulfate-reducing orders10, et est censé être produit dans Thaumarchaeota11. F420 est surtout connu comme une coenzyme redox essentielle dans la méthanogenèse hydrogénotrophe et méthylotrophique. La forme réduite de F420 (F420H2) fonctionne comme un donneur d’électrons pour la réduction de la méthylènetétrahydrométhanoptérine (méthylène-H4MPT, Mer) et du méthényl-H4MPT12,13. Il peut également être utilisé comme transporteur d’électrons dans les voies de transport d’électrons indépendantes de H2 de méthanogènes contenant des cytochromes12,14. De plus, la forme oxydée de F420 a une fluorescence bleu-vert caractéristique lors de l’excitation à 420 nm, ce qui facilite la détection microscopique des méthanogènes (Figure 1). En raison de son faible potentiel redox, F420 facilite (i) la réduction exogène d’un large spectre de composés organiques autrement récalcitrants ou toxiques, (ii) la synthèse d’antibiotiques tétracycline et de lincosamide ou de phytotoxines chez les streptomycètes (phylum Actinobacteria), et (iii) la résistance au stress oxydatif ou nitrosatif ou à d’autres conditions défavorables chez les mycobactéries (phylum Actinobacteria)1,5,15, 16,17,18,19,20,21,22. Par conséquent, les oxydoréductases dépendantes de la F420 sont des biocatalyseurs prometteurs à des fins industrielles et pharmaceutiques ainsi que pour la bioremédiation des environnements contaminés1,23. Malgré ces découvertes récentes, les rôles exacts du cofacteur F420 sont encore marginalement connus chez les Actinobactéries ou d’autres phyla bactériens.

Il existe au moins trois voies pour la biosynthèse F4202,6,24. Au début, la voie de biosynthèse est divisée en une biosynthèse de la 5-déazaflavine et une branche du métabolisme du 2-phospholactate. La partie réactive de la molécule F420 est synthétisée via la FO-synthase en utilisant les substrats tyrosine et 5-amino-6-ribitylamino-2,4(1H, 3H)-pyrimidinedione. Le résultat est le niveau de riboflavine chromophore FO. Dans la branche du métabolisme du lactate actuellement acceptée, le L-lactate est phosphorylé en 2-phospho-L-lactate par une L-lactate kinase (CofB); Le 2-phospho-L-lactate, à son tour, est guanylé en L-lactyl-2-diphospho-5'-guanosine par la 2-phospho-L-lactate guanylyltransférase (CofC). Dans l’étape suivante, la L-lactyl-2-diphospho-5'-guanosine est liée à la FO par une 2-phospho-L-lactate transférase (CofD) pour former F420-02. Enfin, l’enzyme F420-0:ɣ-glutamyl ligase (CofE) ligate les monomères du glutamate en F420-0, formant le cofacteur final6 en nombre variable23,25. Différents organismes présentent des modèles différents dans le nombre de résidus de glutamate attachés, avec des queues plus courtes trouvées pour les méthanogènes que dans les mycobactéries2,25,26. Généralement, les méthanogènes montrent des longueurs de queue de deux à trois, avec jusqu’à cinq dans le méthanogène acétoclastique, Methanosarcina sp., tandis que les longueurs de queue trouvées dans Mycobacterium sp. variaient de cinq à sept résidus de glutamate2,25,26,27. Cependant, des résultats récents ont montré que la F420 à longue chaîne se lie aux oxydoréductases dépendantes de la F420 avec une affinité plus élevée que la F420 à chaîne courte; de plus, la F420 à longue chaîne liée augmente l’affinité du substrat mais diminue le taux de renouvellement des enzymes respectives23.

La détection du cofacteur F420 est souvent basée sur sa fluorescence. Ainsi, ses dérivés oligo-glutamate ont été séparés à l’aide de la phase inversée (RP)-HPLC27,28. Récemment, Ney et al. ont utilisé l’hydroxyde de tétrabutylammonium comme réactif d’appariement d’ions pour la queue de glutamate chargée négativement afin d’améliorer la séparation sur RP-HLPC avec succès5. Nous présentons ici une méthode pour la préparation d’échantillons, la lyse ultérieure, l’extraction, la purification, la séparation et la quantification du cofacteur F420 non seulement à partir de cultures pures, mais également à partir de différents échantillons environnementaux (sols et boues de digesteur).

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Protocole

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REMARQUE: L’extraction et l’analyse du cofacteur F420 est un processus en trois étapes comprenant la lyse de l’échantillon, la pré-purification du cofacteur via l’extraction en phase solide (SPE) et la détection des cofacteurs via IP-RP-HPLC (IP-RP-HPLC) avec détection de fluorescence. Avant de commencer, préparez les matériaux et les réactifs comme indiqué dans le tableau 1.

1. Lyse de l’échantillon

  1. Ajouter jusqu’à 5 g d’échantillon aux tubes appropriés (p. ex., tubes coniques de 50 mL).
  2. Ajouter 5 mL du tampon de lyse (2x solution mère, tableau 1) aux échantillons.
  3. Porter à un volume final de 10 mL avec de l’eau distillée pour atteindre une concentration finale de 0,5 g·mL-1.
  4. Vortex les échantillons dilués pendant 20 s.
  5. Autoclave pendant 30 min à 121 °C.
  6. Pour les échantillons secs comme le sol forestier, porter à un volume final de 20 mL avec de l’eau distillée après autoclavage et vortex l’échantillon dilué.
    ATTENTION : L’augmentation de la température pendant l’autoclavage peut provoquer l’éclatement des tubes.

2. Pré-purification du cofacteur F 420 par extraction en phase solide (SPE)

REMARQUE: Toutes les étapes de SPE sont effectuées à température ambiante

  1. Refroidir les échantillons à la température ambiante.
  2. Centrifuger les échantillons autoclavés pendant 5 min à 11 000 x g.
  3. Préparer des colonnes SPE de 5 mL remplies de 100 mg de sorbant polymère à anions faibles en mode mixte.
  4. Conditionner l’échangeur d’anions avec 3 mL de méthanol (solution conditionnelle, tableau 1).
  5. Équilibrer l’échangeur d’anions avec 3 mL d’eau distillée (solution d’équilibration, tableau 1).
  6. Chargez jusqu’à 9,0 mL du surnageant du lysat centrifugé sur la colonne SPE.
  7. Laver les impuretés avec 5 mL d’acétate d’ammonium de 25 mM (solution de lavage SPE 1, tableau 1).
  8. Laver les impuretés avec 5 mL de méthanol (solution de lavage SPE 2, tableau 1).
  9. Éluez le cofacteur F420 dans 1,0 mL de tampon d’élution (tableau 1).
    REMARQUE: Préparez un tampon d’élution frais. En raison du vide appliqué et de la pression de vapeur élevée du tampon d’élution, les volumes d’élution peuvent différer d’un échantillon à l’autre. Afin de garantir le même volume final dans tous les échantillons, il est recommandé de peser les récipients de collecte avant et après l’élution et de calculer le volume d’élution effectif. Équilibrez les différences par l’ajout d’un tampon d’élution.

3. Détection du cofacteur F420

  1. Réglez le four à 40 °C et le détecteur de fluorescence à 420 nm de longueur d’onde d’extinction et à 470 nm de longueur d’onde d’émission. Réaliser la séparation via le mode gradient en utilisant les phases mobiles A et B (Tableau 1): 0-3 min: 26% B; 3-24 min: 26%-50% B; 24-25 min: 50% B; 25-27 min: 50%-26% B; 27-35 min: 26% B à un débit de 0,75 mL·min-1.
    REMARQUE : Garantir l’équilibrage des conditions de la colonne avant l’injection des échantillons en rinçant la colonne au moins avec 3 volumes de colonne de 74 % de phase mobile A et de 26 % de phase B mobile (tableau 1).
    1. Filtrer les échantillons élués du SPE dans des flacons HPLC à l’aide d’un filtre PTFE d’une taille de pores de 0,22 μm.
      REMARQUE: Les filtres en PTFE avec une taille de pore de 0,22 μm sont recommandés.
    2. Injecter 50 μL de l’échantillon élué sur le système HPLC pour analyser la composition et la concentration du cofacteur F420 .
      REMARQUE: Comme aucune norme quantitative n’est utilisée dans ce protocole, les échantillons et les variantes doivent être comparés par zone de crête.

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Résultats

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Des cultures pures de Methanosarcina thermophila et de Methanoculleus thermophilus, deux archées méthanogènes thermophiles, ont été cultivées dans des milieux appropriés comme décrit précédemment29,30. Pour Methanosarcina thermophila, le méthanol a été utilisé comme source d’énergie, tandis que Methanoculleus thermophilus a été cultivé sur H2/CO2. La croissance a été vérifiée par une évaluation mi...

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Discussion

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Pour l’évaluation du cofacteur F420 à partir de cultures pures méthanogènes, une évaluation microscopique peut être effectuée pour visualiser la croissance et l’activité (microscopie à fluorescence) des micro-organismes impliqués (Figure 1). Pour les échantillons provenant d’environnements naturels, l’utilisation de la microscopie pour détecter ou quantifier F420 est limitée en raison des interférences avec d’autres micro-organismes fluorescents, des particules organiqu...

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Déclarations de divulgation

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Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

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Nous remercions chaleureusement le professeur Colin Jackson pour son soutien avec le cofacteur purifié F420. Cette recherche a été soutenue par le Fonds tyrolien pour la science (TWF) et l’Universität Innsbruck (Publikationsfonds). Nous reconnaissons grandement le soutien de GPS, HK, SB, GG et HB.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Autoclave
Système HPLC biocompatible équipé d’un module de gradient, d’un four et d’un détecteur de fluorescenceSystème HPLCShimadzu
Centrifugeuse et rotor pour 50 mL " Faucon" tubes (11.000 rcf) et tubes
Colonne HPLC : Gemini NX C18, 5 &mu ; m, 150 x 3 mmPhenomenexHPLC
PTFE (taille des pores 0,22 & micro ; m) pour éliminer les particules avant l’analyse
Résine pour SPE : Strata-X-AW 33 &mu ; m en tant qu’anion faible sorbant polymère en mode mixtePhenomenexsorbant polymère en mode mixte à anions faibles
Collecteur à vide pour SPE et tubesÉquipement SPE
Mélangeur
appropriés colonne HPLC de collecte appropriés vortex

Références

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Mots-clés

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