Extraction du cofacteur F420 pour l’analyse de la longueur de la queue du polyglutamate à partir de cultures pures méthanogènes et d’échantillons environnementaux

Résumé

Une méthode d’extraction du cofacteur _F420 à partir de cultures pures a été optimisée pour la séparation chromatographique liquide et l’analyse de la longueur de la queue _F420 dans des échantillons de culture pure et d’environnement.

Résumé

Le cofacteur _F420 joue un rôle central en tant que porteur d’hydrure dans le métabolisme primaire et secondaire de nombreux taxons bactériens et archéaux. Le cofacteur est surtout connu pour son rôle dans la méthanogenèse, où il facilite les réactions thermodynamiquement difficiles. Comme la longueur de la queue de polyglutamate varie d’un organisme à l’autre, les analyses de profil de longueur pourraient être un outil puissant pour distinguer et caractériser différents groupes et voies dans divers habitats. Ici, le protocole décrit l’extraction et l’optimisation de la détection du cofacteur _F420 en appliquant l’extraction en phase solide combinée à une analyse par chromatographie liquide à haute performance indépendante des approches culturelles ou biologiques moléculaires. La méthode a été appliquée pour obtenir des informations supplémentaires sur l’expression du cofacteur _F420 à partir de communautés microbiennes dans les sols, les boues anaérobies et les cultures pures et a été évaluée par des expériences de pic. Ainsi, l’étude a réussi à générer différents profils de longueur de queue _F420 pour les méthanogènes hydrogénotrophes et acétoclastiques dans des cultures pures méthanogènes contrôlées ainsi qu’à partir d’échantillons environnementaux tels que les boues et les sols de digesteurs anaérobies.

Introduction

_F420 est un cofacteur répandu mais souvent négligé, qui fonctionne comme un transporteur d’hydrure à deux électrons obligatoire dans les processus métaboliques primaires et secondaires des archées et des bactéries1,2. _F420 est une 5-déazaflavine et structurellement similaire aux flavines, ses propriétés chimiques et biologiques étant plus comparables à celles du NAD⁺ ou du NADP⁺. En raison de la substitution de l’azote par du carbone à la position 5 du cycle isoalloxazine, il s’agit d’un puissant réducteur, présentant ainsi un faible potentiel redox....

Protocole

REMARQUE: L’extraction et l’analyse du cofacteur _F420 est un processus en trois étapes comprenant la lyse de l’échantillon, la pré-purification du cofacteur via l’extraction en phase solide (SPE) et la détection des cofacteurs via IP-RP-HPLC (IP-RP-HPLC) avec détection de fluorescence. Avant de commencer, préparez les matériaux et les réactifs comme indiqué dans le tableau 1.

1. Lyse de l’échantillon

1. Ajouter jusqu’à 5 g d’échantillon aux tubes appropriés (p. ex., tubes coniques de 50 mL).
2. Ajouter 5 mL du tampon de lyse (2x solution mère, tableau 1) aux échantillons.
3. ....

Résultats

Des cultures pures de Methanosarcina thermophila et de Methanoculleus thermophilus, deux archées méthanogènes thermophiles, ont été cultivées dans des milieux appropriés comme décrit ^{précédemment29,30}. Pour Methanosarcina thermophila, le méthanol a été utilisé comme source d’énergie, tandis que Methanoculleus thermophilus a été cultivé sur _H2/_CO2. La croissance a été vérifiée par une évaluation mi.......

Discussion

Pour l’évaluation du cofacteur _F420 à partir de cultures pures méthanogènes, une évaluation microscopique peut être effectuée pour visualiser la croissance et l’activité (microscopie à fluorescence) des micro-organismes impliqués (Figure 1). Pour les échantillons provenant d’environnements naturels, l’utilisation de la microscopie pour détecter ou quantifier _F420 est limitée en raison des interférences avec d’autres micro-organismes fluorescents, des particules organiqu.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Autoclave
Système HPLC biocompatible équipé d’un module de gradient, d’un four et d’un détecteur de fluorescence	Système HPLC	Shimadzu
Centrifugeuse et rotor pour 50 mL " Faucon" tubes (11.000 rcf) et tubes
Colonne HPLC : Gemini NX C18, 5 &mu ; m, 150 x 3 mm	Phenomenex		HPLC
PTFE (taille des pores 0,22 & micro ; m) pour éliminer les particules avant l’analyse
Résine pour SPE : Strata-X-AW 33 &mu ; m en tant qu’anion faible sorbant polymère en mode mixte	Phenomenex		sorbant polymère en mode mixte à anions faibles
Collecteur à vide pour SPE et tubes			Équipement SPE
Mélangeur

appropriés colonne HPLC de collecte appropriés vortex