Isolement de l’ARN total de Pseudomonas aeruginosa dans des biofilms pour la mesure de l’expression génique

Résumé

Ce protocole présente une méthode pour isoler l’ARN des biofilms de Pseudomonas aeruginosa cultivés dans des lames de chambre pour un séquençage à haut débit.

Résumé

Pseudomonas aeruginosa est un pathogène bactérien opportuniste qui provoque des infections des voies respiratoires des patients atteints de mucoviscidose (FK). P. aeruginosa est connu pour sa capacité à former des biofilms protégés par une matrice d’exopolysaccharides. Cette matrice permet aux micro-organismes d’être plus résistants aux facteurs externes, y compris le traitement antibiotique. L’une des méthodes les plus courantes de croissance du biofilm pour la recherche est l’utilisation de plaques de microtitration ou de lames chambrées. L’avantage de ces systèmes est qu’ils permettent de tester plusieurs conditions de croissance, mais leur inconvénient est qu’ils produisent des quantités limitées de biofilm pour l’extraction de l’ARN. Le but de cet article est de fournir un protocole détaillé, étape par étape, sur la façon d’extraire l’ARN total de petites quantités de biofilm de qualité et de quantité suffisantes pour le séquençage à haut débit. Ce protocole permet d’étudier l’expression des gènes au sein de ces systèmes de biofilms.

Introduction

La plupart des infections bactériennes chroniques, telles que les infections pulmonaires chez les patients atteints de mucoviscidose (FK) et les infections liées aux prothèses, sont caractérisées par la croissance d’organismes dans les biofilms. Les biofilms¹ sont des communautés de bactéries enfermées dans une matrice composée principalement de polysaccharides². Les bactéries présentes dans les biofilms peuvent être à croissance lente, métaboliquement dormantes et dans des conditions anaérobies et hypoxiques. Les biofilms sont plus résistants aux antibiotiques en raison de facteurs tels....

Protocole

Le comité d’éthique de la recherche (CER) est requis pour la collecte et le traitement d’échantillons d’expectorations provenant de sujets humains. Cette étude a été approuvée par l’Hôpital pour enfants malades (REB#1000019444). Le comité d’éthique de la recherche (CER) est tenu de prélever et d’entreposer des échantillons d’expectorations provenant de sujets humains. Ces études ont été approuvées par le CER#1000058579 de l’Hôpital pour enfants malades.

1. Formation du biofilm

1. Cultivez pendant la nuit des isolats de Pseudomonas aeruginosa obtenus à partir d’échantillons d’expectorations....

Résultats

La figure 1 donne un aperçu général de la méthode. Nous avons précédemment utilisé des lames de chambre à 8 puits pour cultiver des biofilms de P. aeruginosa et les exposer à des antibiotiques avant de les examiner par microscopie confocale à différents moments^12,13. Cette méthode peut être utilisée pour extraire l’ARN total directement des biofilms cultivés dans ce système afin d’étudier les changements d’expression génique.......

Discussion

L’ARN total est extrait avec succès de 17 échantillons différents de biofilm bactérien en trois exemplaires, ce qui donne un total de 51 échantillons. Les quarante-neuf banques d’ARN sont regroupées et séquencées avec succès. Dans l’ensemble, cela valide nos critères de qualité avec un taux de réussite de 96 % même si plus de la moitié des échantillons sont considérés comme étant de faible abondance et de qualité sous-optimale 34,35,36,37.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Bioanalyseur Agilent 2100	Agilent	G2939BA	Électrophorèse automatisée de biomolécules
Agilent RNA 6000 pico kit	Agilent	5067-1513	Puce d’électrophorèse d’ARN haute sensibilité pour générer un
tampon de lyse ADN/ARN	Zymo Research	D7001-1-50	Un tampon de lyse à base de thiocyanate de guanidinium et de N-Lauroylsarcosine vendu dans le cadre d’un kit de purification d’acides nucléiques
Tampon de préparation de l’ADN/ARN	Zymo Research	D7010-2-10	Un tampon de chlorhydrate de guanidine et d’éthanol utilisé pour la purification de l’ADN et de l’ARN
DNN/ARN Bouclier	Zymo Research	R1100-50	Réactif de préservation/protection de l’ADN et de l’ARN
Tampon de lavage ADN/ARN	Zymo Research	D7010-3-6	Un tampon de sel et d’éthanol utilisé pour la purification de l’ADN et de l’ARN
DNBSEQ G-400RS	MGI	G-400RS	Séquenceur à haut débit
MGIEasy RNA Directional Library Prep Set	MGI	1000006386	Générez des banques pour les plateformes de séquençage à haut débit MGI à partir de l’ARN total.
Mini-Beadbeater-96	BioSpec	1001	Un perturbateur cellulaire à haute énergie et à haut débit
NEBNext Kit d’appauvrissement de l’ARNr (bactéries)	New England Biolabs	E7850X	Épuisement efficace et spécifique de l’ARNr bactérien (5S, 16S, 23S)Système de lames de
chambre Nunc Lab-Tek II	Thermo Fisher Scientific	154534	Lame de chambre à 8 puits avec puits amovibles
Fluorimètre	QubitThermo Fisher Scientific	Q33238	Fluorimètre pour l’ADN, l’ARN et les protéines
Kit de dosage Qubit RNA HS	Thermo Fisher Scientific	Q32852	Dosage fluorométrique haute sensibilité pour mesurer la concentration d’ARN
Filtres à spin-away Zymo	Research	C1006-50-F	Colonne de spin à base de silice principalement utilisée pour lier ou éliminer l’ADN génomique
Boucles d’inoculation stériles, 1 uL	Sarstedt	86.1567.050	Boucles d’inoculation stériles et jetables pour la manipulation de micro-organismes
ZR BashingTubes de lyse de billes	Zymo Research	S6003-50	Tubes de 2 mL contenant une matrice de lyse de billes de 0,1 et 0,5 mm pour l’homogénéisation d’échantillons biologiques
Colonnes Zymo Spin IIICG Zymo	Research	C1006-50-G	Colonne de spin à base de silice pour la purification de l’ADN et de l’ARN
Zymo-Spin III-HRC Filtres	Zymo Research	C1058-50	Supprimer les inhibiteurs tels que les composés polyphénoliques, les acides humiques/fulviques, les tanins, la mélanine, etc.
Zymobiomics Kit Miniprep ADN/ARN	Zymo Research	R2002	Kit d’extraction double d’ADN et d’ARN
Zymobiomics HRC Prep Solution	Zymo Research	D4300-7-30	À utiliser avec les filtres Zymo-Spin III-HRC pour éliminer les inhibiteurs de PCR

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