Développement d’une bande immunochromatographique à flux latéral pour la détection rapide et quantitative de composés de petites molécules

Les bandelettes immunochromatographiques à flux latéral (CSI) à base de membrane sont des outils utiles pour une détection rapide et à faible coût. La membrane de nitrocellulose en tant que support et l’or colloïdal en tant que marqueurs des réactifs de diagnostic rapide par chromatographie immunitaire sont la méthode POCT (point of care testing) la plus couramment utilisée, et la portée des tests du projet est plus large. Depuis leur application initiale dans la surveillance pendant la grossesse, leur utilisation a été étendue pour surveiller l’état de coagulation sanguine^1,2, les lésions myocardiques³, la médecine vétérinaire⁴, les résidus de pesticides⁵, les maladies infectieuses⁶ et les concentrations de médicaments. D’autres types d’échantillons peuvent être évalués, y compris l’urine, la salive, le sang total, le sérum et d’autres fluides corporels^7,8,9.

Au cours des dernières années, de nombreux nouveaux tests ont été développés pour détecter les biomarqueurs dans le diagnostic des troubles, y compris HPLC, UPLC, LC-MS et ELISA, qui sont sensibles et précis, crédibles et spécifiques. Cependant, ces méthodes nécessitent une instrumentation sophistiquée, un prétraitement complexe et des traitements chronophages⁹. Par conséquent, le développement d’une stratégie de diagnostic au point de service plus rapide et plus pratique pour la détection en temps réel et en temps réel des composés actifs médicinaux est urgent^10,11.

La popularité des ICS, en particulier pour les tests courants, est motivée par leur facilité d’utilisation, car ils ne nécessitent pas de professionnels ou de configurations instrumentales élaborées¹². En d’autres termes, les personnes qui n’ont pas de formation spéciale peuvent utiliser des bandelettes ou des auto-tests¹³. Les résultats du test peuvent être obtenus en 5 minutes, ce qui signifie qu’il peut être utilisé pour des inspections de site¹⁴. De plus, selon nos calculs, le coût des bandes pourrait être inférieur à 1 RMB¹⁵, ce qui signifie que les tests sont peu coûteux pour promouvoir¹⁶. Par conséquent, l’ICS est un appareil jetable relativement précis, simple et peu coûteux. Les ICS basés sur l’or colloïdal^17,18 sont également appliqués dans la détection rapide de la COVID-19.

Le principe de l’ICS peut être divisé en ICS sandwich et ICS compétitif. La figure 1A est un diagramme schématique du SCI sandwich, qui est principalement utilisé pour détecter les substances macromoléculaires telles que les protéines, y compris les marqueurs tumoraux, les facteurs inflammatoires et la gonadotrophine chorionique humaine (HCG, antigène de grossesse précoce). Dans cette méthode, des anticorps appariés ciblant différents épitopes de l’antigène sont utilisés, et l’anticorps de capture est séché sur la membrane NC comme ligne de test. L’anticorps marqué est séché sur le tampon conjugué et l’anticorps secondaire est utilisé comme ligne de contrôle.

La figure 1B est un diagramme schématique des SCI concurrents, qui est principalement utilisé pour détecter les substances à petites molécules (MWCO < 2000 Da). L’antigène de revêtement est fixé sur la membrane NC comme ligne de test, et l’anticorps marqué est séché sur le tampon conjugué. Au cours de la détection, l’échantillon et l’anticorps marqué circulent à travers la ligne de détection sous action capillaire, et l’antigène enrobé se lie de manière compétitive à l’antigène libre dans l’échantillon et développe une couleur rouge sur la ligne de détection.

Récemment, nous avons décrit la procédure de génération d’anticorps monoclonaux contre des produits naturels¹⁹. Dans ce travail, nous avons développé un nouveau test immunologique à flux latéral basé sur l’anti-SSD mA²⁰ préparé pour une détection rapide sur site. Les résultats indiquent que le test d’immunochromatographie est un outil indispensable et pratique pour détecter les composés naturels dérivés de produits.

Figure 1 Schéma du test d’immunochromatographie (A) Bandelettes de test immunochromatographiques sandwich. (B) Bandelettes de test immuno chromatographiques compétitives indirectes. Ce chiffre a été modifié à partir de Zhang et al.,2018²¹. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Toutes les procédures effectuées dans cette étude ont été approuvées par le Comité d’éthique de l’Université de médecine chinoise de Beijing (numéro d’approbation 2017BZYYL00120).

1. Préparation et caractérisation de l’or colloïdal

REMARQUE: Pour la synthèse de l’or colloïdal, comme l’or colloïdal est facilement adsorbé sur la paroi interne du récipient et est sujet à la précipitation par les impuretés, le récipient pour la synthèse et le stockage de l’or colloïdal doit être soigneusement nettoyé et trempé dans de l’acide (40 mL d’eau distillée, 360 mL d’acide sulfurique concentré, 20 g de dichromate de potassium) ou soumis à un traitement de passivation de surface. Une méthode de réduction de l’acide citrique a été utilisée pour synthétiser l’or colloïdal.

1. Allumez l’agitateur magnétique et placez la fiole (250 mL) sur le mélangeur.
2. Préparer une solution d’acide de chlorure d’or à 4% et une solution de citrate de sodium à 1%, respectivement.
3. Ajouter 120 mL d’eau distillée dans une fiole à fond rond et la chauffer à ébullition sur un agitateur magnétique thermostatique.
4. Continuez à bouillir et ajoutez rapidement 0,5 mL d’acide chloroaurique à 4 % et 5 mL de citrate de sodium à 1 %.
5. Observez la couleur de la solution. La solution d’acide chloroaurique jaune pâle rend le vin rouge en quelques minutes.
6. Continuez à chauffer pendant 10 minutes, jusqu’à ce que la solution passe d’incolore à rouge vin transparent.
7. Éteignez l’alimentation du mélangeur magnétique thermostatique, refroidissez à la température ambiante et déplacez le mélange dans une bouteille propre. Conservez-le à 4 °C.
8. Déterminer la taille et la morphologie des AuNPs par spectroscopie ultraviolette et imagerie TEM.
   REMARQUE: Différentes tailles de particules d’or colloïdaux pour diverses applications peuvent être obtenues en modifiant la proportion de citrate de sodium et d’acide chloroaurique.

2. Synthèse du conjugué AuNPs-mAb

REMARQUE: Étant donné que les anticorps se lient à l’or colloïdal par adsorption électrostatique, les charges à la surface des protéines et de l’or colloïdal affectent directement l’intensité de liaison; par conséquent, la valeur du pH tampon est un facteur important affectant la stabilité du conjugué anticorps-or colloïdal. Les mAbs SSD et anti-SSD sont utilisés comme exemples dans ce protocole.

1. Évaluation du pH de couplage
   1. Ajouter 100 μL de solution de NaCl (10 % m/v) dans huit tubes.
   2. Ajuster les solutions AuNP à pH 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 et 12 avec 0,1 M K₂CO₃.
   3. Ajouter 100 μL de solution d’or colloïdal (pH ajusté 5-12) à huit tubes contenant du NaCl.
   4. Laissez les solutions reposer pendant plusieurs minutes après le mélange. Observez le changement de couleur de chaque solution de tube et enregistrez le tube qui reste rouge.
   5. Choisissez la valeur de pH avec le moins d’ajout de_K2CO₃ et la couleur de la solution stable comme valeur de pH optimale pour la préparation des conjugués AuNP-mAb.
      REMARQUE: N’utilisez pas de pH-mètre car la sonde peut être détruite par les AuNPs.
2. Évaluation de la quantité d’anticorps
   1. Ajouter 100 μL de solution de NaCl (10 % m/v) dans huit tubes.
   2. Ajouter 100 μL de solution d’or colloïdal avec un pH optimal à chaque tube.
   3. Ajouter les solutions d’anticorps monoclonaux (concentration en protéines 0,1 mg/mL-3,2 mg/mL) aux huit tubes susmentionnés.
   4. Laissez les solutions reposer pendant plusieurs minutes après le mélange. Observez le changement de couleur de chaque solution de tube et enregistrez le tube qui reste rouge.
   5. Choisissez la quantité d’anticorps avec la plus faible concentration de mAb et la couleur de la solution stable comme quantité optimale de mAb pour la préparation des conjugués AuNP-mAb.
3. Préparer le tampon de resuspension : ajouter 1 M tris-HCl (pH 8,8), 1 % (p/v) BSA, 0,5 % (v/v) Tween 20 et 1 % (v/v) PEG 20000 et bien mélanger.
4. Synthèse du conjugué AuNP-mAb
   1. Prendre 10 mL de solution d’or colloïdal et utiliser 0,1 M K₂CO₃ pour ajuster la solution à la valeur de pH optimale.
   2. Ajouter lentement les mAbs SSD à des concentrations appropriées et agiter à température ambiante pendant 30 min.
   3. Centrifuger le mélange à 83 x g (1 000 tr/min) pendant 10 min à 4 °C. Retirez le précipité, qui contient des impuretés ou de l’or colloïdal précipité.
   4. Centrifuger le mélange à 8 330 x g (10 000 tr/min) pendant 30 min à 4 °C. Jetez le surnageant, et le précipité est le conjugué colloïdal or-mAb.
   5. Ajouter le tampon de ressuspension pour dissocier les précipitations.

3. Assemblage de la bande

REMARQUE: Pour les immunoessais à flux ultérieur, la sélection et le prétraitement du matériau membranaire affecteront directement le test, qui doit être étudié. La bande immunochromatographique se compose d’un tampon d’échantillon, d’un tampon conjugué, d’une membrane de nitrocellulose (NC), d’un tampon absorbant et d’un panneau de PVC(Figure 1). Le matériau de la membrane doit être vérifié et évalué par stéréomicroscopie pour éliminer l’inhomogénéité.

1. Collez la membrane CN sur une planche de PVC à 2 cm du bord de l’extrémité d’aspiration de la carte.
2. Ajouter SSD-BSA (2 mg/mL) goutte à goutte à la membrane NC (à 2 cm du bord supérieur) comme ligne d’essai (1 mm de large), et ajouter des IgG anti-souris chèvre (1,5 mg/mL) goutte à goutte sur la membrane NC (à 2 cm du bord inférieur) comme ligne de contrôle (1 mm de large). Contrôlez la quantité de protéines ajoutées.
3. Fixez le tampon absorbant à la feuille de PVC au-dessus de la membrane CN et chevauchez-le avec la membrane CN de 2 mm.
4. Immergez la membrane en fibre de verre dans la solution conjuguée AuNPs-mAb. Sécher la membrane humide dans un incubateur à 37 °C.
5. Coupez la membrane en fibre de verre à 5 cm de long et 2 cm de large et utilisez-la comme tampon conjugué.
6. Collez le tampon conjugué prétraité sous la membrane CN. La longueur de chevauchement avec la membrane CN doit être de 0,1 cm.
   REMARQUE: La membrane en fibre de verre a une forte capacité à se lier et à libérer des protéines.
7. Coupez la membrane fusion 3 à 1,8 cm de long et 3,5 cm de large et utilisez-la comme tampon d’échantillonnage.
8. Collez le tampon d’échantillon sur la planche de PVC et chevauchez-le avec le tampon conjugué de 2 mm.
9. Découpez le carton assemblé en bandes de 3,5 mm de large à l’aide d’une machine de découpe et compactez-le à l’aide d’un système de laminage par lots.
10. Enfin, placez les bandelettes de test dans la coque, scellez-les dans un sac en aluminium contenant du dessiccant et rangez-les à l’abri de la lumière. Les ICS sont maintenant assemblés.
    REMARQUE: Ce qui précède est la procédure de laboratoire. Dans la production, des équipements de pulvérisation d’or et des instruments à membrane croisée sont utilisés pour pulvériser de l’or et fabriquer les lignes T et C.

4. Détection quantitative

1. Déposer 50 μL de solution d’échantillon sur le trou d’échantillonnage pour observer le processus de chromatographie.
   REMARQUE: En raison de l’action capillaire entraînée par le tampon absorbant, la solution d’échantillon migre vers l’autre extrémité de la bandelette. Lorsque la solution d’échantillon atteint le tampon conjugué, le SSD (antigène) de l’échantillon réagit avec les AuNPs-mAb préchargés sur le tampon. Lorsque la solution migre et atteint la ligne T, les AuNPs-mAb sans SSD peuvent être capturés sélectivement par SSD-BSA (conjugué protéine porteuse d’antigène), apparaissant sous forme de couleur rouge sur la ligne T. Ensuite, la solution migre vers la ligne C, où les AuNPs-mAb sont capturés par des IgG anti-souris de chèvre dans la région, s’affichant ainsi sous forme de couleur rouge sur la ligne C.
2. Analysez les bandes avec un lecteur de bandes portable. La machine peut fournir le rapport de la ligne de test à la ligne de commande (T / C).
3. Évaluer la spécificité, la sensibilité, la répétabilité et la stabilité du test ICS.
   REMARQUE: Sous détection qualitative, une ligne rouge indique un résultat positif (ligne de contrôle). Deux lignes rouges indiquent un résultat négatif (lignes de test et de contrôle). Si la ligne de contrôle n’est pas présente, le test est considéré comme non valide.

Caractérisation de l’or colloïdal
Les solutions d’or colloïdal préparées étaient rouge clair. Des analyses TEM ont été utilisées pour déterminer la morphologie et la forme des AuNPs (Figure 2A-D). Les figures 2A et 2B révèlent que les particules sont de forme polyédrique et uniformément réparties. Le diamètre moyen des AuNPs s’est avéré être d’environ 14 nm(Figure 2C). Une image TEM haute résolution (HRTEM) des AuNPs est illustrée à la Figure 2D et à la Figure 2E. L’image HRTEM prise à partir d’un AuNP individuel montre un motif de frange continue avec un espacement de 0,117 nm. Les pics d’absorption UV-vis des cinq solutions colloïdales d’or étaient de 518 nm, 521 nm, 524 nm, 534 nm et 540 nm, ce qui a montré que la taille des particules augmentait légèrement avec la diminution du citrate de sodium(Figure 2F).

Figure 2 Caractérisation de l’or colloïdal. (A) Image TEM des AuNPs (grossissement de 100 000 ×). (B) Image TEM des AuNPs (grossissement de 500 000 ×). (C) La distribution par taille des AuNPs. Comme le voit l’image TEM, les diamètres des AuNP variaient de 10 nm à 18 nm, avec un diamètre moyen d’environ 14 nm. (D, E) Image TEM haute résolution (HRTEM) des AuNPs. L’image HRTEM prise à partir d’un AuNP individuel montre un motif de frange continue avec un espacement de 0,117 nm. (F) Spectres d’absorption UV-vis de différents AuNP allant de 10 nm à 18 nm. Ce chiffre a été modifié à partir de Zhang et al.,201821. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Évaluation des jauges
Sensibilité de l’ICS
Pour déterminer la sensibilité des CSI, des bandelettes immunochromatographiques ont été utilisées pour détecter une variété de concentrations différentes d’échantillons standard SSD (150 000, 60 000, 12 000, 2400, 480 et 96 ng / mL)(Figure 3A). De l’eau double distillée a été utilisée comme témoin. Dans l’expérience quantitative, les bandes ont été scannées par un lecteur ICS portable JY1502GS(Figure 3B-C). L’équation de régression linéaire était y = −0,113ln(x) + 1,5451, avec un coefficient de corrélation (R2) de 0,983(Figure 3D). Il affichait une bonne linéarité de 96 ng/mL à 150 μg/mL. La valeur de la CI50 était de 10,39 μg/mL. Dans l’expérience quantitative, le temps de test optimal a été suggéré à 10 min.

Figure 3 Caractérisation du dosage immunologique à flux latéral pour SSD. (A) Photographies des résultats pour les solutions étalons contenant différentes concentrations de SSD dosage à l’aide du SCI. (B) Photographie du scan de l’or colloïdal apparié. (C) Les profils d’intensité des lignes d’essai et de contrôle scannées par l’instrument quantitatif de l’or colloïdal. (D) Courbe standard d’icELISA pour la détermination SSD à l’aide de l’ICS. L’équation de régression est y = −0,113ln(x) + 1,5451, avec un coefficient de corrélation(R2)de 0,983. Ce chiffre a été modifié à partir de Zhang et al.,201821. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Spécificité de l’ICS
La spécificité de l’ICS a été testée en évaluant la réactivité croisée avec des composés similaires aux SSD. Le tableau 1 montre la réactivité croisée des ICS avec les composés liés aux SSD. On peut clairement voir que le SCI n’avait qu’une faible réactivité croisée avec le SSa et n’avait aucune réaction croisée avec d’autres composés, y compris le SSc, le SSb1 ou le SSb2(tableau 1),ce qui indique que le SCI préparé a une spécificité élevée.

Tableau 1. Réactivité croisée des composés mesurée par ICS et icELISA.  La spécificité de l’ICS a été évaluée par ICS (a) et icELISA (b). Ce tableau a été modifié à partir de Zhang et al.,201821.

Taux de récupération
Comme le montre le tableau 2,le taux de récupération moyen était de 102,05 % (moyenne ± ET, n = 3). Sur la base de sa précision et de sa cohérence, ce test était suffisamment fiable pour la détermination du SSD dans des échantillons biologiques.

Tableau 2. Taux de récupération du SSD.   Les données sont la moyenne ± SD à partir d’échantillons triples à chaque concentration de SSD. Le pourcentage de recouvrement a été calculé comme suit : recouvrement (%) = montant mesuré × 100 %. Ce tableau a été modifié à partir de Zhang et al.,201821.

Analyse de stabilité du test ICS
Pour évaluer la stabilité du SCI, les bandelettes réactives stockées pendant 8 et 16 semaines ont été testées et comparées aux bandelettes nouvellement préparées. Le tableau 3 montre que les résultats des bandelettes stockées et nouvellement préparées pour les échantillons négatifs et positifs étaient essentiellement inchangés, ce qui indique que le SCI peut être conservé à température ambiante pendant au moins plusieurs mois et qu’il convient à une promotion et à une application à grande échelle.

Tableau 3. Variations entre les ICS utilisés pour l’analyse des SSD.   aLes valeurs indiquent les coefficients de variance pour les échantillons triples sur 3 bandes différentes utilisées 1 jour après la fabrication. b Les valeurs indiquent les coefficients de variance pour les échantillons triples sur 3 bandelettes différentes utilisées après avoir été stockées pendant 4 semaines. c Les valeurs indiquent les coefficients de variance pour les échantillons triples sur 3 bandelettes différentes utilisées après avoir été stockées pendant 8 semaines. Ce tableau a été modifié à partir de Zhang et al.,201821.

Les auteurs n’ont rien à divulguer.