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Article de méthode

Isolement de l’ARN total de Pseudomonas aeruginosa dans des biofilms pour la mesure de l’expression génique

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DOI :

10.3791/62755

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24 septembre 2021

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1Translational Medicine, Hospital for Sick Children, 2Department of Cell and Systems Biology, University of Toronto, 3Microbiology, Department of Pediatric Laboratory Medicine, Hospital for Sick Children, 4Infectious Diseases, Department of Pediatrics, Hospital for Sick Children

Dans cet article

Résumé

Ce protocole présente une méthode pour isoler l’ARN des biofilms de Pseudomonas aeruginosa cultivés dans des lames de chambre pour un séquençage à haut débit.

Résumé

Pseudomonas aeruginosa est un pathogène bactérien opportuniste qui provoque des infections des voies respiratoires des patients atteints de mucoviscidose (FK). P. aeruginosa est connu pour sa capacité à former des biofilms protégés par une matrice d’exopolysaccharides. Cette matrice permet aux micro-organismes d’être plus résistants aux facteurs externes, y compris le traitement antibiotique. L’une des méthodes les plus courantes de croissance du biofilm pour la recherche est l’utilisation de plaques de microtitration ou de lames chambrées. L’avantage de ces systèmes est qu’ils permettent de tester plusieurs conditions de croissance, mais leur inconvénient est qu’ils produisent des quantités limitées de biofilm pour l’extraction de l’ARN. Le but de cet article est de fournir un protocole détaillé, étape par étape, sur la façon d’extraire l’ARN total de petites quantités de biofilm de qualité et de quantité suffisantes pour le séquençage à haut débit. Ce protocole permet d’étudier l’expression des gènes au sein de ces systèmes de biofilms.

Introduction

La plupart des infections bactériennes chroniques, telles que les infections pulmonaires chez les patients atteints de mucoviscidose (FK) et les infections liées aux prothèses, sont caractérisées par la croissance d’organismes dans les biofilms. Les biofilms1 sont des communautés de bactéries enfermées dans une matrice composée principalement de polysaccharides2. Les bactéries présentes dans les biofilms peuvent être à croissance lente, métaboliquement dormantes et dans des conditions anaérobies et hypoxiques. Les biofilms sont plus résistants aux antibiotiques en raison de facteurs tels que la diminution de la pénétration des antibiotiques, l’augmentation de l’expression des pompes d’efflux de médicament et la diminution de la division cellulaire3. Pour ces raisons et d’autres, ils présentent un grand intérêt pour la recherche.

Afin d’étudier avec précision les infections persistantes telles que les infections chroniques à Pseudomonas aeruginosa chez les patients atteints de mucoviscidose, les conditions de croissance observées avec la formation de biofilms doivent être reflétées avec précision in vitro. Une méthode courante à haut débit consiste à les cultiver dans des lames de chambre ou des plaques de microtitration et à surveiller la formation de biofilms par microscopie confocale4. On sait qu’un régulateur clé dans la transition d’un mode de vie bactérien planctonique, ou flottant libre, à un mode de vie bactérien à biofilm est le messager secondaire, cyclique-di-GMP5. L’augmentation des niveaux cycliques de di-GMP augmente l’expression de gènes spécifiques qui favorisent la croissance du biofilm. Les petits ARN régulateurs non codants et la détection du quorum jouent également un rôle important dans la régulation de la formation du biofilm5. Mesurer l’expression génique d’un biofilm par séquençage de l’ARN bactérien extrait peut s’avérer difficile. P. aeruginosa, par exemple, produit trois exopolysaccharides (Psl, Pel et alginate), qui sont produits en quantités importantes dans les biofilms 6,7. Ces polysaccharides peuvent interférer avec l’extraction et la purification de l’ARN, conduisant à des préparations impures contenant de faibles niveaux d’ARNm 8 bactérien. Les kits d’extraction d’ARN disponibles dans le commerce sont capables de produire de l’ARN de haute qualité à partir de cultures bactériennes planctoniques, mais peuvent ne pas fonctionner aussi bien avec les cultures de biofilm 9,10,11. Il existe quelques kits commerciaux d’extraction d’ARN qui prétendent fonctionner pour les biofilms, dont l’un que nous utilisons avec cette méthode.

Dans ce manuscrit, nous décrivons les procédures de croissance des biofilms de P. aeruginosa dans des lames de chambre et d’extraction de l’ARNm bactérien pour le séquençage à haut débit12,13. À l’aide d’isolats cliniques prélevés sur des échantillons d’expectorations de patients atteints de mucoviscidose, nous démontrons que ces méthodes peuvent être utilisées pour des isolats présentant des caractéristiques de croissance variables. Par rapport aux publications précédentes, ce protocole est décrit en détail pour permettre un meilleur succès dans l’étude de l’expression génique du biofilm bactérien 11,14,15,16.

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Protocole

Le comité d’éthique de la recherche (CER) est requis pour la collecte et le traitement d’échantillons d’expectorations provenant de sujets humains. Cette étude a été approuvée par l’Hôpital pour enfants malades (REB#1000019444). Le comité d’éthique de la recherche (CER) est tenu de prélever et d’entreposer des échantillons d’expectorations provenant de sujets humains. Ces études ont été approuvées par le CER#1000058579 de l’Hôpital pour enfants malades.

1. Formation du biofilm

  1. Cultivez pendant la nuit des isolats de Pseudomonas aeruginosa obtenus à partir d’échantillons d’expectorations de patients atteints de mucoviscidose utilisés dans cette étude sur des plaques de gélose Luria Broth (LB) dans un incubateur à 37 °C.
    REMARQUE : Une bonne technique de stries est importante pour obtenir des colonies bactériennes uniques. Les stries pendant la rotation de la plaque dilueront suffisamment les cellules bactériennes pour que des colonies individuelles puissent se développer.
    1. Striez les bactéries à l’aide d’une boucle d’inoculation en zigzag à l’extrémité supérieure d’une plaque LB fraîche jusqu’à ce qu’environ 1/4 de la plaque soit couverte.
    2. Faites pivoter la plaque d’environ 60°. Prenez une nouvelle boucle d’inoculation et passez-la une fois à travers la zone striée et dans une deuxième zone propre de la plaque, en répétant le motif en zigzag.
    3. Répétez l’étape 1.1.2 avec une boucle fraîche dans une troisième zone de la plaque. Remettez le couvercle et retournez la plaque lorsque vous la placez dans l’incubateur.
  2. À l’aide d’une boucle d’inoculation stérile, prélever une seule colonie bactérienne dans une plaque de gélose (contenant une seule souche bactérienne) et inoculer un tube de culture rempli de 5 mL de milieu stérile LB. À l’aide d’une nouvelle boucle à chaque fois, inoculer deux tubes de culture supplémentaires remplis de 5 mL de milieu LB à partir de la même plaque.
  3. Répéter la même procédure d’inoculation pour les différentes souches bactériennes. Faites pousser les cultures pendant la nuit à 37 °C en secouant à 220 tr/min.
    REMARQUE : Chaque plaque de gélose contenant une seule souche bactérienne est utilisée pour inoculer 3 tubes de culture indépendants. Les trois tubes représentent des répétitions biologiques en triple exemplaire pour une souche et sont traités comme des échantillons distincts. Ceci est différent des réplicats techniques qui impliqueraient d’extraire 3 fois l’ARN d’un seul tube de culture.
  4. Préparez des dilutions de 1:100 des cultures de nuit en transférant 50 μL d’une culture de nuit dans un nouveau tube de culture contenant 4,95 mL de nouveau milieu LB.
  5. Faites pousser les cultures diluées pendant encore 3 h à 37 °C en agitant à 220 tr/min ou jusqu’à ce que la DO600 soit de 0,1 ou plus. Mesurez les densités cellulaires sur un spectrophotomètre àOD 600.
  6. Dans un nouveau tube microfuge de 1,7 ml, ajustez l’OD600 à 0,1 (phase logarithmique précoce) dans un volume total de 1,5 mL avec LB frais.
  7. Mélanger délicatement par inversion. Transférez 300 μL de chaque culture ajustée dans 4 puits d’une lame de chambre à 8 puits pour obtenir 2 échantillons différents par lame (figure 1).
  8. Placez les lames, sans les déranger, dans un incubateur à 37 °C pendant la nuit pendant 24 h. Pour éviter l’évaporation, placez les lames sur une serviette en papier humide dans un petit plateau en plastique.

2. Récupération du biofilm

REMARQUE : Chaque lame de verre contient huit puits séparés. Un seul échantillon se compose de quatre puits avec des biofilms qui seront regroupésen 17. Ce protocole d’extraction porte sur 1 échantillon (4 puits) où les biofilms sont récupérés à partir de 2 puits à la fois. Les extractions d’ARN sont effectuées à l’aide d’un kit d’extraction d’ARN commercial qui comprend une étape de battage de billes et un nettoyage sur colonne, avec des modifications. Suivez les instructions du fabricant pour la préparation du réactif.

  1. Dans une hotte à flux laminaire, retirez lentement le support de 2 des 4 puits à l’aide d’une pointe de pipette. Inclinez la glissière à un angle de 45° et faites sortir le média à partir du coin inférieur des puits pour éviter le détachement des biofilms.
  2. En gardant la lame inclinée, lavez les cellules planctoniques en pipetant doucement 300 μL d’eau sans RNase dans le coin inférieur des deux puits vidés. Retirez l’eau en la pipetant doucement, comme décrit à l’étape 2.1. Répétez l’étape de lavage en enlevant autant d’eau que possible.
  3. Ajouter 300 μL d’un réactif de protection à ARN (voir le tableau des matériaux) dans chacun des deux puits vidés avec des biofilms à leur base. Placez la lame de la chambre sur une plaque de verre pour éviter que les puits ne se brisent, puis raclez les biofilms dans les 2 puits avec une petite spatule métallique stérile sans nucléase pour remettre en suspension les bactéries du biofilm. Laisser reposer jusqu’à ce que les biofilms soient récupérés des 2 puits intacts restants du même échantillon.
    REMARQUE : L’ajout d’un réactif de protection à ARN assure la stabilité des échantillons de biofilm dans les puits raclés à température ambiante pendant le traitement des deux puits restants du même échantillon. Le réactif de protection de l’ARN lyse les cellules et inactive les nucléases et les agents infectieux, ce qui permet de préserver l’ARN.
  4. Pour récupérer les biofilms des 2 puits restants pour un échantillon (rappel : un échantillon est composé de 4 puits), prélever le milieu LB des 2 nouveaux puits restants de la même manière que décrit à l’étape 2.1. Répétez l’étape 2.2 pour laver les cellules planctoniques avec de l’eau sans RNase des deux nouveaux puits, comme précédemment.
  5. Retournez aux 2 premiers puits avec des biofilms grattés dans un réactif de protection, généré à la fin de l’étape 2.3, et pipetez lentement pour mélanger les 300 μL de biofilm remis en suspension à partir d’un puits gratté, en essayant de ne pas créer trop de bulles.
    1. Transférez tout le contenu du puits dans l’un des puits nouvellement lavés et vidés. Mélanger et transférer 300 μL de biofilm remis en suspension du deuxième puits gratté dans le puits restant, nouvellement lavé et vidé.
      REMARQUE : Au lieu d’ajouter un nouveau réactif de protection à ARN dans les 2 puits nouvellement lavés avec des biofilms, transférez les biofilms précédemment grattés déjà dans le réactif de protection dans ces puits fraîchement lavés. Cela permettra de maintenir le volume d’échantillon combiné suffisamment bas pour répondre aux exigences d’entrée du kit d’extraction d’ARN commercial. Voir la figure 1 pour un schéma.
  6. Répétez le grattage des biofilms dans les nouveaux puits comme à l’étape 2.3, en plaçant la lame de la chambre sur une plaque de verre et en grattant les biofilms dans les 2 nouveaux puits avec une petite spatule métallique stérile sans nucléases pour remettre en suspension les bactéries du biofilm.
  7. Combinez tout le biofilm remis en suspension des 2 nouveaux puits dans un seul tube de microcentrifugation de 1,5 mL sans RNase et à faible liaison. Mesurez le volume, qui doit être de ~500 à 600 μL au total.
    REMARQUE : La suspension combinée du biofilm de cette deuxième paire de nouveaux puits contiendra tout le matériau du biofilm des 4 puits originaux d’un échantillon.

3. Isolement total de l’ARN et évaluation de la qualité

REMARQUE : L’extraction de l’ARN est effectuée à l’aide d’un kit d’extraction d’ARN commercial qui prétend fonctionner sur des biofilms. Les différents composants sont inclus dans la table des matériaux, si possible. Des explications sur les mécanismes à l’origine de chaque étape de purification sont fournies lorsque cela est possible.

  1. Ajouter suffisamment de réactif de protection à ARN pour totaliser 750 μL dans le tube. Transvasez tout le volume dans un tube de lyse de 2 mL contenant des billes de 0,1 et 0,5 mm (voir le tableau des matériaux). Battre pendant 2 1/2 min dans un batteur à perles à vitesse maximale.
    REMARQUE : La combinaison de billes haute densité de 0,1 mm et 0,5 mm et d’un mélange à grande vitesse sur un batteur de billes assure une homogénéisation complète des parois cellulaires microbiennes.
  2. Centrifuger à 16 000 x g pendant 1 min pour granuler les billes. Transférez le surnageant dans un nouveau tube de microcentrifugation, en minimisant le transfert de billes, ce qui facilitera l’étape 3.3. Mesurez le volume.
  3. Ajouter un volume égal de tampon de lyse de l’ARN (~450 μL) et bien mélanger. Transférez jusqu’à 800 μL d’échantillon, en évitant le transfert de billes, dans une colonne de silice dans un tube de collecte et centrifugez à 16 000 x g pendant 30 s. Conservez le flux continu car il contient l’ARN tandis que l’ADN est lié à la colonne.
    REMARQUE : Le tampon de lyse de l’ARN contient du thiocyanate de guanidinium et le détergent N-lauroylsarcosine pour lyser les cellules. Le thiocyanate de guanidinium est un agent chaotrope qui inactive également les nucléases et, en présence de silice, présente dans la colonne de spin, favorise la liaison de l’ADN à la silice18. L’absence d’éthanol permet une liaison préférentielle de l’ADN et non de l’ARN à la colonne de spin de silice19. Le but de l’étape 3.3 est de lier et d’éliminer l’ADN génomique. Nous voulons conserver l’ARN, qui est contenu dans la partie accréditive.
  4. S’il reste plus d’échantillon, transférez la colonne dans un nouveau tube de prélèvement et rechargez avec le reste de l’échantillon. Centrifugeuse à 16 000 x g pendant 30 s. Conservez le flux avec l’ARN et combinez avec la première aliquote.
  5. Mesurez le volume d’écoulement combiné et ajoutez un volume égal de 100 % d’éthanol et mélangez bien. Transférez jusqu’à 800 μL de la solution dans une nouvelle deuxième colonne de centrifugation de silice dans un tube de collecte et centrifugez à 16 000 x g pendant 30 s. Jetez le flux continu.
    REMARQUE : L’ajout d’éthanol à la solution de sel chaotrope contenant l’ARN améliore la liaison de l’ARN à la colonne de spin de silice19.
  6. Pour les solutions > 800 μL, rechargez la colonne de centrifugation et centrifugez jusqu’à ce que toute la solution soit essorée. Jetez le flux continu après chaque essorage.
  7. Ajouter 400 μL de tampon de lavage dans la colonne et centrifuger à 16 000 x g pendant 30 s pour éliminer une partie des sels. Jetez le flux continu.
  8. Préparez le mélange réactionnel DNase I selon les instructions du fabricant et effectuez le traitement DNase en colonne pour éliminer tout ADN résiduel.
  9. Remettre en suspension la DNase I lyophilisée dans 275 μL d’eau exempte de RNase pour obtenir une solution à 1 U/μL. Mélanger par inversion douce.
  10. Combinez 5 μL de DNase I diluée avec 75 μL du tampon de digestion DNase fourni. Mélanger délicatement par inversion.
  11. Ajouter 80 μL de la solution préparée directement sur la matrice de colonne. Incuber à température ambiante pendant 20 min.
  12. Ajouter 400 μL de tampon de préparation d’ARN dans la colonne et centrifuger à 16 000 x g pendant 30 s. Jetez le flux continu.
  13. Ajoutez 700 μL de tampon de lavage d’ARN dans la colonne et répétez la centrifugation. Jetez le flux continu.
  14. Ajoutez 400 μL de tampon de lavage d’ARN et centrifugez la colonne pendant 2 minutes pour éliminer complètement tout tampon résiduel.
    REMARQUE : Il y a 2 étapes de lavage différentes pour éliminer les impuretés sur la colonne. Le tampon de préparation contient un sel chaotrope faible mélangé à de l’éthanol afin d’éliminer les protéines résiduelles. Ensuite, le tampon de lavage est utilisé pour effectuer des lavages à l’éthanol afin d’éliminer les sels. Tout éthanol restant doit être éliminé pour permettre une élution efficace de l’ARN19,20.
  15. Transférez soigneusement la colonne dans un nouveau tube de microcentrifugation à faible liaison.
  16. Ajouter 50 μL d’eau exempte de RNase directement dans la matrice de la colonne et incuber pendant 5 min. Centrifuger à 16 000 x g pendant 1 min pour éluer l’ARN.
  17. Pour un nettoyage supplémentaire afin d’éliminer les inhibiteurs de PCR, placez un filtre inhibiteur de PCR dans un nouveau tube de collecte. Ajouter 600 μL de la solution de préparation d’inhibiteur fournie (voir le tableau des matériaux).
  18. Centrifuger à 8 000 x g pendant 3 min pour laver le filtre. Transférez le filtre lavé dans un nouveau tube de microcentrifugation à faible liaison.
  19. Transférez l’ARN élué de l’étape 3.13 dans le filtre lavé et centrifugez à 16 000 x g pendant 3 min.
    REMARQUE : L’ARN peut être utilisé immédiatement ou stocké à -80 °C.
  20. Déterminer la concentration de l’ARN à l’aide d’un système fluorométrique à haute sensibilité21.
    REMARQUE : Ces systèmes permettent une quantification sensible d’une petite quantité d’ARN en solution spécifique à la cible d’intérêt.
    1. Évaluez la qualité de l’ARN à l’aide d’un système d’électrophorèse automatisé qui peut fournir un RIN (RNA integrity number), qui est une mesure de la qualité de l’ARN22,23.

4. Déplétion de l’ARN ribosomique et séquençage à haut débit

  1. Soumettre des ARN au Centre d’analyse de l’évolution et de la fonction du génome (CAGEF) de l’Université de Toronto (Toronto, Canada) (https://www.cagef.utoronto.ca/) pour la déplétion de l’ARNr bactérien et la préparation de banques d’ARN directionnels (voir la table des matériaux).
    REMARQUE : La déplétion de l’ARNr bactérien cible les ARNr 5S, 16S et 23S pour l’élimination24.
  2. Épuisez les ARNr à l’aide d’un kit commercial de déplétion bactérienne d’ARNr. Suivez le protocole pour la saisie de 10 ng à 1 μg d’ARN total intact ou partiellement dégradé.
  3. Construisez des banques de séquençage d’ARN à l’aide d’un kit de préparation de bibliothèque directionnelle d’ARN avec différents index attachés à chaque bibliothèque.
  4. Regroupez les quantités équimolaires de chaque banque d’ARN et effectuez un séquençage à haut débit avec des lectures à 100 bases à extrémités appariées25.

5. Évaluation de la qualité des lectures de séquençage

REMARQUE : Vérifiez la qualité des lectures de séquençage à l’aide du programme disponible gratuitement, FastQC26, disponible via la plate-forme gratuite et open-source, Galaxy27.

  1. Allez à https://usegalaxy.org/. Cliquez sur le menu Connexion ou S’inscrire et connectez-vous avec vos identifiants ou créez un compte.
  2. Cliquez sur le lien Télécharger les données en haut à gauche de la page, sous le menu Outils, et téléchargez les fichiers de séquençage fastq.gz. Attendez que les noms de fichiers apparaissent sur le côté droit de la page, sous le panneau Historique.
  3. Sélectionnez Contrôle de qualité FASTQ dans le menu Outils pour afficher une liste de programmes. Sélectionnez FastQC, qui remplira le panneau central de l’écran.
  4. Sous Lire brièvement les données de votre historique actuel, sélectionnez les fichiers fastq.gz téléchargés dans le menu déroulant.
  5. Sélectionnez Exécuter pour exécuter le programme.
  6. Affichez les résultats dans le panneau Historique (Tableau 2).
    REMARQUE : Pour des instructions plus détaillées sur l’utilisation de Galaxy, visitez la page d’assistance à l’adresse https://galaxyproject.org/support/.

6. Cartographie des lectures de séquençage

REMARQUE : Il s’agit d’un pipeline de base pour le découpage de l’adaptateur et le mappage de lecture des données de séquençage de l’ARN. Les séquences d’adaptateur sont coupées à partir des lectures à l’aide de Trimmomatic28. Les lectures tronquées sont cartographiées sur le génome de référence PAO1 de P. aeruginosa (NC_002516.2), obtenu du NCBI (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)29en utilisant BWA30 et Samtools31. Pour simplifier, une paire de lectures s’appelle PA_1.fq et PA_2.fq ; Le fichier de lecture de l’adaptateur à découper s’appelle adapter.fa ; et la séquence de référence PAO1 s’appelle PAO1.fasta. Tous les outils sont open source et fonctionnent dans un environnement UNIX/LINUX. Il est fortement conseillé de vous familiariser avec les fondamentaux d’UNIX/LINUX afin d’exécuter ces commandes.

  1. Ouvrez une fenêtre sous UNIX/LINUX.
  2. Installez Java, Trimmomatic, BWA et Samtools.
  3. Accédez au dossier dans lequel se trouve le fichier trimmomatic-0.39.jar.
  4. Coupez toutes les séquences d’adaptateur des lectures en tapant la commande :
    Java -jar PA_1.fq PA_2.fq PA_1_paired.fq PA_1_unpaired.fq PA_2_paired.fq PA_2_unpaired.fq ILLUMINACLIP : adapters.fa
    REMARQUE : Seules les séquences d’adaptateur sont supprimées. Les lectures n’ont pas été coupées pour la qualité32.
  5. Déplacez le fichier de référence PAO1.fasta dans le même dossier.
  6. Indexez la référence à l’aide de BWA avec la commande :
    Indice Bwa PA01.fasta
  7. Mappez les lectures appariées au génome de référence en tapant les 4 commandes suivantes. Tapez chaque commande une fois la précédente terminée.
    Bwa -mem PA01.fasta PA_1_paired.fq PA2_2_paired.fq > PA_R1R2_map.mem.sam
    Samtools view -S -b PA_R1R2_map.mem.sam > PA_R1R2.bam
    Samtools sort PA_R1R2.bam -o PA_R1R2_sorted.bam
    Indice Samtools PA288_Rep1_R1R2_sorted.bam
  8. Affichez les statistiques de mappage en tapant la commande :
    Samtools flagstat PA_R1R2_sorted.bam
    REMARQUE : La 3e ligne des statistiques indique la proportion des lectures qui correspondent au génome de référence.
  9. Calculez la profondeur de lecture moyenne et l’étendue de la couverture à l’aide des 2 commandes suivantes33, respectivement :
    Samtools Profondeur -A PA_R1R2_sorted.bam | awk '{c++ ; s+=$3}FIN{imprimer s/c}'
    samtools profondeur -a PA288_Rep1_R1R2_sorted.bam | awk '{c++ ; if($3>0) total+=1}END{print (total/c)*100}'

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Résultats

La figure 1 donne un aperçu général de la méthode. Nous avons précédemment utilisé des lames de chambre à 8 puits pour cultiver des biofilms de P. aeruginosa et les exposer à des antibiotiques avant de les examiner par microscopie confocale à différents moments12,13. Cette méthode peut être utilisée pour extraire l’ARN total directement des biofilms cultivés dans ce système afin d’étudier les changements d’expression génique...

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Discussion

L’ARN total est extrait avec succès de 17 échantillons différents de biofilm bactérien en trois exemplaires, ce qui donne un total de 51 échantillons. Les quarante-neuf banques d’ARN sont regroupées et séquencées avec succès. Dans l’ensemble, cela valide nos critères de qualité avec un taux de réussite de 96 % même si plus de la moitié des échantillons sont considérés comme étant de faible abondance et de qualité sous-optimale 34,35,36,37.

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont aucune divulgation à déclarer.

Remerciements

Contributions des auteurs : P.W., Y.Y. et V.W ont participé à la conceptualisation de l’étude. K.G., L.J., A.M. et P.W. ont optimisé les protocoles de laboratoire. Le financement de K.G. a été financé par la subvention du Programme de stages pratiques pour étudiants par l’intermédiaire de BioTalent Canada.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Bioanalyseur Agilent 2100AgilentG2939BAÉlectrophorèse automatisée de biomolécules
Agilent RNA 6000 pico kitAgilent5067-1513Puce d’électrophorèse d’ARN haute sensibilité pour générer un
tampon de lyse ADN/ARNZymo ResearchD7001-1-50Un tampon de lyse à base de thiocyanate de guanidinium et de N-Lauroylsarcosine vendu dans le cadre d’un kit de purification d’acides nucléiques
Tampon de préparation de l’ADN/ARNZymo ResearchD7010-2-10Un tampon de chlorhydrate de guanidine et d’éthanol utilisé pour la purification de l’ADN et de l’ARN
DNN/ARN BouclierZymo ResearchR1100-50Réactif de préservation/protection de l’ADN et de l’ARN
Tampon de lavage ADN/ARNZymo ResearchD7010-3-6Un tampon de sel et d’éthanol utilisé pour la purification de l’ADN et de l’ARN
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FluorimètreQubitThermo Fisher ScientificQ33238Fluorimètre pour l’ADN, l’ARN et les protéines
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Filtres à spin-away ZymoResearchC1006-50-FColonne de spin à base de silice principalement utilisée pour lier ou éliminer l’ADN génomique
Boucles d’inoculation stériles, 1 uLSarstedt86.1567.050Boucles d’inoculation stériles et jetables pour la manipulation de micro-organismes
ZR BashingTubes de lyse de billesZymo ResearchS6003-50Tubes de 2 mL contenant une matrice de lyse de billes de 0,1 et 0,5 mm pour l’homogénéisation d’échantillons biologiques
Colonnes Zymo Spin IIICG ZymoResearchC1006-50-GColonne de spin à base de silice pour la purification de l’ADN et de l’ARN
Zymo-Spin III-HRC FiltresZymo ResearchC1058-50Supprimer les inhibiteurs tels que les composés polyphénoliques, les acides humiques/fulviques, les tanins, la mélanine, etc.
Zymobiomics Kit Miniprep ADN/ARNZymo ResearchR2002Kit d’extraction double d’ADN et d’ARN
Zymobiomics HRC Prep SolutionZymo ResearchD4300-7-30À utiliser avec les filtres Zymo-Spin III-HRC pour éliminer les inhibiteurs de PCR
RIN

Références

  1. Beaudoin, T., Waters, V. Infections With Biofilm Formation: Selection of Antimicrobials and Role of Prolonged Antibiotic Therapy. The Pediatric Infectious Disease Journal. 35 (6), 695-697 (2016).
  2. Bjarnsholt, T., et al. The in vivo biofilm. Trends in Microbiology. 21 (9), 466-474 (2013).
  3. Folsom, J. P., et al. Physiology of Pseudomonas aeruginosa in biofilms as revealed by transcriptome analysis. BMC Microbiology. 10, 294(2010).
  4. Azeredo, J., et al. Critical review on biofilm methods. Critical Reviews in Microbiology. 43 (3), 313-351 (2017).
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  6. Colvin, K. M., et al. The Pel and Psl polysaccharides provide Pseudomonas aeruginosa structural redundancy within the biofilm matrix. Environmental Microbiology. 14 (8), 1913-1928 (2012).
  7. Hentzer, M., et al. Alginate overproduction affects Pseudomonas aeruginosa biofilm structure and function. Journal of Bacteriology. 183 (18), 5395-5401 (2001).
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