Détection automatisée et à haut débit de l’adhérence bactérienne aux cellules hôtes

Résumé

La détection des interactions pathogènes hôte-bactérien basée sur l’adhérence phénotypique à l’aide de l’imagerie de marquage par fluorescence à haut débit ainsi que de méthodes d’analyse statistique automatisées permet une évaluation rapide des interactions bactériennes potentielles avec les cellules hôtes.

Résumé

L’identification des agents pathogènes bactériens émergents est essentielle à la santé et à la sécurité humaines. L’adhésion bactérienne aux cellules hôtes est une étape essentielle dans les infections bactériennes et constitue une marque de menace potentielle. Par conséquent, l’examen de l’adhérence des bactéries aux cellules hôtes peut être utilisé comme composante de l’évaluation de la menace bactérienne. Une méthode standard pour dénombrer l’adhérence bactérienne aux cellules hôtes consiste à co-incuber les bactéries avec les cellules hôtes, à récolter les bactéries adhérentes, à plaquer les cellules récoltées sur des milieux solides, puis à compter les unités formant des colonies (UFC) résultantes. Alternativement, l’adhérence bactérienne aux cellules hôtes peut être évaluée à l’aide d’approches basées sur la microscopie à immunofluorescence. Cependant, les stratégies conventionnelles de mise en œuvre de ces approches prennent beaucoup de temps et sont inefficaces. Ici, une méthode d’imagerie automatisée basée sur la microscopie à fluorescence récemment développée est décrite. Lorsqu’elle est combinée avec un traitement d’image à haut débit et une analyse statistique, la méthode permet une quantification rapide des bactéries qui adhèrent aux cellules hôtes. Deux espèces bactériennes, Pseudomonas aeruginosa à Gram négatif et Listeria monocytogenes à Gram positif et les témoins négatifs correspondants, ont été testées pour démontrer le protocole. Les résultats montrent que cette approche dénombre rapidement et avec précision les bactéries adhérentes et réduit considérablement les charges de travail et les délais expérimentaux.

Introduction

L’adhésion bactérienne est un processus par lequel les bactéries se fixent à d’autres cellules ou surfaces. L’établissement réussi de l’infection par des agents pathogènes bactériens nécessite l’adhésion aux cellules hôtes, la colonisation des tissus et, dans certains cas, l’invasion des cellules hôtes^1,2,3. Les maladies infectieuses émergentes constituent des menaces majeures pour la santé publique, comme en témoigne la récente pandémie de^{COVID-19 4,5,6}. Il est important de noter que les agents pathogènes nouveaux ou émergents peuvent ne pas être facilement discernés à l’aide d’approches génomiques, en particulier dans les cas où l’agent pathogène a été conçu pour échapper à la détection ou ne contient pas de signatures génomiques qui l’identifient comme pathogène. Par conséquent, l’identification d’agents pathogènes potentiels à l’aide de méthodes qui évaluent directement les caractéristiques de la pathogénicité, comme l’adhérence bactérienne aux cellules hôtes, peut jouer un rôle essentiel dans l’identification des agents pathogènes.

L’adhérence bactérienne aux cellules hôtes a été utilisée pour évaluer les mécanismes de pathogenèse bactérienne pendant les décennies^1,7. L’imagerie microscopique^8,9 et le dénombrement de l’unité de formation de colonies bactériennes (UFC)^10,11,12,13 par placage post-infection sont deux méthodes de laboratoire bien développées pour tester l’adhérence microbienne et / ou l’infection des cellules hôtes¹⁴. Compte tenu de la taille micrométrique des cellules bactériennes, le dénombrement des cellules bactériennes adhérentes nécessite généralement l’utilisation de techniques avancées de microscopie à fort grossissement, ainsi que d’approches d’imagerie à haute résolution, y compris la microscopie électronique, la microscopie à expansion (ExM)^15,16et l’imagerie tridimensionnelle¹⁷ . Alternativement, le dénombrement des bactéries liées ou internalisées dans les cellules hôtes peut être effectué en plaquant la série de dilution des bactéries récoltées sur une gélose solide et en comptant les UFC résultantes^10,12,13. Cette méthode est laborieuse et comprend de nombreuses étapes manuelles, ce qui introduit des difficultés dans l’établissement d’une procédure standardisée ou automatisée requise pour les analyses à haut débit^18,19. Par conséquent, l’élaboration de nouvelles méthodes d’évaluation de l’attachement des cellules hôtes permettrait de remédier aux limites actuelles dans le domaine.

Une telle méthode est décrite ici qui utilise la microscopie automatisée à haut débit, combinée au traitement d’images à haut débit et à l’analyse statistique. Pour démontrer l’approche, des expériences avec plusieurs agents pathogènes bactériens ont été effectuées, y compris Pseudomonas aeruginosa, un pathogène bactérien opportuniste à Gram négatif des humains, des animaux et des plantes^14,20, qui colonise fréquemment les voies respiratoires de patients présentant des fonctions de défense de l’hôte altérées. Cette approche a optimisé le processus d’imagerie microscopique décrit dans les études précédentes^14,20. La détection par imagerie a été simplifiée par des cellules hôtes et des bactéries marquées par fluorescence pour suivre rapidement leur proximité, ce qui a considérablement réduit la charge de travail de microscopie pour obtenir des images haute résolution permettant de distinguer les bactéries. En outre, l’analyse statistique automatisée des images dans le comptage des cellules hôtes et des bactéries a remplacé l’expérience pratique du placage bactérien CFU pour estimer le rapport du nombre de bactéries adhérentes par cellule hôte. Pour confirmer la compatibilité de cette méthode, plusieurs souches bactériennes et types de cellules hôtes ont également été testés, comme Listeria monocytogenes, Staphylococcus aureus, Bacillus cereus et Klebsiella pneumoniae, ainsi que des cellules endothéliales de la veine ombilicale humaine (HUVEC), et les résultats soutiennent la diversité et l’efficacité de la méthode.

Protocole

1. Culture cellulaire A549

1. Maintenir la lignée cellulaire A549 en milieu F-12K complété par 10% de sérum fœtal bovin (FBS) et incuber à 37 °C, 5% de CO_2.
2. Changez le milieu tous les 3-4 jours et passez à 85% -95% de confluence.
3. Rincez brièvement les cellules avec 1 solution saline tamponnée au phosphate (PBS, pH 7,4, sauf indication contraire) et traiter avec 1 ml de solution d’acide éthylènediaminetétraacétique (EDTA) à 0,25 % de trypsine-0,53 mM (EDTA) (immersion de la couche cellulaire) pendant environ 2 min à 37 °C.
4. Ajouter 6 mL supplémentaires de milieu de croissance complet (milieu F-12K + 10% FBS) pour arrêter l’activité de la protéase. Ensuite, plaquez les cellules dans une fiole de culture tissulaire stérile en polystyrène T-75 à un rapport de sous-culture de 1:3-1:8. Le volume final de la culture est de 12 mL.
5. Ensemencez environ 1 x^{10 4} cellules A549 (concentration cellulaire : ~1 x 10⁵ cellules/mL) sur chaque puits d’une plaque de 96 puits un jour avant les essais d’observance.

2. Croissance bactérienne et coloration

1. Effectuer tous les travaux bactériens dans une armoire de biosécurité, laboratoire de niveau de biosécurité 2.
2. Inoculer toutes les cultures bactériennes, y compris P. aeruginosa (PAO1), Escherichia. coli , L. monocytogenes et B. subtilis, etc., à partir du bouillon de glycérol congelé et les cultiver dans un bouillon de soja tryptique (TSB, 3 mL) dans un incubateur à agitation à 37 ° C pendant la nuit maintenu à 250 tr / min.
3. Le lendemain, utilisez une dilution de 1:100 de la culture de nuit pour inoculer une sous-culture et cultivez-les dans le BST (1 mL) pendant 3 h jusqu’à la phase exponentielle, mesurez la DO à 600 nm (OD₆₀₀₎pour confirmer. Assurez-vous que l’OD₆₀₀ se situe entre 0,4 et 0,6.
4. Avant d’effectuer le test d’adhérence bactérie-hôte, les dilutions en série sur plaque de suspension bactérienne sur des plaques de gélose TSB, les incubent pendant la nuit à 37 ° C, puis établissent les UFC bactériens à partir du nombre de colonies. Pour P. aeruginosa, une OD₆₀₀ de 1,0 correspond à 2 x 10⁸ cellules bactériennes viables/mL, et pour L. monocytogenes, une OD₆₀₀ de 1,0 correspond à 9 x 10⁸ cellules bactériennes viables/mL.
5. Récolter les cultures bactériennes en phase exponentielle par centrifugation à 13 000 x g pendant 2 min à température ambiante (RT), puis les laver une fois à l’aide de 1x PBS (1 mL). Remettre en suspension les granulés bactériens dans 1 mL de 1x PBS et déterminer les concentrations en mesurant l’OD₆₀₀ des suspensions bactériennes. Par exemple, P. aeruginosa avec OD₆₀₀ de 0,5 représente une concentration de 1 x 10⁸ cellules bactériennes/mL.
6. Tacher la suspension bactérienne à l’aide d’un colorant fluorescent vert ou rouge à RT pendant 30 min avec une rotation douce dans l’obscurité. Pour cela, ajoutez 2 μL du colorant de coloration concentré 500 fois dans 1 mL de suspension bactérienne pour diluer le colorant 1 fois. Pour éliminer le colorant de coloration, centrifugez les bactéries colorées à 13 000 x g pendant 2 min et remettez la pastille dans 1 mL de 1x PBS pendant trois fois.
   REMARQUE: Si des bactéries marquées par fluorescence (GFP-, RFP-, mCherry-, etc.) sont utilisées dans l’expérience, sautez cette étape de coloration bactérienne. P. aeruginosa marqué gFP et L. monocytogenes colorés par colorant fluorescent rouge ont été utilisés dans ce protocole.
7. Prélever les cellules bactériennes colorées ou les bactéries marquées GFP par centrifugation à 13 000 x g pendant 2 min. Remettre en suspension dans un milieu F-12K frais (1 mL) et mesurer l’OD₆₀₀ de chaque culture. Diluer ultérieurement les cultures aux concentrations souhaitées en fonction de la multiplicité de l’infection (MOI) et de la concentration sur les cellules hôtes. Le volume final utilisé dans cette expérience est de 500 μL.
   REMARQUE: Par exemple, si la concentration de cellules hôtes comptée à l’aide de la coloration Trypan Blue est de 1 x^{10 5} cellules / mL, la concentration souhaitée de cellules bactériennes à un MOI de 100 sera de 1 x 10⁷ cellules / mL. La concentration de P. aeruginosa à 0,5 OD₆₀₀ est de 1 x 10⁸/mL. Pour obtenir la concentration souhaitée, diluer la culture de P. aeruginosa 10 fois, ajouter 50 μL de culture remise en suspension à 450 μL de milieu F-12K frais.

3. Adhérence bactérienne et coloration des cellules hôtes

1. Tout d’abord, lavez les monocouches cellulaires A549 ensemencées trois fois avec 1x PBS chaud. Pour chaque lavage, ajoutez 100 μL de 1x PBS à chaque puits, pipetez doucement de haut en bas trois fois, jetez 1x PBS ou attendez 10 s après l’ajout, puis passez l’aspirateur pour retirer 1x PBS. Pour déterminer la cinétique de l’association bactérienne, superposez les cellules avec 100 μL de concentrations souhaitées de suspension bactérienne avec différents ME (0, 1, 10 et 100). Faire tourner les bactéries à 200 x g pendant 10 min et incuber les cellules A549 infectées à 37 °C, 5 % de CO₂ pendant 1 h supplémentaire.
   REMARQUE: Dans cette expérience, chaque condition avait un triple technique.
2. Éliminez les bactéries non liées en lavant les monocouches cinq fois avec du PBS chaud 1x comme décrit ci-dessus. Ajouter 100 μL de formaldéhyde à 4 % (dans 1x PBS) dans chaque puits des plaques de 96 puits pour fixer les cellules. Laissez les plaques reposer sur de la glace pendant 15 minutes, puis lavez la solution de fixation à l’aide de 1x PBS trois fois.
3. Pour colorer les noyaux, ajouter 50 ng/mL de 4′,6-diamidino-2-phénylindole (DAPI) et l’incuber pendant 10 min à TA. Après l’incubation, lavez les puits trois fois à l’aide de 1x PBS. Couvrez les cellules A549 infectées avec 100 μL de 1x PBS pour éviter le dessèchement. Traitez pour l’étape suivante ou conservez la plaque à 4 °C jusqu’à 2 jours dans l’obscurité.

4. Imagerie, traitement et analyse automatisés par fluorescence

1. Pour maintenir l’intégrité des données, choisissez aléatoirement et manuellement cinq emplacements de chaque puits pour capturer les images à un grossissement de 20x. Capturez les images fluorescentes des cellules A549 et des bactéries sous les canaux DAPI et GFP, respectivement. Utilisez le canal PE-Cy5 pour les bactéries colorées par le colorant fluorescent rouge.
2. Pour avoir une meilleure résolution, traitez toutes les images pour l’aplatissement et la déconvolution de l’arrière-plan. Définissez les paramètres comme 68 μm de diamètre de la bille roulante pour le lissage et mesurez automatiquement la fonction d’étalement de points (PSF) de la déconvolution de l’image en fonction de l’objectif.
3. Pour compter toutes les cellules et bactéries qualifiées, mesurez l’intensité de fluorescence des cellules hôtes et des bactéries et définissez l’intensité de fluorescence la plus faible des cellules hôtes et des bactéries comme seuils pour le nombre de cellules. Comptez toutes les bactéries proches d’une cellule hôte à une distance de 15 μm, car les bactéries adhérentes ont un diamètre de la cellule A549 de 10,59 à 14,93 μm²¹.
   REMARQUE: Un paramètre par défaut dans le système d’imagerie compte sélectivement les cellules hôtes avec des diamètres allant de 5-100 μm et les bactéries allant de 0,2-5 μm en taille (largeur et longueur).
4. Sur la base des résultats de traitement manuel d’image mentionnés ci-dessus, appliquez les paramètres de lissage de l’image, de déconvolution, de taille des objets, de distance et d’intensité de fluorescence au reste des images automatisées. Après l’analyse automatisée, considérez les lectures critiques, telles que le nombre total de cellules hôtes, la taille et la forme des cellules, le nombre total de bactéries et le nombre moyen de bactéries par cellule hôte, qui était l’indicateur le plus important, pour déterminer l’adhérence bactérienne.
5. Exportation de données et analyse statistique
   1. Exportez les résultats analysés de toutes les images vers une feuille de calcul (par exemple, au format « xlsx »). Le système automatisé génère deux ensembles de résultats : 1) le nombre moyen de bactéries adhérentes à partir de chaque image ; 2) les données informatives de chaque cellule hôte, telles que le nombre de bactéries adhérentes sur une seule cellule, la taille de l’hôte et l’intensité moyenne de fluorescence de la cellule hôte et des bactéries, à partir de l’image correspondante.
   2. Calculer le nombre moyen et l’écart-type du nombre de bactéries adhérentes à partir de toutes les images pour représenter le niveau d’adhérence bactérienne par rapport aux témoins négatifs. Dans cette méthode, E. coli et B. subtilis ont servi de témoins négatifs pour tester l’observance bactérienne Gram négatif et Gram positif, respectivement. Effectuer des ANOVA bidirectionnels pour tester la variation significative entre les points de données à travers le traitement pour trois expériences indépendantes.

Résultats

Pour développer le test d’adhérence bactérienne basé sur l’imagerie par fluorescence, la souche PAO1 de P. aeruginosa et son homologue à adhérence négative E. coli ont été utilisés pour tester l’efficacité du protocole, car l’adhérence de ces bactéries aux cellules A549 avait été rapportée^14,20,22. Tout d’abord, P. aeruginosa (PAO1) et E. coli marqué GFP ont été co-incubés avec une lignée cell...

Discussion

Le protocole décrit une approche automatisée pour dénombrer l’attachement bactérien aux cellules hôtes. L’approche décrite présente plusieurs avantages intéressants par rapport aux méthodes conventionnelles. Tout d’abord, cette approche permet de quantifier avec précision le nombre de cellules pathogènes microbiennes attachées à des cellules hôtes individuelles. Il est important de noter que cette quantification peut être effectuée sans avoir besoin d’une récolte bactérienne laborieuse, de dilutions en série, d’un placag...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
10x PBS	VWR	45001-130
4&prime ;,6-diamidino-2-phénylindole (DAPI)	Thermo Fisher	62248	Colorant de coloration de la cellule hôte
96 plaque de puits	Corning	3882	Demi-puits de surface, fond plat
clair A549 cellules	ATCC  ;	CCL 185	Lignée cellulaire de mammifère
BactoView Live	Red Biotium	40101	Bactérie staning colorant
Centrifuge	Eppendorf	5810R
CFSE traqueur de division cellulaire	BioLegend	423801
Cytation 5  ;		BioTek Cytation 5  ;	Lecteur multimode d’imagerie cellulaire
E. coli			Stock de laboratoire  ;
EGM bulletKit	Lonza	CC-3124	HUVEC milieu de culture cellulaire
EHEC			NIST collections
F-12k medium	ATCC  ;	302004	milieu de culture cellulaire A549
Sérum fœtal bovin	Corning	35-016-CV
HUVEC			Stock de laboratoire  ;
L. monocytogenes			Collections NIST
OD600 DiluPhotometer	IMPLEN
P. aeruginosa			Dr. Lori Burrows stock de laboratoire
P. aeruginosa &Delta ; pilA			Dr. Lori Burrows stock de laboratoire
S. agalactiae			NIST collections
S. aureus	BEI	NR-46543
S. aureus &Delta ; saeR	BEI	NR-48164
S. rubidaea			Collections NIST
Bouillon de soja typique Growcells		MBPE-4040