Une méthode évolutive pour étudier la survie neuronale dans une culture neuronale primaire avec une résolution unicellulaire et en temps réel

Résumé

Ici, nous présentons une méthodologie simple, puissante et polyvalente pour étudier la survie neuronale lors d’un stress cytotoxique dans les neurones corticaux primaires avec une résolution cellulaire en temps réel ou dans du matériel fixe.

Résumé

La perte neuronale est au cœur de nombreuses neuropathologies, notamment les accidents vasculaires cérébraux, la maladie d’Alzheimer et la maladie de Parkinson. Différentes méthodes ont été développées pour étudier le processus de survie neuronale lors d’un stress cytotoxique. La plupart des méthodes sont basées sur des approches biochimiques qui ne permettent pas la résolution d’une seule cellule ou qui impliquent des méthodologies complexes et coûteuses. Voici un paradigme expérimental polyvalent, peu coûteux et efficace pour étudier la survie neuronale. Cette méthode tire parti d’un marquage fluorescent clairsemé des neurones, suivi d’une imagerie en direct et d’une quantification automatisée. Dans ce but, les neurones sont électroporés pour exprimer des marqueurs fluorescents et co-cultivés avec des neurones non électroporés pour réguler facilement la densité cellulaire et augmenter la survie.

L’étiquetage clairsemé par électroporation permet une quantification automatisée simple et robuste. De plus, le marquage fluorescent peut être combiné à la co-expression d’un gène d’intérêt pour étudier des voies moléculaires spécifiques. Ici, nous présentons un modèle d’AVC en tant que modèle neurotoxique, à savoir le test de privation d’oxygène-glucose (OGD), qui a été réalisé dans une chambre hypoxique maison abordable et robuste. Enfin, deux flux de travail différents sont décrits à l’aide de l’IN Cell Analyzer 2200 ou de l’open-source ImageJ pour l’analyse d’images pour le traitement semi-automatique des données. Ce flux de travail peut être facilement adapté à différents modèles expérimentaux de toxicité et mis à l’échelle pour le dépistage à haut débit. En conclusion, le protocole décrit fournit un modèle in vitro de neurotoxicité accessible, abordable et efficace, qui peut convenir pour tester les rôles de gènes et de voies spécifiques dans l’imagerie en direct et pour le criblage de médicaments à haut débit.

Introduction

L’étude des troubles neuronaux nécessite des modèles expérimentaux qui se prêtent à des analyses génétiques, moléculaires et cellulaires. Les neurones corticaux primaires sont un modèle très puissant pour étudier la survie et la toxicité neuronales 1,2,3,4. Dans des conditions appropriées, les neurones primaires développeront progressivement des contacts synaptiques et présenteront les caractéristiques des neurones matures. Par conséquent, ce modèle est plus fiable que les lignées cellulaires immortalisées dans la modélisation de la physiologie des neurones et plus susceptible d’être manipulé que les modèles animaux. Cependant, par rapport aux lignées cellulaires, les neurones corticaux primaires sont difficiles à transfecter et relativement fragiles. De plus, la morphologie complexe des neurones corticaux peut compliquer l’imagerie et l’analyse dans les cultures à haute densité. À l’inverse, les cultures neuronales primaires de faible densité sont plus faciles à analyser mais ont tendance à être plus fragiles.

Compte tenu de tout cela, cet article présente un flux de travail in vitro abordable, polyvalent et évolutif pour modéliser et étudier la survie neuronale (Figure 1). Les points clés de ce protocole sont i) la méthode d’électroporation in vitro des neurones avec un marqueur fluorescent pour permettre un marquage et une imagerie clairsemés de cellules vivantes ; ii) sa polyvalence dans différents modèles de cytotoxicité ; et iii) l’analyse semi-automatisée ou automatisée.

Le système d’électroporation (voir le tableau des matériaux) offre une procédure ouverte et peu coûteuse qui n’implique pas de kits et de solutions spécifiques ^4,5,6. De plus, cette méthode peut être facilement adaptée pour obtenir une efficacité de transformation et une densité optimales de neurones transfectés, en mélangeant des cellules électroporées avec des cellules non électroporées. La co-culture avec des neurones naïfs (non électroporés) améliore significativement la viabilité des cellules électroporées par rapport aux cultures à faible densité. De plus, il permet un marquage clairsemé avec une densité ajustable des neurones électroporés, maintenant un niveau constant d’expression génique. Il est important de viser 3 à 5 % des neurones électroporés dans les tests de survie.

Le fait d’avoir un étiquetage clairsemé facilite essentiellement l’automatisation de l’analyse d’images car les cellules sont bien séparées et facilement distinguables. Notamment, ce paradigme expérimental peut être adapté pour tester plusieurs gènes d’intérêt en co-cultivant simultanément des neurones co-électroporés avec différents marqueurs fluorescents cytosoliques (par exemple, protéine fluorescente cyan, protéine fluorescente rouge (RFP), protéine fluorescente verte (GFP)) dans le même puits. À l’instar d’autres tests de cytotoxicité (par exemple, l’iodure de propidium ou la lactate déshydrogénase), le test décrit ici est basé sur le fait que la mort neuronale s’accompagne d’une rupture de la membrane cellulaire. Cela provoque la libération de protéines cytosoliques par diffusion et, par conséquent, la perte de fluorescence de la GFP.

Un modèle in vitro de l’AVC, à savoir le modèle OGD, est présenté comme un exemple de neurotoxicité ^7,8,9. Ce protocole consiste à exposer les neurones primaires à un tampon salin similaire à un liquide céphalo-rachidien artificiel mais privé d’oxygène et de glucose. Bien que ce modèle ait été présenté comme un exemple de stress neurotoxique, différentes conditions cytotoxiques peuvent être testées avec le même flux de travail ^8,9. Enfin, l’étiquetage clairsemé permet facilement le développement d’analyses d’imagerie automatisées. Ici, un protocole basé sur l’immunofluorescence standard et l’analyse ImageJ dans une configuration plus petite. Ensuite, ce flux de travail a été adapté et mis à l’échelle à l’aide d’un système d’imagerie cellulaire qui permet une analyse automatisée en imagerie en direct en modes moyen et haut débit. En conclusion, cet article présente une méthodologie flexible, abordable et évolutive pour étudier la survie neuronale dans différents modèles expérimentaux de toxicité en utilisant l’imagerie en direct et la quantification automatisée.

Protocole

Toutes les procédures utilisant des animaux doivent être supervisées par le comité de bioéthique animale de l’institut et effectuées conformément aux réglementations locales. Les procédures présentées ici ont été approuvées par l’autorité déléguée et sont conformes à la réglementation en vigueur en Espagne et en Europe.

1. Culture neuronale primaire

REMARQUE : Toutes les étapes sont effectuées à l’intérieur de la hotte de culture, en utilisant des matériaux et des solutions stériles pour maintenir des conditions de stérilité.

1. Revêtement en poly-L-lysine (PLL)
   1. Lavez les lamelles (CV, 15 mm) dans de l’éthanol à 70 % pendant la nuit (o/n) dans un agitateur orbital.
      REMARQUE : La vitesse de l’agitateur orbital doit être suffisante pour déplacer le CV doucement mais pas trop vite pour éviter d’endommager ou de rayer les CV. Le régime spécifique variera en fonction du modèle de l’agitateur. Les CV peuvent être stockés dans de l’éthanol pendant de longues périodes (mois).
   2. Retirez l’éthanol et lavez-le deux fois à l’eau déminéralisée pendant 10 minutes chacun.
   3. Laissez sécher les CV à température ambiante (RT) dans une boîte de Pétri de 100 mm (environ 13 CV/plaque). Assurez-vous que les CV ne se touchent pas ou ne touchent pas les bords de la plaque.
      REMARQUE : Les CV secs peuvent être stockés chez RT pendant de longues périodes (mois).
   4. Préparez la solution mère de PLL à 5 mg/mL dans de l’eau, faites des aliquotes et conservez-les à -20 °C. Diluer la solution mère dans 1x PBS à une concentration de travail de 0,1 mg/mL.
      REMARQUE : Des concentrations plus élevées allant jusqu’à 1 mg/mL de PLL peuvent être testées.
   5. Ajouter le volume minimal de PLL pour couvrir la surface des CV (voir les volumes optimaux de PLL dans le tableau 1). Ajouter la solution PLL goutte à goutte pour faciliter la formation d’une gouttelette.
      REMARQUE : Le placage des neurones sur les CV est nécessaire pour l’immunofluorescence. Pour l’imagerie en accéléré (par exemple, pour la cellule IN), les cellules sont plaquées directement au-dessus du puits sans CV, car les CV peuvent se déplacer pendant le laps de temps. Dans ce cas, ajoutez le volume minimal de PLL pour couvrir la surface de chaque puits.

Surface	Volume de l’ELP (mL)
Lamelles de recouvrement 15 mm	0.2
Lamelles de recouvrement 13 mm	0.18
Plaque à 96 puits	0.07
Plaque à 24 puits	0.3
Plaque à 6 puits	2
Plaque de 60 mm	4.5

Tableau 1 : Volumes optimaux de poly-L-lysine en fonction de la surface.

6. Incuber pendant au moins 1 h à 37 °C.
   REMARQUE : La période d’incubation peut durer jusqu’à o/n.
7. Retirez la PLL des CV. Lavez les CV deux fois avec de l’eau déminéralisée pendant 10 minutes chacune. Laissez sécher les CV à RT.
   REMARQUE : La solution PLL peut être conservée à 4 °C pour une réutilisation (3 fois maximum).
8. Conservez les CV séchés dans une boîte de Pétri à 4 °C (jusqu’à 7 à 10 jours) ou placez-les à l’intérieur des puits avec un agent de placage (voir composition au tableau 2 et volumes de travail au tableau 3). Ajouter le milieu de placage directement dans les puits des plaques à 12 puits (tableau 3).
   REMARQUE : Les neurones sont très sensibles à la qualité du sérum bovin fœtal (FBS). Différents lots de FBS doivent être testés pour identifier le lot dans lequel les cellules semblent plus saines. Une fois qu’une bonne quantité de FBS est identifiée, il est recommandé d’en obtenir une grande quantité et de la stocker à -80 °C. Ce protocole pourrait être adapté à d’autres types de CV et de plaques (voir les différents volumes de travail dans le tableau 3).

Milieu de placage
MEM		42.5	Ml
10 % Sérum de Cheval ou FBS*		5	Ml
30 % de glucose (concentration finale de 0,6 %)		1	Ml
PS (pénicilline, 10000 U/mL ; streptomycine, 10 mg/mL) ;		0.5	Ml
Milieu d’électroporation
Opti-MEM
Milieu neuronal
Milieu neurobasal		48.5	Ml
B-27		1	Ml
Glutamax 200 mM		0.125	Ml
PS (pénicilline, 10000 U/mL ; streptomycine, 10 mg/mL) ;		0.5	Ml
Milieu OGD (Tasca et al., 2014)
CaCl2		1	mm
Kcl		5	mm
NaCl		137	mm
KH2PO4		0.4	mm
Na2HPO4		0.3	mm
MgCl2		0.5	mm
MgSO4		0.4	mm
HEPES		25	mm
NaHCO3		4	mm

Tableau 2 : Composition des différents supports utilisés.

Surface des puits et des plaques			Volume de travail
Plaque à 96 puits	0.32	cm2	0.1	Ml
Plaque à 24 puits	1.9	cm2	0.5	Ml
Plaque à 12 puits	3.8	cm2	1	Ml
Plaque à 6 puits	9.5	cm2	2.5	Ml
Plaque de 60 mm	21.5	cm2	6	Ml

Tableau 3 : Superficie des différents types de plaques et volumes de travail.

2. Préparation de la culture neuronale
   1. Préchauffer (37 °C) et équilibrer (dans une atmosphère à 5 % de CO₂ ) le milieu de placage, le milieu neuronal et le milieu d’électroporation (voir composition dans le tableau 2) dans un flacon partiellement ouvert à l’intérieur de l’incubateur cellulaire pendant au moins 2 h. Laissez la trypsine se réchauffer à RT. Préchauffez la 1x solution saline équilibrée de Hank (HBSS) à 37 °C dans un bain-marie.
   2. Préréglez les paramètres d’électroporation (Tableau 4).

CONDITIONS D’ÉLECTROPORATION : Impulsion de pores
Longueur	V	Intervalle	N	D. Taux	Polarité
2 ms	175	50	2	10	plus
CONDITIONS D’ÉLECTROPORATION : Impulsion de transfert
Longueur	V	Intervalle	N	D. Taux	Polarité
50	20	50	5	40	plus/moins

Tableau 4 : Réglages d’électroporation pour NEPA21.

3. Dissection cérébrale et prélèvement de CD-1 souris à E15 post-coït
   1. Sacrifier la femelle enceinte par luxation cervicale sans sédation. Stérilisez le ventre avec de l’éthanol à 70 %; Coupez et ouvrez l’abdomen avec des ciseaux bien aiguisés.
   2. Extrayez l’utérus et placez-le dans une boîte de Pétri avec froid 1x HBSS. Laissez-le sur de la glace à l’intérieur du capot de culture cellulaire avec une pince ordinaire.
   3. Extrayez un embryon de l’utérus à l’aide de pinces et de ciseaux et décapitez-le d’une seule coupure à l’aide de ciseaux.
   4. Tenez la tête et introduisez des pinces (p. ex. pinces fines Dumont) dans l’orbite de l’œil.
   5. À l’aide de l’aiguille (seringue à aiguille de 30 G) comme lame, coupez le bregma et percez la partie postérieure de la tête.
   6. Introduisez une pince tranchante à travers l’incision verticalement dans le bregma et brisez la fine couche de peau de la région antérieure. Tirez sur la pince pour suivre la fissure longitudinale entre les deux hémisphères sans endommager le cortex.
   7. Utilisez la petite pince à un angle de 45°, de la partie antérieure à la partie postérieure, pour retirer le cerveau de la tête.
   8. Déplacez le cerveau dans une boîte de Pétri de 3,5 cm avec un HBSS 1x glacé sous un stéréomicroscope.
4. Dissection des cortex
   REMARQUE : Le protocole de culture neuronale est adapté de la procédure décrite par Dotti et Banker¹⁰.
   1. À l’aide de la pince de Dumont (11 cm) pour tenir le thalamus et d’une aiguille inclinée à un angle de 45° pour séparer le cortex de chaque hémisphère du mésencéphale. S’assurer que le cortex ne présente pas de traces d’autres tissus ; Utilisez des pinces tranchantes pour enlever les méninges.
      REMARQUE : Les méninges forment une fine membrane élastique enveloppant le cerveau et sont facilement reconnaissables à leur couleur rouge. Faire des mouvements doux en zigzag aidera à éliminer les méninges. Assurez-vous que toutes les méninges ont été enlevées car elles sont toxiques pour la culture.
   2. Déplacez le cortex propre dans une boîte de Pétri propre de 3,5 cm avec un HBSS 1x glacé et placez-le sur de la glace.
5. Ventilation
   1. Coupez chaque cortex en deux moitiés et utilisez une pince ou une aiguille pointue (30 G) pour faciliter l’effet de la trypsine à l’étape suivante.
   2. Transférez les morceaux dans 7 mL de tampon trypsine-EDTA à température ambiante dans un tube de 15 mL à l’aide d’une pipette P1000 (coupez 3-4 mm de l’embout). Attendez qu’ils coulent au fond de l’embout avant de les libérer de l’embout de la pipette. Mélanger en inclinant.
   3. Incuber à 37 °C pendant 12 min au bain-marie. Mélanger en inclinant toutes les 4-5 min.
      REMARQUE : Le temps d’incubation peut varier de 12 à 15 min.
   4. Laissez le tissu couler par gravité et retirez soigneusement la trypsine. Lavez le mouchoir deux fois avec 8 mL de 1x HBSS et agitez doucement en l’inclinant. Retirez soigneusement le 1x HBSS à l’aide d’une pipette P1000 mais à l’aide d’une pointe de pipette non coupée.
   5. Lavez le mouchoir une fois avec 5 ml de milieu de placage. Agiter en inclinant. Retirez le milieu de placage avec précaution à l’aide d’une pipette P1000.
   6. Ajouter 1,5 mL de milieu de placage. Désagréger mécaniquement le mélange à l’aide d’une pipette P1000 en aspirant le fluide par le bas du tube et en le relâchant doucement sur les parois pendant un maximum de 8 à 12 fois.
   7. Filtrer à travers une crépine à cellules stériles (70 μm) placée sur un tube de 50 mL. Ajouter 10 ml ou tout autre volume désiré de milieu de placage dans le tube.
   8. Introduisez 5 μL de suspension cellulaire dans la chambre de comptage des cellules, ajoutez 5 μL de bleu trypan (0,4 % p/v) et comptez les cellules.
   9. Plaquez les cellules (voir section 1.6) en transférant un volume adéquat de la suspension cellulaire pour avoir le nombre désiré de cellules pour l’électroporation (par exemple, 10⁶ cellules) dans un tube à centrifuger de 15 ml. Centrifuger les cellules à 250 × g pendant 5 min. Passez à la section 1.6.
6. Cellules de placage
   1. Plaquez la densité souhaitée de la suspension cellulaire non centrifugée de l’étape 1.5.7 dans chaque puits contenant le milieu de placage.
      REMARQUE : Dans ce protocole, 100 000 à 200 000 cellules/puits ont été ensemencées dans une plaque à 12 puits. À titre de référence, il faut prévoir au moins 3 CV par condition expérimentale pour tenir compte de la variabilité expérimentale. Un cadre expérimental typique peut impliquer l’imagerie de 4 à 5 champs par CV (par exemple, en utilisant un objectif 20x, chaque champ devrait avoir une largeur de ~1,3 mm² ).
   2. Déplacez la plaque dans le capot de culture cellulaire dans toutes les directions cardinales pour répartir uniformément les cellules.
7. Électroporation
   REMARQUE : D’autres systèmes de transfection peuvent être utilisés. Le système NEPA21 utilisé dans ce protocole a l’avantage d’être un « système ouvert ». Le protocole peut être modifié par l’utilisateur, et il ne nécessite pas de réactifs spécifiques pour la transfection des cuvettes spéciales utilisées pour l’électroporation. Ce protocole a été modifié de ⁵.
   1. Continuez à partir de l’étape 1.5.9. Remettre en suspension la pastille de cellule avec 5 mL de milieu d’électroporation dans un tube de 15 mL. Centrifuger le tube à 250 × g pendant 5 min.
   2. Répétez l’étape 1.7.1. Remettre en suspension avec un milieu d’électroporation pour obtenir une concentration de 10^{à 6} cellules/mL dans chacune des cuvettes d’électroporation. Mélangez les cellules avec la quantité souhaitée d’ADN dans la cuvette.
      REMARQUE : Pour l’expression de la GFP, 3 μg de plasmide ont été utilisés par million de cellules. En raison de la grande variabilité, il est recommandé de tester la concentration optimale pour chaque plasmide. Entre 2 et 24 μg de plasmide par million de cellules ont été testés. Divers plasmides peuvent être combinés dans la même cuvette pour effectuer une double transfection. Dans le cas de la co-transfection, transfectez le gène d’intérêt en excès par rapport à la GFP (par exemple, 3:1 est un rapport optimal qui doit être testé) pour s’assurer que la plupart des cellules exprimant la GFP co-expriment le gène d’intérêt.
   3. Placez la cuvette dans la chambre de la cuvette (Figure 2). Appuyez sur le bouton Start pour exécuter le programme prédéfini (voir les conditions d’électroporation dans le Tableau 4). Enregistrez les valeurs des courants et des joules affichées dans le cadre Mesures .
      REMARQUE : L’utilisateur peut modifier des conditions spécifiques. Par exemple, la diminution de la tension peut réduire l’efficacité de la transfection mais augmenter la survie neuronale.
   4. Sortez la cuvette de la chambre. Ajouter 500 μL de produit de placage dans la cuvette immédiatement après l’électroporation et transférer l’échantillon de la cuvette dans un tube à centrifuger de 1,5 mL à l’aide d’une pipette.
      REMARQUE : Plus l’ajout de milieu est rapide, meilleure est la survie après l’électroporation, car cela permet d’éviter les dommages cellulaires.
   5. Plaquez le nombre souhaité de cellules électroporées dans chaque puits.
      REMARQUE : Plaque de 20 000 à 100 000 cellules dans une plaque à 12 puits. Selon les conditions, seulement 5 à 10 % des cellules électroporées peuvent survivre. Le nombre exact doit être testé et adapté par l’utilisateur.
   6. Incuber pendant 2 à 4 h dans des conditions standard (37 °C, 5 % CO₂, humidité saturée).
      REMARQUE : Après la période d’incubation, observez les cellules au microscope. Si la culture est saine, la plupart des cellules auraient adhéré à la surface et auraient commencé à faire germer des extensions de neurites visibles.
   7. Changer le milieu de placage en milieu neuronal (volumes et composition dans le tableau 1 et le tableau 2, respectivement).
8. Entretien des cellules
   1. Pour rafraîchir le milieu, retirez la moitié du milieu et ajoutez un volume égal de milieu frais pré-équilibré après 7 jours de culture.
   2. Au 10e jour de la culture, remplacer la moitié du volume par un milieu neuronal frais sans supplément de glutamine (voir le tableau des matériaux). Répétez cette étape tous les deux jours après le 10e jour.
      REMARQUE : Après 10 jours de culture, les cellules produisent du glutamate par elles-mêmes.

2. Construction de la chambre hypoxique

1. À cet effet, utilisez n’importe quel récipient hermétique doté d’un couvercle à vis ou d’un système de fermeture équivalent (Figure 3A). Percez deux trous dans la paroi du récipient en plastique et introduisez un tube en plastique dans chacun d’eux. Scellez-les avec du silicone de manière à ce que le récipient soit hermétiquement fermé (Figure 3).
   REMARQUE : Ici, un récipient cylindrique en plastique (taille 1 litre) avec un couvercle à vis a été utilisé pour construire la chambre. Assurez-vous que le conteneur est suffisamment grand pour accueillir les CV nécessaires à l’expérience. Pour traiter plus de CV dans le même espace, les plates-formes en plastique peuvent être empilées les unes sur les autres (Figure 3A).
2. Pour préparer la chambre de bouillonnement (voir 3.2), percez un trou dans le capuchon d’un flacon, à l’aide de n’importe quelle perceuse mécanique standard avec une perceuse légèrement plus petite que le tube, et introduisez un tube en plastique à travers le trou dans le flacon. Scellez le trou avec du parafilm pour maintenir l’étanchéité (Figure 3B).
3. Stérilisez le récipient et le flacon avec de l’éthanol à 70 % et irradiez avec de la lumière ultraviolette pendant un cycle avant de les utiliser.

3. Privation d’oxygène-glucose (OGD)

REMARQUE : Le protocole pour les autres ministères est adapté de Tasca et ^al.7

1. Préparez la solution d’OGD avec une solution de phosphate (tableau 2) qui a déjà été complétée par des antibiotiques.
   REMARQUE : Pour chaque plaque de 35 mm, utilisez 5 ml ; pour une plaque de 100 mm, utilisez 10 ml.
2. Ajouter la solution d’OGD à l’intérieur de la chambre de bouillonnement (figure 3B) et la placer dans un bain-marie (déjà préchauffé à 37 °C). Raccorder le ballon à la source d’azote (N₂, 100 %).
   REMARQUE : Veuillez noter que, comme la solution d’autres ministères contient HEPES comme tampon, elle n’a pas besoin de CO₂. Si la solution d’autres d’hydrocarbures est basée sur un système tampon de bicarbonate, utiliser 5 % de CO₂ et 95 % de N₂ pour saturer la solution hypoxique et la chambre.
3. Saturez la solution d’OGD avec de l’azote qui bouillonne doucement. Laissez la solution dans un état légèrement bouillonnant pendant 20-30 min.
4. Transférez immédiatement le ballon dans le capuchon de culture cellulaire et ajoutez 5 mL de solution d’OGD sans oxygène en plaques de 35 mm ou 10 mL en plaques de culture de 100 mm.
5. Déplacer les CV avec les cellules cultivées vers les plaques avec les autres parties. Sans couvrir les plaques, déplacez-les dans la chambre d’hypoxie et fermez-les fermement mais soigneusement.
   REMARQUE : Les étapes 3.4 et 3.5 doivent être terminées le plus rapidement possible. Maintenir les CV de contrôle (Milieu Neuronal en normoxie) dans les plaques de puits à l’intérieur de l’incubateur. Alternativement, exposez les neurones témoins au milieu normoxique OGD complété par du glucose (10 mM) pour examiner les effets de l’hypoxie et de la privation de glucose de manière plus sélective.
6. Connectez le système d’azote à la chambre d’hypoxie et vérifiez que les tubes sont ouverts. Saturer la chambre de N₂ pendant quelques minutes à une pression de 2 à 3 bars (p. ex., 2 à 3 min ; 1 bar = 750 mmHg) (figure 3C).
   REMARQUE : N’oubliez pas de faire bouillir de nouveau la solution d’un autre ministère pendant 15 minutes entre plusieurs points temporels.
7. Réduire la pression de l’azote à 1,3-1,5 bar et fermer les deux tubes de la chambre d’hypoxie (Figure 3C). Laissez la chambre dans l’incubateur pendant la durée requise (par exemple, 60 min) à 37 °C, 5 % de CO₂.
   REMARQUE : La durée des autres ministères peut nécessiter des ajustements en fonction des conditions expérimentales et des objectifs de la recherche. Une courte période d’incubation (p. ex., 30 min) simulerait une hypoxie légère. Deux heures d’OGD sont généralement très dures envers les neurones. Il est recommandé de tester une durée de 45 à 90 minutes avant de commencer l’étude. Bien sûr, la durée de l’OGD aura une incidence sur la survie totale et le début relatif de la mort neuronale après la guérison d’un OGD. Si l’objectif est d’analyser la mort neuronale en temps réel, visez à obtenir des conditions d’OGD qui provoqueraient la mort cellulaire quelques heures après la récupération d’OGD pour une analyse plus efficace.
8. Ouvrez la chambre et déplacez les CV vers leur plaque multipuits d’origine pour la récupération. Après cette étape, envisagez deux alternatives : 1) pour les expériences à petite échelle, passez à la section 4 pour l’immunofluorescence et l’analyse d’images ; 2) Pour le criblage à haut contenu, passez à la section 5 pour l’analyse dans l’analyseur de cellules (ou une plate-forme équivalente).
   REMARQUE : L’imagerie en direct offre une approche plus flexible car elle permet un suivi en temps réel des différents points expérimentaux.

4. Analyse par immunofluorescence standard et ImageJ

REMARQUE : Le temps de récupération peut varier de 1 à 24 h selon les conditions.

1. Lavez les neurones avec 1x PBS pendant 10 min.
   REMARQUE : Cette étape est facultative car il existe plusieurs façons de procéder et d’analyser les images.
2. Fixez les neurones avec 4 % de paraformaldéhyde pendant 10 min à RT. Lavez-les trois fois avec 1x PBS pendant 10 min à chaque lavage.
   REMARQUE : Comme le paraformaldéhyde est toxique, travaillez sous une hotte chimique.
3. Perméabiliser les neurones en ajoutant 1x PBS contenant 0,1 % de Triton X-100 pendant 10 min. Lavez rapidement les cellules avec 1x PBS. Répétez l’étape de lavage deux fois pendant 10 minutes à chaque lavage.
4. Ajouter 350 μL de solution bloquante (1x PBS contenant 2 % d’albumine sérique bovine) aux CV et les laisser pendant au moins 30 min. Faites tourner la matrice d’anticorps primaires (AB) (5 × g pendant 30 s) et mélangez-la avec la solution bloquante à la dilution requise, par exemple anti-GFP à 1:600.
   1. Transférez les lamelles sur le parafilm dans une chambre humidifiée (une boîte avec un tissu imbibé d’eau pour maintenir l’humidité et éviter l’évaporation). Selon la taille des CV, ajoutez soigneusement 60 ou 80 μL de dilution de l’anticorps primaire à chaque CV et assurez-vous que les cellules sont en contact avec l’anticorps. Incuber les CV o/n à 4 °C.
      REMARQUE : Une gouttelette doit se former sur la surface CV pour couvrir toute la surface CV. Évitez de perturber les cellules lors du pipetage de la solution d’anticorps sur les CV. Le temps d’incubation pourrait être réduit à 2 h à RT.
5. Lavez les CV avec 1x PBS pendant 10 min sur le parafilm. Répétez l’étape de lavage deux fois.
6. Diluez l’AB secondaire, par exemple Alexa 488 (1:500) et le 4′,6-diamidino-2-phénylindole (DAPI, 1:2 000) dans une solution bloquante. Selon la taille des CV, ajoutez une gouttelette de 60 à 80 μL de la solution secondaire AB sur les cellules. Incuber les CV pendant 1 h dans l’obscurité à RT. Laver l’AB et le DAPI secondaires des neurones avec 1x PBS pendant 10 min et répéter cette étape deux fois.
7. Montez les CV dans un support de montage (voir le tableau des matériaux) pour l’analyse par immunofluorescence et stockez-les dans l’obscurité à 4 °C après séchage.
8. Capture et analyse d’images.
   REMARQUE : Un microscope inversé a été utilisé pour prendre les images à 20x (Figure 4A, voir le tableau des matériaux).
   1. Utilisez le logiciel open source ImageJ pour analyser les images et obtenir le masque pour le canal GFP (Figure 4C).
      REMARQUE : Il existe plusieurs façons d’imager et d’analyser les neurones, en fonction de la disponibilité de l’équipement et du format expérimental. Le flux de travail suivant est fourni à titre d’exemple de base dans lequel l’objectif est d’identifier le soma des neurones exprimant la GFP individuels présents dans l’image. Les valeurs spécifiques présentées ici, telles que la valeur seuil et la taille des particules, doivent être testées par l’utilisateur en fonction de ses conditions expérimentales spécifiques. De plus, différents filtres et étapes de traitement peuvent être ajoutés. Par exemple, les filtres ImageJ Soustraire l’arrière-plan et Désépater aident souvent à nettoyer l’image au début du traitement. L’optimisation du flux de travail pour des conditions expérimentales spécifiques nécessite une expérience préalable de l’analyse d’images et la connaissance des concepts de base de l’analyse quantitative d’images. Comme un guide approfondi sur l’analyse d’images n’entre pas dans le champ d’application du protocole actuel, nous recommandons les ressources suivantes : Guide de l’utilisateur ImageJ, https://imagej.nih.gov/ij/docs/guide/ ; pour des exemples et des tutoriels, https://imagej.nih.gov/ij/docs/examples/index.htm ; Ensemble MBF ImageJ, https://imagej.net/mbf/index.htm.
   2. Pour la segmentation, sélectionnez la segmentation de l’intensité avec les paramètres nécessaires pour isoler le soma, qui est la région la plus brillante des neurones. : Menu | Illustration | Ajuster | Seuil | Définir le seuil minimum (par exemple, 100) | cliquez sur Appliquer.
   3. Répétez le seuil à partir de 4.8.2. à toutes les images pour voir le masque (c’est-à-dire l’image segmentée) pour les somas des neurones (Figure 4E).
   4. Pour obtenir le nombre de cellules survivantes dans chaque image et exporter les résultats dans une feuille de calcul pour effectuer des calculs, sélectionnez Menu | Analyser | Analysez les particules et entrez les valeurs de paramètres nécessaires (par exemple, Taille : 50-pixel infini ; Circularité : 0,5-1,00). Considérons qu’à t = 0 h, le nombre de cellules comptées est le nombre total de cellules identifiées, et calculez le pourcentage de cellules qui ont survécu aux différents points temporels.
      REMARQUE : Un seuil de taille inférieur est utile pour filtrer les objets plus petits que le soma (par exemple, 60-80 μm²).
   5. Utilisez la fonction Enregistrer la macro d’ImageJ pour automatiser et répéter l’analyse : Menu | Plug-ins | Macros | Enregistrer | cliquez sur Créer pour générer la macro.

5. Analyse en temps réel avec IN Cell Analyzer 2200

1. Insérez la plaque à 12 puits dans l’analyseur de cellules, connectez le système de CO₂ et réglez la température à 37 °C.
   REMARQUE : Cette étape peut être facilement mise à l’échelle dans cette plate-forme, en effectuant une expérience similaire dans des neurones plaqués dans une plaque de 96 puits.
2. Sélectionnez l’objectif 20x, sélectionnez au hasard 5 champs par puits (couvrant 2,33 % du puits dans cet exemple) et concentrez-les automatiquement pour chaque canal de fluorescence (isothiocyanate de fluorescéine [FITC] dans ce cas). Sélectionnez les paramètres d’acquisition (30 min time-lapse pendant 16 h). Appuyez sur Démarrer et attendez.
   REMARQUE : Le nombre de champs d’imagerie doit être déterminé par l’enquêteur et doit être suffisant pour tenir compte de la variabilité à l’intérieur d’un seul puits.
3. Utilisez IN Cell Developertoolbox v1.9 pour configurer le flux de travail approprié pour l’analyse.
4. Analyser les images des neurones (canal FITC) pour générer un masque pour le soma des neurones (Figure 4).
   REMARQUE : L’objectif est d’identifier le soma des neurones individuels présents dans l’image. Cette analyse suit des étapes équivalentes à celles décrites dans la section 4 pour ImageJ. Reportez-vous à la section 4 pour connaître le flux de travail et les considérations générales. Le seuil d’intensité est déterminé pour sélectionner le soma, qui est la région la plus brillante des neurones.
   1. Pour la segmentation, sélectionnez la segmentation Intensité avec les paramètres nécessaires (dans ce cas, un seuil minimum de 20005,40).
   2. Pour le post-traitement, sélectionnez l’option Sieve , en conservant les cibles avec une surface supérieure à une valeur prédéterminée (ici, 189 pixels (~80 μm²)).
   3. Sélectionnez le paramètre Sum pour compter et additionner tous les neurones identifiés dans le masque (neurones survivants) pour chaque champ et pour tous les champs d’un puits à chaque point temporel du cours temporel.
   4. Exportez les résultats dans une feuille de calcul. À t = 0 h, considérons que le nombre de cellules comptées correspond au nombre total de cellules identifiées, et calculez le pourcentage de cellules qui ont survécu aux différents points temporels. Calculez le temps auquel 50 % des cellules sont mortes pour faciliter la comparaison entre les conditions.
      REMARQUE : Les paramètres des étapes de segmentation et de post-traitement doivent être ajustés par l’utilisateur pour différents canaux fluorescents en fonction des structures à identifier.

Résultats

Ce protocole vise à établir un modèle in vitro de l’AVC. Il est important d’obtenir une densité neuronale adéquate, qui permettra de reconnaître les neurones électroporés individuels pour les analyser individuellement. L’étape de la culture neuronale après le placage est également cruciale. La maturation des neurones en culture est progressive. La dépendance aux facteurs de croissance, à la croissance des neurites, à la connectivité et à l’activité électrophysiologique variera considérablement en fonction du sta...

Discussion

Ce protocole montre une manière efficace de modéliser un AVC in vitro. Pour atteindre cet objectif, nous avons proposé un marquage clairsemé des neurones corticaux à l’aide du système d’électroporation NEPA21⁵. Il s’agit d’un système ouvert qui permet la personnalisation du protocole avec un coût d’exploitation minimal par rapport à d’autres systèmes qui utilisent des kits ou des dispositifs spécifiques. La culture mixte de neurones naïfs et électroporés ...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Boîtes de Pétri de 10 cm	FISHER SCIENTIFIC, S.L.	1130-9283
Boîtes de Pétri 3,5 cm	Sterilin
75 cm2 Fiole	Corning	430641U
B-27	Life Technologies	17504-044
Plaques de culture cellulaire	Corning incorporation Costar® ;	3513
Incubateur de cellules	Thermo Electron Corporation	Modèle 371
Filtre de cellules 70 µ ; m	Falcon	352350
Cold lights	Schott	223488	KL 1500
Lamelles LCD (15 mm)	Marienfeld	111530
CU500 Chambre de cuvette	Nepa Gene
CU600 Support de support de cuvette	Nepa Gene
DAPI	Sigma-Aldrich Quimica, S. L.	D9542-10MG	1:2000
DMSO	Panreac	A3672
Dumont Pince Fine	FST	11254-20
Dumont Pince Fine	FST	11252-00
EC-002S NEPA Cuvettes d’électroporation, espace de 2mm	Nepa Gene
Filtre Filtre Strainer	Falcon	352350
Ciseaux fins-Sharp-Blunt	FST	14028-10
Ciseaux fins-ToughCut r	FST	14058-09
GFP poulet IgY	Aves Labs	GFP-1010	1:600
Glucose	Sigma	68769-100ml
GlutaMAX-I Supplément 200 mM 100 mL	Fisher Scientific	35050-061
HBSS	Thermofisher	14175-095	https://www.thermofisher.com/es/es/home/technical-resources/media-formulation.156.html
Hepes 1 M	ThermoFisher	15630-080
Sérum de cheval	Invitrogen	26050088
MEM	Thermofisher	11095080	https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/11095080#/11095080
Lame de microscope (polilysine)	VWR	631-0107	Dimension : 25 x 75 x 1 mm
Mowiol 4-88	Sigma-Aldrich Quimica, S. L.	81381-250G
Aiguilles jaunes, calibre 30	BD Microlance&trade ; 3	304000
NEPA21 électroporateur	Nepa Gene
Neubauer chambre	Blau Brand	717805
Neurobasal Medium	ThermoFisher	21103-49
Opti-MEM	Invitrogen	31985-062
Parafilm	Cole-Parmer	PM996
Paraformaldéhyde (PFA), 95 %	Sigma-Aldrich Quimica, S. L.	158127-500G	Utiliser la solution : 4 %
PEI	Polysciences	23966-1
Plasmide pour GFP			pCMV-GFP-ires-Cre, décrit dans Fazzari et al., Nature, 2010
Poly-L-Lysine	SIGMA	P2636
PS ( Pénicilline, Streptomycine)	ThermoFisher	15140122
Pince à denteler	FST	11152-10
Stéréomicroscope	WORLD PRECISION INSTRUMENTS
Seringues	BD Plastipak 1ml	303176
Triton X-100	Sigma-Aldrich Quimica, S. L.	Numéro MDL : MFCD00128254
Trypsine-EDTA	ThermoFisher	25300054
Tubes 15 mL	Fisher	05-539-4
Tubes 50 mL	VWR	21008-242
Tupperware	-		Tupperware hermétique avec couvercle à vis. SP Berner - Cône 1 L Redondo con Rosca. Tout Tupperware hermétique équivalent peut être acheté dans n’importe quel supermarché.
Bain-marie	SHELDON LABORATORY MODEL 1224	1641951

non ionique